調(diào)節(jié)自噬對(duì)創(chuàng)傷性失血休克后血管功能障礙的影響

雷艷,彭小勇,陳魁君,程祥云,王建民,康建毅,李濤,劉良明,楊光明

（1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)陸軍衛(wèi)勤訓(xùn)練基地戰(zhàn)救技能訓(xùn)練教研室，重慶 400038；2.陸軍特色醫(yī)學(xué)中心野戰(zhàn)外科研究部/創(chuàng)傷燒傷與復(fù)合傷國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400042）

創(chuàng)傷是當(dāng)前威脅人類健康的重大疾患之一。創(chuàng)傷后失血休克是其最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，在戰(zhàn)傷和平時(shí)各類事故傷中的發(fā)生率和病死率均較高[1]。因此，深入研究創(chuàng)傷性失血休克（traumatic hemorrhagic shock,THS）的發(fā)病機(jī)制、尋找有效的治療靶點(diǎn)對(duì)提高創(chuàng)傷救治水平非常重要。血管低反應(yīng)性是嚴(yán)重創(chuàng)傷休克及多種臨床重癥均存在的一種血管舒縮功能障礙，是導(dǎo)致患者發(fā)生頑固性低血壓和重要器官組織灌注不足、甚至死亡的重要原因[2]。關(guān)于血管低反應(yīng)性的發(fā)生機(jī)制，近年來(lái)提出了血管平滑肌細(xì)胞膜受體失敏、細(xì)胞膜超極化及鈣失敏等機(jī)制，并且針對(duì)性地發(fā)現(xiàn)了一些有一定血管反應(yīng)性恢復(fù)作用的藥物[3-4]，但目前這些藥物的效果不太理想，需要進(jìn)一步探尋其發(fā)病機(jī)制并尋找更有效的治療靶點(diǎn)。

自噬是細(xì)胞對(duì)自身組分進(jìn)行降解和循環(huán)再利用的重要生物學(xué)過(guò)程，是細(xì)胞維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一種自我保護(hù)機(jī)制[5]。饑餓、缺血、應(yīng)激等都可能誘發(fā)自噬。研究表明，自噬與腫瘤、糖尿病、病毒感染、神經(jīng)退行性疾病及心肌病等多種疾病密切相關(guān)，調(diào)控自噬有可能為疾病的治療提供新的方向[6-7]。本研究小組近期發(fā)現(xiàn)，在THS后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血管組織及缺氧處理血管平滑肌細(xì)胞中自噬標(biāo)志物的蛋白水平發(fā)生了顯著變化[8]。但目前自噬在THS后血管功能障礙中的具體作用尚不清楚。故本研究建立THS大鼠模型，觀察自噬激動(dòng)劑雷帕霉素（rapamycin,RAPA）和其抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine,3-MA）對(duì)THS后血管反應(yīng)性的影響，并在整體動(dòng)物水平觀察給予RAPA對(duì)休克動(dòng)物血壓水平和重要器官血流灌注的影響，同時(shí)檢測(cè)了血管組織中自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3）和Beclin-1蛋白表達(dá)水平，以期為臨床THS的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、主要試劑及儀器

清潔級(jí)SD大鼠104只，體質(zhì)量180～220 g，由陸軍特色醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（軍）2017-0058。

RAPA（純度≥95%，批號(hào)：WXBC7891V）、3-MA（純度≥99%，批號(hào)：0000084747）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。乳酸林格氏液（lactated Ringer's,LR）購(gòu)自四川科倫藥業(yè)股份有限公司。兔源性LC3抗體和Beclin-1抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。小鼠源性β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。山羊抗兔和抗小鼠熒光二抗購(gòu)自美國(guó)Jackson公司。蛋白酶抑制劑片購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

PeriCam PSI ZR激光散斑血流測(cè)定儀（瑞典Perimed公司）；Power Lab離體器官灌流系統(tǒng)-八通道數(shù)據(jù)采集分析儀（瑞典AD Instrument公司）；雙色紅外激光成像系統(tǒng)（德國(guó)LI-COR公司）。

