TSP-1對小鼠皮膚放創(chuàng)復(fù)合傷傷口愈合的影響

南莎,柳隨義,冉永紅,趙雅貞,郝玉徽

（陸軍軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)系復(fù)合傷研究所，重慶 400038）

放創(chuàng)復(fù)合傷（combined radiation-wound injury，CRWI）是核事故以及核戰(zhàn)爭時所發(fā)生的主要傷類之一，與單純放射損傷相比，其發(fā)生率和病死率大大增加［1］。傷口愈合是一個復(fù)雜、相互協(xié)調(diào)的過程，可分為3個相互區(qū)分而又聯(lián)系的階段：炎癥反應(yīng)期、增殖修復(fù)期以及組織重塑期[2-4]。受電離輻射的影響，CRWI傷口部位的炎癥細胞和修復(fù)細胞數(shù)量減少、功能受損，傷口難以愈合，且機制復(fù)雜，需要我們不斷探索。

TSP-1是一種多功能胞外基質(zhì)蛋白，參與炎癥調(diào)控、血管生成等病理生理過程，在傷口修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用［5］。相關(guān)研究表明，與野生型（WT）小鼠相比，缺乏TSP-1會導(dǎo)致小鼠皮膚熱損傷傷口的愈合速度減緩[6]。也有研究發(fā)現(xiàn)，用TSP-1預(yù)處理人角膜內(nèi)皮細胞后，其分泌的外泌體可以有效促進角膜傷口愈合[7]，即TSP-1能夠促進傷口愈合。然而，一項應(yīng)用二甲雙胍治療二型糖尿病傷口的研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以通過降低傷口部位TSP-1的表達水平，加速二型糖尿病傷口愈合[8]，說明TSP-1對傷口愈合也有不利影響。以上研究結(jié)果表明TSP-1在不同的傷口模型中發(fā)揮的作用不同。

目前，TSP-1在CRWI愈合中的作用尚不明確。因此，本研究以TSP-1基因全敲除小鼠為主要研究對象，探討TSP-1在CRWI傷口愈合過程中的作用，以期為CRWI的救治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、DAB顯色液、DAPI、抗熒光淬滅封片劑、山羊抗兔IgG、小鼠基因型快速鑒定試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNAiso試劑、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBRII熒光定量PCR試劑均購自大連寶生物工程有限公司；檸檬酸修復(fù)液、封閉用山羊血清、SV超敏反應(yīng)兩步試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗多克隆F4/80、CD31、β-actin均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；NF-κB抗體購自美國Biolegend公司；α-SMA抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；RT-qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；熒光酶標(biāo)儀Bio-Ple 200 System、Realtime PCR儀、Chemidoc×RS成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗動物

本研究共使用C57BL/6J雄性小鼠（6周齡）30只，TSP-1KO組及WT組各15只。TSP-1KO小鼠來源于美國賽業(yè)生物科技有限公司，WT小鼠來源于陸軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK(渝)20170002。所有小鼠飼養(yǎng)在12 h明暗循環(huán)的實驗環(huán)境中，濕度維持在50%～60%，溫度保持在（24±0.5）℃。

1.3 建立小鼠皮膚CRWI模型

建立小鼠皮膚CRWI模型［9-10］。首先對小鼠進行5 Gy60Coγ全身輻照，劑量率為0.5～0.6 Gy/min。輻照后1 h內(nèi)，在小鼠背部皮膚制造傷口：用1%戊巴比妥鈉（0.15 mL）腹腔注射麻醉、備皮、局部消毒后，在每只小鼠背部胸段脊柱附近用打孔器切出圓形傷口，傷口直徑1 cm，深達皮下組織全層。手術(shù)后將小鼠放回籠子恢復(fù)，在傷口形成后的第0、1、3、7、10、14天觀察2組小鼠傷口愈合情況并拍照記錄。使用Image J對傷口面積進行定量分析，傷口閉合率=（A0-At）/A0×100%，A0表示第0天傷口部位的面積，At代表傷口形成后不同時間點傷口部位的面積。在傷口形成后第7天取小鼠傷口部位的皮膚組織，其中一半用4%中性甲醛固定，用于后續(xù)傷口組織HE染色、免疫組化染色及免疫熒光染色；另一半用液氮凍存，用于進一步的Western blot蛋白檢測及組織RNA表達檢測。

