張國(guó)棟,王曉彤,聶文娟,黃武軍,徐向榮
(1.江西農(nóng)業(yè)工程職業(yè)學(xué)院,江西樟樹(shù) 331200;2.江西仁仁健康產(chǎn)業(yè)有限公司,江西樟樹(shù) 331200;3.仁和集團(tuán)發(fā)展有限公司,江西樟樹(shù) 331200)
葛根(Pueraria DC)又名葛藤,葛麻葉,甜葛藤,粉葛藤等,是豆科(Laguminos ae)多年生藤本植物。世界上有18 種,我國(guó)有十余種[1]。其中,野葛(P.lobata(willd)ohwi)具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽(yáng)止瀉、通經(jīng)活絡(luò)、解酒毒等功效,自古以來(lái)主作中藥,用于外感發(fā)熱頭痛、項(xiàng)背強(qiáng)痛、口渴、消渴、麻疹不透、熱痢、泄瀉、眩暈頭痛、中風(fēng)偏癱、胸痹心痛、酒毒傷中等[2]。
較多學(xué)者對(duì)葛根主要成分進(jìn)行了提取、分離和鑒定,發(fā)現(xiàn)葛根的成分有如下幾類(lèi):異黃酮類(lèi),包括大豆苷元(大豆素、大豆黃素、黃豆苷元)、大豆苷、葛根素等;葛根苷類(lèi),包括葛根苷A、B、C 3 種;三帖皂苷類(lèi),包括以葛根皂苷A、B、C 命名的7 種新型齊墩果烘型皂角精醇、槐二醇、大豆皂醇B、大豆苷醇A 等;生物堿及其他化合物類(lèi)。在葛根的有效成分中,研究的最多的是異黃酮類(lèi),其中對(duì)葛根素的研究更受關(guān)注[3]。
研究表明,葛根具有降低血壓、減慢心率、降低心肌耗氧量、擴(kuò)張冠狀血管、改善正常和缺血心肌的代謝,改善腦循環(huán)、周?chē)芗拔⒀h(huán),抗心律失常、降血糖降血脂、抗腫瘤、抗氧化等作用[4-8]。由于葛根具有多種藥理作用,目前,上市的產(chǎn)品有葛根片、葛根膠囊、葛根口服液和葛根飲料等,擬用葛根提取液進(jìn)行發(fā)酵,制備成葛根酵素,以填補(bǔ)市場(chǎng)上葛根酵素類(lèi)產(chǎn)品的空白,對(duì)葛根水提工藝進(jìn)行研究,為葛根酵素的生產(chǎn)奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。
葛根(干制品),江西仁德中藥飲片有限公司提供;蘆?。?5%),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供;乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉,均為分析純,西隴科學(xué)股份有限公司提供。
C21-HT2116HM 型多功能電磁爐,廣東美的生活電器制造有限公司產(chǎn)品;L3 型可見(jiàn)分光光度計(jì),上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品;SHA-C 型水浴恒溫振蕩器,杭州旌斐儀器科技有限公司產(chǎn)品;SHP-160 型生化培養(yǎng)箱,上海鴻都電子科技有限公司產(chǎn)品;HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋,常州億通分析儀器制造有限公司產(chǎn)品;高速萬(wàn)能粉碎機(jī),天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品。
1.3.1 葛根總黃酮的測(cè)定
采用硝酸鋁顯色法測(cè)定葛根提取液中的總黃酮含量[9],精密稱(chēng)定50 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品置于50 mL 燒杯中,用濃度為0.1 mol/L 的氫氧化鈉溶液溶解后轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中,定容至刻度,搖勻,即可得質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。
精密吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL 至具塞試管中,分別加入1.0,0.8,0.6,0.4,0.2,0 mL 濃度為0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液,再加體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液至5 mL,加入的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL,搖勻,靜置6 min 后,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁溶液0.3 mL,搖勻,靜置6 min,加入濃度為1 mol/L 的氫氧化鈉溶液4 mL,加0.4 mL 的水,搖勻,靜置15 min,測(cè)定其于波長(zhǎng)510 nm 下的吸光度。以吸光度A 為縱坐標(biāo),濃度C為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性擬合得到回歸曲線及相關(guān)系數(shù)。
1.3.2 提取工藝流程與方法
干葛根→粉碎→過(guò)篩→浸提→取上清液→分光光度計(jì)檢測(cè)。
