紫檀芪保護(hù)HT22細(xì)胞抗過氧化氫誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制研究

范崇熙,張?jiān)扑?孫兵兵,王曉瑩,趙東林,楊全龍,石學(xué)匯,劉磊

（1. 空軍特色醫(yī)學(xué)中心消化內(nèi)科，北京 100142；2. 空軍特色醫(yī)學(xué)中心重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100142）

活性氧（reactive oxygen species，ROS）主要包括超氧陰離子（O2·-）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（·OH），可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等結(jié)構(gòu)功能障礙，進(jìn)而誘導(dǎo)DNA損傷和細(xì)胞凋亡[1]。氧化應(yīng)激是ROS過度產(chǎn)生介導(dǎo)的代謝性級聯(lián)反應(yīng)[2]。目前認(rèn)為，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致神經(jīng)退行性疾病的重要因素[2-3]。尋找能夠抑制氧化損傷的活性物質(zhì)，有望成為預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病的有效方法[4]。

紫檀芪（C16H16O3，pterostilbene，PTE）是白藜蘆醇的甲基化衍生物，首次從紫檀等木材中分離并提取[5]。研究發(fā)現(xiàn)，紫檀芪具有廣泛的藥理學(xué)作用，包括抗癌、抗炎、抗糖尿病以及抗衰老等[6-7]。本研究采用HT22細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷模型，探索PTE對H2O2介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，同時(shí)關(guān)注線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能變化，旨在為揭示PTE抗神經(jīng)元退行性病變提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

HT22細(xì)胞系及培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司，PTE購自上海陶術(shù)生物科技有限公司，CCK-8試劑盒購自北京翱擎生物科技有限公司，乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，TUNEL試劑盒購自瑞士Roche公司，DAPI染色劑、ROS檢測試劑盒和細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，JC-1線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，兔抗鼠Bax、eIF2α、p-eIF2α抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，兔抗鼠Bip和鼠抗鼠CHOP、Cytochrome C（Cyto C）抗體購自美國Abcam公司，兔抗鼠AIF、Bcl-2、PERK、Lamin B抗體購自美國Proteintech公司，兔抗鼠p-PERK和鼠抗鼠β-actin抗體購自常州Affinity Biosciences公司，辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。多功能酶標(biāo)儀購自美國Biotek公司，激光共聚焦顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，ChemiDocTMMP型成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HT22細(xì)胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2飽和無菌濕環(huán)境中，常規(guī)每2天換液一次。適時(shí)應(yīng)用0.25%胰酶消化傳代，傳代比例為1∶2～1∶3。將對數(shù)生長期的細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)對象。

PTE溶解于DMSO中配成儲存液，-20 ℃分裝保存，使用時(shí)按比例以無血清的培養(yǎng)基稀釋。采用不同濃度（2.5～20.0 μmol/L）的PTE處理細(xì)胞24 h，并測定細(xì)胞活力，以篩選合理的PTE濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。此外，構(gòu)建H2O2（200.0 μmol/L）損傷模型[8]。

1.3 CCK-8法測定細(xì)胞活力

按照每孔1×104個(gè)細(xì)胞將HT22細(xì)胞接種于96孔板，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。按照1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果給予PTE（5.0 μmol/L和10.0 μmol/L）或H2O2（200.0 μmol/L）處理細(xì)胞，加入10% CCK-8混合液100 μL，37 ℃避光孵育2 h。應(yīng)用酶標(biāo)儀測定450 nm處的光密度(optical density, OD)值。

1.4 比色法檢測LDH釋放量

按照每孔2×106個(gè)細(xì)胞將HT22細(xì)胞接種于6孔板，給予PTE（5.0 μmol/L和10.0 μmol/L）或H2O2（200.0 μmol/L）處理細(xì)胞，根據(jù)說明書步驟，測定上清液450 nm波長處的OD值，空白處理組的值設(shè)為100%。