1.4 HE染色

取新鮮的傷口組織制作3.5 μm的石蠟組織切片，對石蠟切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色，用于觀察傷口的形態(tài)。

使用SV超敏反應(yīng)兩步試劑盒進行免疫組化染色：將石蠟切片脫蠟后，用檸檬酸鈉進行抗原修復(fù)，然后使用過氧化氫浸泡20 min。使用山羊血清封閉1 h后，用一抗F4/80（1：200）、CD31（1：200）于4 ℃孵育過夜。二抗孵育20 min，使用DAB對組織中目標(biāo)蛋白進行顯色，然后進行復(fù)染。目標(biāo)蛋白的表達使用Image J進行定量分析。

1.5 免疫熒光染色

將石蠟切片脫蠟后，用檸檬酸鈉進行抗原修復(fù)。然后使用山羊血清封閉1 h，加入一抗α-SMA（1：100），于4 ℃孵育過夜。熒光二抗避光孵育1 h后，使用DAPI對細胞核進行染色。最后使用熒光顯微鏡進行拍照觀察，并用Image J進行定量分析。

1.6 RT-qPCR

使用TRIzol?試劑提取傷口組織中總RNA，對各樣本RNA濃度進行測定并配平，使用PrimeScript? RT預(yù)混液將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。最后使用SYBR預(yù)混料Ex Taq?進行RT-qPCR。使用的引物序列見表1。

表1 用于RT-qPCR反應(yīng)的引物序列

1.7 Western blot檢測蛋白表達

在冰上使用RIPA裂解液裂解傷口組織獲得總蛋白。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各樣本組織蛋白濃度。調(diào)整上樣體積使每組上樣質(zhì)量為20 μg，加載到8%SDS-PAGE預(yù)制膠上進行電泳，而后使用0.45 μm PVDF膜進行電轉(zhuǎn)。使用5%脫脂奶粉封閉2 h，孵育一抗NF-κB（1：1 000）和β-actin（1：10 000）于4 °C冰箱過夜。室溫孵育二抗（1：5 000）1 h。最后進行顯影，并使用Image J進行定量分析。

1.8 敲除小鼠基因型鑒定

用消毒的剪刀剪取小鼠鼠尾0.5 cm備用。按照DNA Extraction Solution：Enzyme Mix=96：4的比例配置消化液，將配好的消化液加入離心管，每管100 μL。金屬浴55 ℃，15 min；95 ℃，5 min。消化完成后，向上述各樣品中加入100 μL的終止液，終止消化。而后進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系見表2。最后進行瓊脂糖凝膠電泳（130 V，30 min），結(jié)果使用Chemidoc×RS成像系統(tǒng)檢測。

表2 用于PCR的反應(yīng)體系

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 8進行統(tǒng)計學(xué)分析。連續(xù)性數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，兩個獨立樣本組之間的比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TSP-1基因敲除小鼠鑒定

本課題組成功引進并繁育了TSP-1基因全敲除小鼠。對繁育小鼠的基因型進行鑒定，TSP-1-/-小鼠基因組PCR產(chǎn)物電泳圖像只具有660 bp單一條帶，TSP-1+/-小鼠的電泳圖像具有660 bp和823 bp兩條條帶，TSP-1+/+小鼠的電泳圖像只具有823 bp單一條帶，見圖1。隨后，對敲除小鼠的出生、生長和繁殖情況進行觀察記錄，發(fā)現(xiàn)TSP-1KO小鼠能正常生長、繁育。

圖1 TSP-1KO小鼠基因型鑒定PCR電泳圖

2.2 敲除TSP-1小鼠皮膚CRWI的傷口愈合情況

根據(jù)傷口愈合的結(jié)果，從建模第3天開始TSP-1KO小鼠的皮膚CRWI傷口表現(xiàn)出顯著的愈合延遲（P＜0.05），見圖2a、b。在小鼠皮膚CRWI建模后的第7天，取2組傷口組織進行HE染色，結(jié)果表明，與WT小鼠相比，TSP-1KO小鼠具有較短的再上皮化距離（P＜0.05）；同時，TSP-1KO小鼠皮膚CRWI的傷口寬度和傷口面積均明顯較大（P＜0.05），見圖2c、d。以上結(jié)果表明，敲除TSP-1后，小鼠皮膚CRWI再上皮化速率減慢，傷口愈合延遲。

