葛根總黃酮的水提工藝優(yōu)化研究

張國(guó)棟，王曉彤，聶文娟，黃武軍，徐向榮

（1.江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院，江西樟樹(shù) 331200；2.江西仁仁健康產(chǎn)業(yè)有限公司，江西樟樹(shù) 331200；3.仁和集團(tuán)發(fā)展有限公司，江西樟樹(shù) 331200）

葛根（Pueraria DC）又名葛藤，葛麻葉，甜葛藤，粉葛藤等，是豆科（Laguminos ae）多年生藤本植物。世界上有18 種，我國(guó)有十余種[1]。其中，野葛（P.lobata(willd)ohwi）具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽(yáng)止瀉、通經(jīng)活絡(luò)、解酒毒等功效，自古以來(lái)主作中藥，用于外感發(fā)熱頭痛、項(xiàng)背強(qiáng)痛、口渴、消渴、麻疹不透、熱痢、泄瀉、眩暈頭痛、中風(fēng)偏癱、胸痹心痛、酒毒傷中等[2]。

較多學(xué)者對(duì)葛根主要成分進(jìn)行了提取、分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)葛根的成分有如下幾類(lèi)：異黃酮類(lèi)，包括大豆苷元（大豆素、大豆黃素、黃豆苷元）、大豆苷、葛根素等；葛根苷類(lèi)，包括葛根苷A、B、C 3 種；三帖皂苷類(lèi)，包括以葛根皂苷A、B、C 命名的7 種新型齊墩果烘型皂角精醇、槐二醇、大豆皂醇B、大豆苷醇A 等；生物堿及其他化合物類(lèi)。在葛根的有效成分中，研究的最多的是異黃酮類(lèi)，其中對(duì)葛根素的研究更受關(guān)注[3]。

研究表明，葛根具有降低血壓、減慢心率、降低心肌耗氧量、擴(kuò)張冠狀血管、改善正常和缺血心肌的代謝，改善腦循環(huán)、周?chē)芗拔⒀h(huán)，抗心律失常、降血糖降血脂、抗腫瘤、抗氧化等作用[4-8]。由于葛根具有多種藥理作用，目前，上市的產(chǎn)品有葛根片、葛根膠囊、葛根口服液和葛根飲料等，擬用葛根提取液進(jìn)行發(fā)酵，制備成葛根酵素，以填補(bǔ)市場(chǎng)上葛根酵素類(lèi)產(chǎn)品的空白，對(duì)葛根水提工藝進(jìn)行研究，為葛根酵素的生產(chǎn)奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根（干制品），江西仁德中藥飲片有限公司提供；蘆?。?5%），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，均為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

C21-HT2116HM 型多功能電磁爐，廣東美的生活電器制造有限公司產(chǎn)品；L3 型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品；SHA-C 型水浴恒溫振蕩器，杭州旌斐儀器科技有限公司產(chǎn)品；SHP-160 型生化培養(yǎng)箱，上海鴻都電子科技有限公司產(chǎn)品；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州億通分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 葛根總黃酮的測(cè)定

采用硝酸鋁顯色法測(cè)定葛根提取液中的總黃酮含量[9]，精密稱(chēng)定50 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品置于50 mL 燒杯中，用濃度為0.1 mol/L 的氫氧化鈉溶液溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即可得質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 至具塞試管中，分別加入1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL 濃度為0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液，再加體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液至5 mL，加入的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min 后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入濃度為1 mol/L 的氫氧化鈉溶液4 mL，加0.4 mL 的水，搖勻，靜置15 min，測(cè)定其于波長(zhǎng)510 nm 下的吸光度。以吸光度A 為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性擬合得到回歸曲線及相關(guān)系數(shù)。

1.3.2 提取工藝流程與方法

干葛根→粉碎→過(guò)篩→浸提→取上清液→分光光度計(jì)檢測(cè)。

準(zhǔn)確稱(chēng)量5 g 干葛根，置入高速粉碎機(jī)粉碎、過(guò)篩，倒入錐形瓶中加入蒸餾水，將錐形瓶置于數(shù)顯恒溫水浴鍋中浸提，取出錐形瓶中提取液，過(guò)濾得到濾液，定容至150 mL，精密吸取0.5 mL 提取液，再加體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液至5 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min后，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入濃度為1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，加0.4 mL 的水，搖勻，靜置15 min，測(cè)定其于波長(zhǎng)510 nm 下的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，得出黃酮液質(zhì)量濃度。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2 次取平均值。

1.3.3 單因素試驗(yàn)分析

以葛根顆粒大小、提取時(shí)間、料液比、提取溫度為參數(shù)，提取液黃酮質(zhì)量濃度為指標(biāo)進(jìn)行提取，確定主要影響參數(shù)。

單因素試驗(yàn)分析各因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 單因素試驗(yàn)分析各因素與水平設(shè)計(jì)

進(jìn)行單因素試驗(yàn)分析時(shí)，除試驗(yàn)因素的水平按表1 進(jìn)行，其他因素的水平固定為葛根顆粒大小0.5 cm，提取時(shí)間60 min，提取料液比1∶20，提取溫度80 ℃。