1.5 TUNEL染色

按照每孔3×105個(gè)細(xì)胞將HT22細(xì)胞接種于帶圓玻片的24孔板，37 ℃培養(yǎng)過夜，并給予PTE（5.0 μmol/L和10.0 μmol/L）或H2O2（200.0 μmol/L）處理細(xì)胞，4%多聚甲醛室溫固定10 min，用0.3%的Triton X-100溶液室溫孵育10 min。按說明書要求，配置TUNEL工作液，37 ℃避光染色1.5 h，隨后用DAPI溶液（1 μg/mL）避光標(biāo)記細(xì)胞核約10 min[9]。甘油封片后，激光共聚焦顯微鏡觀察并隨機(jī)選取5個(gè)視野中的細(xì)胞，計(jì)算凋亡率（綠色熒光百分比）。

1.6 ROS含量測定

制作細(xì)胞爬片，加入一定量的DCFH-DA工作液（10 μmol/L），37 ℃避光孵育30 min。應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察并采集信號，其中激發(fā)波長為488 nm、發(fā)射波長為525 nm，Image J分析采集的圖像。

1.7 MMP檢測

配置JC-1工作液，37 ℃避光孵育細(xì)胞20 min。加入600 μL染色緩沖液，洗滌2次。以400 μL無血清培養(yǎng)基覆蓋細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡下觀察染色結(jié)果，并用Image J分析結(jié)果。其中，檢測JC-1單體時(shí)激發(fā)光波長為485 nm，發(fā)射光波長為535 nm；檢測JC-1聚合體時(shí)激發(fā)光波長為550 nm，發(fā)射光波長為600 nm[10]。

1.8 蛋白提取及免疫印跡檢測

按照試劑盒說明書進(jìn)行蛋白分離，經(jīng)BCA法定量后，加入1/5體積的上樣緩沖液（5×），100 ℃沸水處理7 min，-80 ℃分裝保存。選取適合濃度的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，隨后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫孵育2 h。應(yīng)用一定濃度的抗體溶液，與對應(yīng)蛋白條帶4 ℃孵育過夜。次日加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記抗體（1∶5 000）室溫孵育2 h；ChemiDocTMMP型Bio-Rad成像系統(tǒng)采集化學(xué)發(fā)光信號，并用Image Lab 5.1軟件分析蛋白的相對表達(dá)量。以內(nèi)參蛋白（β-actin和相應(yīng)總蛋白）為基準(zhǔn)，計(jì)算各組樣本目的蛋白表達(dá)量或磷酸化水平，其中對照組為100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，采用單因素方差分析比較差異，組間采用LSD法進(jìn)一步分析；多組間率的比較采用Fisher精確概率檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTE對H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷的影響

CCK-8結(jié)果顯示，PTE濃度在低于10.0 μmol/L時(shí)無明顯細(xì)胞毒性作用（P＜0.05），見圖1a，此濃度將用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，H2O2顯著降低HT22細(xì)胞活力，表現(xiàn)為細(xì)胞折光性增加、形態(tài)變圓、部分脫落，且OD值明顯降低；H2O2處理后的細(xì)胞活力隨PTE濃度增加而增加（P＜0.05），見圖1b。此外，H2O2處理組LDH釋放量明顯增加，表明H2O2會損傷細(xì)胞，PTE明顯抑制LDH釋放（P＜0.05），見圖1c。

圖1 PTE對H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞損傷的影響

2.2 PTE對H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡的影響

H2O2處理后，藍(lán)色熒光減弱且綠色熒光表達(dá)增強(qiáng)；不同濃度的PTE可使綠色熒光表達(dá)減弱（P＜0.05），見圖2a。進(jìn)一步蛋白分析表明，隨著PTE濃度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)增加，而促凋亡蛋白Bax明顯下調(diào)；核質(zhì)蛋白分離檢測發(fā)現(xiàn)，H2O2處理后凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的趨勢明顯增加，PTE可減緩上述蛋白移位過程（P＜0.05），見圖2b。