1.2 THS建模和分組

80只大鼠隨機(jī)分為10組（n=8）：對(duì)照組、休克組、休克+3-MA（1、2、4 mmol/L）組、休克+RAPA（0.1、1、2、10 μmol/L）組、休克+RAPA（1 μmol/L）+3-MA（2 mmol/L）組。采用本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法制備大鼠THS模型[3]：實(shí)驗(yàn)前12 h禁食、自由飲水。實(shí)驗(yàn)當(dāng)日，用30 mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，予以大鼠右側(cè)股骨骨折，左側(cè)股動(dòng)脈插管并連接水銀血壓計(jì)，通過(guò)放血使血壓降至30 mmHg，并維持2 h。模型完成后，開腹取腸系膜上動(dòng)脈并制備血管環(huán)，采用離體血管張力測(cè)定技術(shù)檢測(cè)血管反應(yīng)性[8]。將血管環(huán)懸掛于注有K-H液的離體器官浴槽中，平衡2 h后加入124 mmol/L的高鉀液誘導(dǎo)血管預(yù)收縮，然后更換K-H液再平衡30 min，再按照實(shí)驗(yàn)分組加藥孵育：3-MA組和RAPA組分別加入不同劑量的3-MA或RAPA孵育30 min；RAPA+3-MA組先用3-MA預(yù)孵育30 min，再用RAPA孵育30 min。然后加入梯度濃度的去甲腎上腺素（norepinephrine,NE）1×10-9～1×10-5mmol/L，記錄不同NE濃度下血管環(huán)產(chǎn)生的收縮張力（ΔNE），以各血管環(huán)對(duì)高鉀誘導(dǎo)的預(yù)收縮張力（ΔK+）為量化標(biāo)準(zhǔn)，用量-效曲線和最大收縮張力（Emax=ΔNE/ΔK+）評(píng)價(jià)血管反應(yīng)性。

1.3 RAPA對(duì)THS大鼠血壓和器官血流灌注的影響

24只大鼠隨機(jī)分為3組（n=8）：正常組、休克+LR組、休克+LR+RAPA組。休克+LR+RAPA組大鼠以1 mg·kg-1·d-1的RAPA灌胃給藥，預(yù)給藥3 d；按照1.2中的方法制備THS大鼠模型，然后給予2倍失血量的LR進(jìn)行復(fù)蘇。休克+LR組大鼠未進(jìn)行RAPA灌胃，其余操作與休克+LR+RAPA組相同。正常組大鼠正常飼養(yǎng)。分別在休克前、休克末及復(fù)蘇后0.5、1、2 h，通過(guò)股動(dòng)脈插管連接血壓計(jì)觀察平均動(dòng)脈血壓（mean arterial pressure,MAP）。在復(fù)蘇后2 h，開腹暴露大鼠肝和腎，采用激光散斑血流測(cè)定儀測(cè)定血流灌注量。

1.4 Western blot法檢測(cè)血管組織中自噬標(biāo)志物相關(guān)蛋白表達(dá)

各組大鼠完成器官血流量檢測(cè)后處死，取腸系膜上動(dòng)脈血管組織。常規(guī)方法提取組織蛋白，取等量的各組樣本，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后分別加入LC3抗體（1∶1 000）、Beclin-1抗體（1∶1 000）或β-actin抗體（1∶2 000）孵育。然后加入山羊抗兔或抗小鼠熒光二抗（1∶20 000）孵育，用雙色紅外成像激光系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（x-±sxˉ）表示，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用post-hoc Tukey檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3-MA對(duì)THS大鼠血管反應(yīng)性的影響

與對(duì)照組相比，休克組大鼠腸系膜上動(dòng)脈對(duì)NE誘導(dǎo)的血管反應(yīng)性明顯降低（P＜0.01）；不同劑量的3-MA處理后，休克血管對(duì)NE的血管反應(yīng)性降低，且隨3-MA劑量升高血管反應(yīng)性逐漸降低；2 mmol/L、4 mmol/L的3-MA處理后血管反應(yīng)性顯著低于休克組（P＜0.01），見(jiàn)圖1。

圖1 抑制自噬對(duì)THS大鼠血管反應(yīng)性的影響

2.2 RAPA對(duì)THS大鼠血管反應(yīng)性的影響及3-MA的作用

給予不同劑量的RAPA處理后，THS大鼠血管對(duì)NE誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)性呈劑量依賴性升高。1、2、10 μmol/L RAPA可顯著提高THS大鼠血管反應(yīng)性（P＜0.01）。3-MA預(yù)處理明顯抑制了RAPA誘導(dǎo)THS大鼠血管反應(yīng)性升高（P＜0.01），見(jiàn)圖2。

圖2 RAPA對(duì)THS大鼠血管反應(yīng)性的影響及3-MA的作用

2.3 RAPA對(duì)THS大鼠血壓和器官血流灌注的影響

休克+LR組大鼠建模時(shí)MAP為30 mmHg，模型完成后給予2倍失血量的LR復(fù)蘇，大鼠MAP有一定升高，隨著時(shí)間推移逐漸降低。而休克+LR+RAPA組大鼠提前予以RAPA治療，LR復(fù)蘇后MAP升高，且在實(shí)驗(yàn)期間維持在相對(duì)穩(wěn)定水平，在復(fù)蘇后2 h MAP水平明顯高于休克+LR組（P＜0.01），見(jiàn)圖3a。

圖3 RAPA對(duì)THS大鼠血壓和血流灌注的影響

休克+LR組大鼠給予LR復(fù)蘇后肝、腎血流灌注量顯著低于正常組（P＜0.01）；而休克+LR+RAPA組大鼠的肝、腎血流灌注量顯著高于休克+LR組（P＜0.01），見(jiàn)圖3b。

2.4 血管組織中自噬標(biāo)志物相關(guān)蛋白表達(dá)