1.3.4 正交試驗(yàn)分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定3 個(gè)影響總黃酮提取的主要因素及各個(gè)因素的影響葛根總黃酮得率水平，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.5 正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

以正交試驗(yàn)獲得的各個(gè)因素的最佳水平組合為參數(shù)，進(jìn)行提取，計(jì)算提取液黃酮質(zhì)量濃度，試驗(yàn)平行進(jìn)行3 次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理軟件Microsift Excel 2010。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 葛根顆粒大小對(duì)總黃酮質(zhì)量濃度的影響

葛根顆粒大小對(duì)葛根總黃酮質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖1。

圖1 葛根顆粒大小對(duì)葛根總黃酮質(zhì)量濃度的影響

由圖1 可知，葛根顆粒大小為0.25 cm 時(shí)，其提取率為最大，達(dá)到1.6 mg/mL，隨著葛根顆粒的增大，總黃酮質(zhì)量濃度降低，但到1 cm 及以上大小時(shí)，其總黃酮的提取率變化趨緩。

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮質(zhì)量濃度的影響

提取時(shí)間對(duì)葛根總黃酮質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)葛根總黃酮質(zhì)量濃度的影響

由圖2 可知，提取時(shí)間在80 min 以?xún)?nèi)，葛根總黃酮的質(zhì)量濃度隨提取時(shí)間的增加而升高，但提取到達(dá)100 min，其葛根總黃酮的質(zhì)量濃度反而下降。

2.1.3 料液比對(duì)總黃酮質(zhì)量濃度的影響

料液比對(duì)葛根總黃酮質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖3。

圖3 料液比對(duì)葛根總黃酮質(zhì)量濃度的影響

由圖3 可知，料液比在1∶25 以?xún)?nèi)時(shí)，其葛根總黃酮的質(zhì)量濃度隨料液比的降低而升高，在1∶25時(shí)到達(dá)頂峰，最后料液比降低到1∶30 時(shí)，葛根總黃酮的質(zhì)量濃度下降。

2.1.4 提取溫度對(duì)總黃酮質(zhì)量濃度的影響

提取溫度對(duì)葛根總黃酮質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖4。

圖4 提取溫度對(duì)葛根總黃酮質(zhì)量濃度的影響

提取溫度對(duì)總黃酮質(zhì)量濃度影響較大，提取溫度越高，總黃酮質(zhì)量濃度越高，其變化規(guī)律具有可預(yù)見(jiàn)性。因此，在正交試驗(yàn)時(shí)將提取溫度設(shè)定為100 ℃。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)采用直觀分析法，對(duì)各因素的K 及R（極差）值的大小進(jìn)行有關(guān)分析可知，極差RA＞RB＞RC。

因此，用水對(duì)葛根總黃酮進(jìn)行提取時(shí)，影響總黃酮質(zhì)量濃度的主要因素為提取時(shí)間，其次是料液比，再次是顆粒大小。再由K 值越大越好得出優(yōu)化后最佳組合為A3B2C1，即提取時(shí)間100 min，料液比1∶25，葛根顆粒大小0.25 cm。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，選取0.25 cm 葛根顆粒，稱(chēng)取5 g 分別放置在3 個(gè)錐形瓶中，按照1∶25 的料液比加入水，在100 ℃下進(jìn)行提取，提取時(shí)間為100 min，提取液自然冷卻后加水補(bǔ)足損失的質(zhì)量，測(cè)定總黃酮質(zhì)量濃度，重復(fù)3 次試驗(yàn)，結(jié)果分別為1.274，1.261，1.276 mg/mL，平均總黃酮質(zhì)量濃度為1.27 mg/mL，對(duì)比其各參數(shù)其他水平下所獲得的質(zhì)量濃度，該結(jié)果為最高，表明正交試驗(yàn)方法得當(dāng)，結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)分析影響葛根總黃酮提取的4 個(gè)因素，表明4 個(gè)因素對(duì)于總黃酮質(zhì)量濃度的影響均較大，但是由于溫度越高，質(zhì)量濃度越高，為了提升試驗(yàn)效果，因此在正交試驗(yàn)時(shí)將提取溫度這個(gè)參數(shù)定為100 ℃，以提取時(shí)間、料液比和顆粒大小3 個(gè)因素開(kāi)展三因素三水平正交試驗(yàn)。結(jié)果表明，葛根顆粒大小0.25 cm，料液比1∶25，提取溫度100 ℃，提取時(shí)間為100 min 條件下進(jìn)行提取，獲得葛根總黃酮質(zhì)量濃度為最高，為1.27 mg/mL。

在企業(yè)中以葛根為原料生產(chǎn)相關(guān)的藥品或者食品時(shí)，其提取一般按照師傅傳承下來(lái)的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行，參數(shù)為固定的，未進(jìn)行科學(xué)的優(yōu)化。通過(guò)對(duì)葛根提取進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，能夠提高葛根的利用率，縮短提取時(shí)間，降低能量的消耗，降低企業(yè)的生產(chǎn)成本，提升企業(yè)的效益。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了葛根提取的工藝參數(shù)，為后續(xù)葛根酵素的發(fā)酵生產(chǎn)奠定了良好的試驗(yàn)基礎(chǔ)。