圖2 PTE對H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞凋亡的影響

2.3 PTE對H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞ROS的影響

細(xì)胞內(nèi)ROS水平檢測顯示，H2O2有效增加了帶有綠色熒光的HT22細(xì)胞（DCF陽性）數(shù)量，各劑量（5.0 μmol/L和10.0 μmol/L）PTE有效減少了綠色熒光細(xì)胞數(shù)量，且呈劑量依賴性（P＜0.05），見圖3。

2.4 PTE對H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞線粒體功能的影響

H2O2增加了JC-1單體的表達(dá)，降低了JC-1聚合體的表達(dá)（圖4a），說明H2O2可誘導(dǎo)HT22細(xì)胞線粒體功能障礙。PTE逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)HT22細(xì)胞 的MMP降低，提示PTE通過上調(diào)MMP水平進(jìn)而維持H2O2損傷后的線粒體功能。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，HT22細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Cyto C表達(dá)明顯增加，PTE處理則減輕Cyto C在胞質(zhì)內(nèi)聚集的趨勢（P＜0.05），見圖4b。

圖4 PTE對H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞線粒體功能的影響

2.5 PTE對H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的影響

Western blot分析ER stress關(guān)鍵蛋白的結(jié)果顯示，H2O2處理后，PERK和eIF2α蛋白磷酸化水平上調(diào)；同時(shí)，H2O2處理的細(xì)胞中Bip和Chop蛋白表達(dá)水平顯著升高；相較H2O2處理組，PTE顯著下調(diào)上述蛋白表達(dá)，見圖5。說明PTE對HT22細(xì)胞中H2O2引起的ER stress具有抑制作用。

圖5 PTE對H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞ER stress相關(guān)蛋白的影響

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)是氧自由基攻擊的主要器官之一，氧自由基主要影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和酶活性[11]，該過程是多種神經(jīng)退行性疾?。ㄈ绨柎暮Ｄ『团两鹕┑牟±砩砘A(chǔ)[2]。H2O2是一種溫和的氧化劑，常用來模擬神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷。本研究揭示了H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞毒性作用伴隨的關(guān)鍵蛋白表達(dá)，以及中藥單體對神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，旨在為尋找新型抗神經(jīng)退行性疾病藥物提供理論基礎(chǔ)。

由于氧自由基的有害作用，中和或清除自由基的抗氧化防御機(jī)制對于預(yù)防和應(yīng)對神經(jīng)元損傷至關(guān)重要。PTE是從紫檀、葡萄或藍(lán)莓中提取的一種芪類多酚類化合物，具有多種生物學(xué)特性，如抗癌、抗炎、抗糖尿病及延緩衰老等[12]。目前，PTE的抗氧化作用也得到證實(shí)。Xu等[13]發(fā)現(xiàn)PTE通過調(diào)節(jié)AMPK/sirt1和Nrf2/HO-1信號通路緩解氧化應(yīng)激和過敏性氣道炎癥反應(yīng)，認(rèn)為PTE可作為治療哮喘的新型藥物。近年來，PTE對神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)作用受到廣泛的關(guān)注[14]。Zhu等[15]的研究證實(shí)，PTE能有效減輕Aβ25-35誘導(dǎo)的小鼠行為缺陷，其機(jī)制可能與抑制線粒體依賴性細(xì)胞凋亡并改善突觸可塑性有關(guān)。此外，Liu等[16]發(fā)現(xiàn)，PTE可減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的腦損傷，表現(xiàn)為抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥和神經(jīng)元氧化應(yīng)激反應(yīng)；這種效應(yīng)可能通過阻斷NF-κB的磷酸化和核內(nèi)移位而實(shí)現(xiàn)。綜上，PTE調(diào)控多種信號通路發(fā)揮抗神經(jīng)系統(tǒng)病變作用，有望成為治療AD和腦卒中的備選藥物；然而，考慮到PTE廣泛生物學(xué)功效和神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷復(fù)雜的分子機(jī)制，上述保護(hù)作用尚需進(jìn)一步證實(shí)。