與正常組比較，休克+LR組大鼠的血管組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1/β-actin降低（P＜0.01）。而休克+LR+RAPA組大鼠血管組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1/β-actin明顯高于休克+LR組（P＜0.01），見(jiàn)圖4。

圖4 血管組織中自噬標(biāo)志物相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

自噬是普遍存在于真核細(xì)胞中的一種生命過(guò)程，其主要依賴于溶酶體系統(tǒng)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)壽蛋白、異常蛋白或者受損細(xì)胞器進(jìn)行消化降解，是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)組分循環(huán)再利用的重要機(jī)制之一。在正常生理狀態(tài)下，自噬是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制；而在病理狀態(tài)下，自噬的異常改變可引起細(xì)胞損傷、甚至自噬性細(xì)胞死亡，參與多種疾病的發(fā)生過(guò)程。研究表明，自噬還參與了許多心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，包括心肌梗死、心力衰竭、心肌病、高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化等[9-10]。深入研究自噬的分子機(jī)制及調(diào)控機(jī)制對(duì)相關(guān)疾病的防治具有重要意義[5-7]。但自噬在嚴(yán)重THS后血管功能障礙，特別是血管低反應(yīng)性中的作用機(jī)制目前尚不清楚。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自噬激動(dòng)劑RAPA對(duì)THS后降低的血管反應(yīng)性有明顯的恢復(fù)作用，而自噬抑制劑3-MA對(duì)休克血管反應(yīng)性具有明顯的抑制作用，并且可拮抗RAPA升高休克血管反應(yīng)性的作用。本研究在給予LR的基礎(chǔ)上在體給予1 mg·kg-1·d-1RAPA，使接受常規(guī)LR復(fù)蘇的THS大鼠的MAP和肝、腎血流灌注量升高，其作用明顯優(yōu)于單純給予LR；對(duì)血管組織樣本的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，休克后血管組織的自噬標(biāo)志分子LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1/β-actin水平顯著降低，RAPA處理可使休克后自噬水平升高。以上結(jié)果提示，自噬在THS血管反應(yīng)性調(diào)節(jié)中具有重要作用，通過(guò)調(diào)節(jié)自噬能有效改善休克血管功能障礙。

盡管自噬在機(jī)體生理調(diào)節(jié)和病理過(guò)程中的重要性已經(jīng)得到證實(shí)，但是如何有效調(diào)控自噬仍是一個(gè)難題。當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果互相矛盾，即使在同一疾病模型和相似的病理過(guò)程中亦是如此。在小鼠心肌缺血再灌注模型中，使用一種心臟自噬抑制因子（cardiac autophagy inhibitory factor,CAIF）的長(zhǎng)鏈非編碼RNA能夠抑制自噬，減少心肌細(xì)胞死亡，減輕心肌梗死程度[11]。然而，Sala-Mercado等[12]認(rèn)為，誘導(dǎo)自噬對(duì)急性心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，該研究建立了大動(dòng)物豬的急性心肌缺血再灌注模型，在缺血前和缺血后均給予琥珀酸氯霉素誘導(dǎo)了自噬標(biāo)志物Beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá)快速上調(diào)，減少了心肌梗死面積。類似的自噬在相似病理過(guò)程出現(xiàn)相反變化或作用的現(xiàn)象也出現(xiàn)于其他疾病的研究中，這些情況與自噬既有保護(hù)也可能引起損傷的雙重作用有關(guān)[13-14]。Cai等[15]的研究也顯示，上調(diào)自噬可對(duì)失血休克導(dǎo)致的血管通透性損傷發(fā)揮保護(hù)作用；然而，Wang等[16]在對(duì)失血休克大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制血管平滑肌細(xì)胞過(guò)度自噬可以改善腸系膜淋巴介導(dǎo)的血管反應(yīng)性降低。本研究結(jié)果顯示，THS引起了大鼠血管組織自噬水平的降低，給予自噬誘導(dǎo)劑RAPA可上調(diào)自噬，改善血管收縮功能。這些研究差異可能與不同病理階段自噬水平的改變情況不同有關(guān)，也證實(shí)了自噬是一把雙刃劍，不恰當(dāng)?shù)募せ罨蛞种谱允煽赡芗又負(fù)p傷。雖然目前對(duì)自噬的類型、關(guān)鍵調(diào)控分子、與疾病的關(guān)聯(lián)等方面都有了較深入的認(rèn)識(shí)，但是自噬在疾病不同病理過(guò)程中的作用和調(diào)控機(jī)制，還需要進(jìn)一步探索和研究。

綜上所述，自噬在THS后血管功能障礙的發(fā)生中具有重要作用，休克后血管自噬水平降低，給予自噬誘導(dǎo)劑可改善血管低反應(yīng)性和器官血流灌注，這可能為臨床重癥的治療提供一種新的思路。但是，自噬是否在創(chuàng)傷休克后復(fù)雜的病理過(guò)程中有不同的作用及具體調(diào)節(jié)機(jī)制，仍需更深入的研究。