圖2 WT及TSP-1KO小鼠皮膚CRWI的傷口愈合情況

2.3 敲除TSP-1小鼠皮膚CRWI傷口部位的炎癥反應(yīng)情況

小鼠皮膚CRWI建模后的第7天，與WT小鼠相比，TSP-1KO小鼠傷口部位的F4/80陽性巨噬細胞明顯減少（P＜0.05），NF-кB蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖3a～d。RT-qPCR的結(jié)果表明，TSP-1KO小鼠的傷口部位IL-1β、IL-6 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.01），敲除TSP-1對小鼠皮膚CRWI傷口部位TNF-α mRNA表達水平影響不明顯（P＞0.05），見圖3e。以上結(jié)果表明，敲除TSP-1會使小鼠皮膚CRWI炎癥降到更低水平。

圖3 小鼠皮膚CRWI建模后第7天WT及TSP-1KO小鼠傷口部位的炎癥反應(yīng)情況

2.4 敲除TSP-1小鼠皮膚CRWI傷口部位的血管生成情況

免疫組化染色結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，TSP-1KO小鼠傷口部位CD31陽性細胞（新生成血管）表達顯著減少（P＜0.05），見圖4a、b。同時，與WT小鼠相比，TSP-1KO小鼠傷口部位α-SMA陽性細胞（成熟血管）表達也減少（P＜0.05），見圖4c、d。即敲除TSP-1會導(dǎo)致小鼠皮膚CRWI血管生成受到抑制。

3 討論

為了確定TSP-1在小鼠皮膚CRWI傷口愈合中的作用，我們培育了TSP-1基因全敲除小鼠，應(yīng)用TSP-1KO小鼠進行傷口愈合實驗，結(jié)果顯示，TSP-1KO小鼠皮膚CRWI的傷口部位巨噬細胞浸潤較少，NF-κB蛋白表達降低，炎癥細胞因子表達減少，并且血管生成也相應(yīng)減少。

TSP-1在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用，是單核細胞趨化性、巨噬細胞吞噬作用、調(diào)節(jié)T細胞功能、激活潛伏TGF-β1的重要介質(zhì)[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA抑制TSP-1表達可減少THP-1細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌，并且過表達TSP-1可上調(diào)THP-1細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的表達水平[12]。本研究中TSP-1KO小鼠皮膚CRWI傷口部位炎癥細胞因子表達降低，炎癥反應(yīng)減弱，與以上研究結(jié)果相同，即TSP-1在小鼠皮膚CRWI傷口愈合過程中發(fā)揮促炎作用。CRWI傷口部位炎癥反應(yīng)較輕[13]，將促炎因子TSP-1敲除，致使CRWI炎癥反應(yīng)進一步減輕，更加不利于小鼠皮膚CRWI傷口愈合。

大多數(shù)研究認(rèn)為，TSP-1是抑制血管生成最重要的蛋白之一[14-15]，而TSP-1KO小鼠皮膚CRWI傷口部位血管生成卻減少，可能是因為炎癥反應(yīng)在傷口愈合過程中發(fā)揮主導(dǎo)作用[16]，傷口愈合前期的炎癥反應(yīng)不足會影響愈合后期的細胞因子以及其他營養(yǎng)物質(zhì)的積累，使得TSP-1抑制血管生成的作用未能顯現(xiàn)。新生血管可以為傷口部位提供氧、營養(yǎng)和生物活性物質(zhì)，在傷口愈合過程中發(fā)揮不可替代的作用[17]。TSP-1KO小鼠的傷口部位血管生成減少，進一步導(dǎo)致小鼠皮膚CRWI傷口愈合延遲。

綜上所述，本研究探討了TSP-1在小鼠皮膚CRWI愈合中的作用，發(fā)現(xiàn)TSP-1是小鼠皮膚CRWI愈合過程中促進炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，并且在一定程度上有利于傷口部位的血管生成。上述結(jié)果為后續(xù)深入研究TSP-1在CRWI以及其他傷口模型中的作用機制奠定了基礎(chǔ)。