凋亡是神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變發(fā)生及進(jìn)展的關(guān)鍵過程，關(guān)乎神經(jīng)元損傷的程度。多項(xiàng)證據(jù)表明，Bcl-2蛋白家族的調(diào)節(jié)對維持線粒體完整性和功能至關(guān)重要，其具體成員包括抗凋亡蛋白（Bcl-2和Bcl-xL）和促凋亡蛋白（Bax、Bad和Bim等）[17]。其中，Bax介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡模型的線粒體損傷，而Bcl-2通過異二聚體的形式阻斷Bax的活性[18]。AIF是另一種促凋亡蛋白，主要通過移位到細(xì)胞核并刺激染色質(zhì)凝結(jié)發(fā)揮作用[19]。本研究結(jié)果顯示，PTE（5.0 μmol/L和10.0 μmol/L）可顯著增加H2O2處理后的HT22細(xì)胞活性，并減少LDH釋放，降低細(xì)胞凋亡率；蛋白質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，PTE減輕Bax的表達(dá)及AIF的移位，同時(shí)上調(diào)Bcl-2的水平，說明PTE緩解H2O2介導(dǎo)HT22損傷的效應(yīng)主要是通過抑制細(xì)胞凋亡而實(shí)現(xiàn)。

大腦是機(jī)體高氧代謝器官，氧分子作為產(chǎn)生ROS（O2·-、·OH、H2O2）的底物涉及神經(jīng)元突觸可塑性、細(xì)胞增殖和衰老等調(diào)控過程[2]。本研究中，PTE顯著下調(diào)H2O2誘導(dǎo)的DCF含量升高，說明PTE可抑制ROS的異常堆積。Cyto C主要定位于線粒體內(nèi)膜的外側(cè)，其釋放是線粒體呼吸鏈功能失衡的重要標(biāo)志，也是線粒體介導(dǎo)凋亡的重要信號傳遞分子[20]。本研究中H2O2處理后，細(xì)胞MMP發(fā)生去極化且線粒體膜通透性增加，而PTE處理顯著提升了MMP水平并減少了Cyto C向胞質(zhì)內(nèi)移動，提示PTE通過恢復(fù)線粒體功能和結(jié)構(gòu)完整性發(fā)揮抑制細(xì)胞ROS異常產(chǎn)生的作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對蛋白質(zhì)折疊、分泌和翻譯后修飾至關(guān)重要[21]，受生理或病理刺激時(shí)，會觸發(fā)未折疊和錯(cuò)誤折疊蛋白的積累，即ER stress[22]。PERK/eIF2α/CHOP是ER stress經(jīng)典的調(diào)控通路之一。其中，PERK作為跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，通常與Bip結(jié)合，保持穩(wěn)定狀態(tài)；一旦激活則可誘導(dǎo)eIF2α磷酸化，進(jìn)一步活化CHOP發(fā)揮效應(yīng)；然而，長時(shí)間持續(xù)表達(dá)CHOP可通過不同途徑觸發(fā)細(xì)胞凋亡，如調(diào)控Bcl-2/Bax表達(dá)等[22]。在神經(jīng)系統(tǒng)中，ER stress與線粒體功能相互影響，共同調(diào)控氧化應(yīng)激損傷[23]。結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)，H2O2顯著激活PERK/eIF2α/CHOP信號通路，PTE處理可降低HT22細(xì)胞中PERK和eIF2α的磷酸化水平，抑制GRP78和CHOP的表達(dá)。以上結(jié)果提示，PTE可有效阻斷H2O2誘導(dǎo)的HT22細(xì)胞ER stress過程。

綜上，PTE具有保護(hù)神經(jīng)元HT22細(xì)胞的作用，該作用與穩(wěn)定線粒體功能、減少ROS堆積、抑制ER stress及阻斷氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡有關(guān)。PTE有望成為一種治療神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的新策略，但其具體作用機(jī)制尚未完全闡明，仍需深入研究。