準(zhǔn)確稱(chēng)量5 g 干葛根,置入高速粉碎機(jī)粉碎、過(guò)篩,倒入錐形瓶中加入蒸餾水,將錐形瓶置于數(shù)顯恒溫水浴鍋中浸提,取出錐形瓶中提取液,過(guò)濾得到濾液,定容至150 mL,精密吸取0.5 mL 提取液,再加體積分?jǐn)?shù)為30%的乙醇溶液至5 mL,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL,搖勻,靜置6 min后,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的硝酸鋁溶液0.3 mL,搖勻,靜置6 min,加入濃度為1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL,加0.4 mL 的水,搖勻,靜置15 min,測(cè)定其于波長(zhǎng)510 nm 下的吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程,得出黃酮液質(zhì)量濃度。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2 次取平均值。
1.3.3 單因素試驗(yàn)分析
以葛根顆粒大小、提取時(shí)間、料液比、提取溫度為參數(shù),提取液黃酮質(zhì)量濃度為指標(biāo)進(jìn)行提取,確定主要影響參數(shù)。
單因素試驗(yàn)分析各因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。
表1 單因素試驗(yàn)分析各因素與水平設(shè)計(jì)
進(jìn)行單因素試驗(yàn)分析時(shí),除試驗(yàn)因素的水平按表1 進(jìn)行,其他因素的水平固定為葛根顆粒大小0.5 cm,提取時(shí)間60 min,提取料液比1∶20,提取溫度80 ℃。
1.3.4 正交試驗(yàn)分析
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定3 個(gè)影響總黃酮提取的主要因素及各個(gè)因素的影響葛根總黃酮得率水平,進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)。
正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。
表2 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)
1.3.5 正交試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證
以正交試驗(yàn)獲得的各個(gè)因素的最佳水平組合為參數(shù),進(jìn)行提取,計(jì)算提取液黃酮質(zhì)量濃度,試驗(yàn)平行進(jìn)行3 次。
數(shù)據(jù)處理軟件Microsift Excel 2010。
2.1.1 葛根顆粒大小對(duì)總黃酮質(zhì)量濃度的影響
葛根顆粒大小對(duì)葛根總黃酮質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖1。
圖1 葛根顆粒大小對(duì)葛根總黃酮質(zhì)量濃度的影響
由圖1 可知,葛根顆粒大小為0.25 cm 時(shí),其提取率為最大,達(dá)到1.6 mg/mL,隨著葛根顆粒的增大,總黃酮質(zhì)量濃度降低,但到1 cm 及以上大小時(shí),其總黃酮的提取率變化趨緩。
2.1.2 提取時(shí)間對(duì)總黃酮質(zhì)量濃度的影響
提取時(shí)間對(duì)葛根總黃酮質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖2。
圖2 提取時(shí)間對(duì)葛根總黃酮質(zhì)量濃度的影響
由圖2 可知,提取時(shí)間在80 min 以?xún)?nèi),葛根總黃酮的質(zhì)量濃度隨提取時(shí)間的增加而升高,但提取到達(dá)100 min,其葛根總黃酮的質(zhì)量濃度反而下降。
2.1.3 料液比對(duì)總黃酮質(zhì)量濃度的影響
料液比對(duì)葛根總黃酮質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖3。
圖3 料液比對(duì)葛根總黃酮質(zhì)量濃度的影響
由圖3 可知,料液比在1∶25 以?xún)?nèi)時(shí),其葛根總黃酮的質(zhì)量濃度隨料液比的降低而升高,在1∶25時(shí)到達(dá)頂峰,最后料液比降低到1∶30 時(shí),葛根總黃酮的質(zhì)量濃度下降。
2.1.4 提取溫度對(duì)總黃酮質(zhì)量濃度的影響
提取溫度對(duì)葛根總黃酮質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖4。
圖4 提取溫度對(duì)葛根總黃酮質(zhì)量濃度的影響
提取溫度對(duì)總黃酮質(zhì)量濃度影響較大,提取溫度越高,總黃酮質(zhì)量濃度越高,其變化規(guī)律具有可預(yù)見(jiàn)性。因此,在正交試驗(yàn)時(shí)將提取溫度設(shè)定為100 ℃。
正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 正交試驗(yàn)結(jié)果
試驗(yàn)采用直觀分析法,對(duì)各因素的K 及R(極差)值的大小進(jìn)行有關(guān)分析可知,極差RA>RB>RC。
因此,用水對(duì)葛根總黃酮進(jìn)行提取時(shí),影響總黃酮質(zhì)量濃度的主要因素為提取時(shí)間,其次是料液比,再次是顆粒大小。再由K 值越大越好得出優(yōu)化后最佳組合為A3B2C1,即提取時(shí)間100 min,料液比1∶25,葛根顆粒大小0.25 cm。
根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果,選取0.25 cm 葛根顆粒,稱(chēng)取5 g 分別放置在3 個(gè)錐形瓶中,按照1∶25 的料液比加入水,在100 ℃下進(jìn)行提取,提取時(shí)間為100 min,提取液自然冷卻后加水補(bǔ)足損失的質(zhì)量,測(cè)定總黃酮質(zhì)量濃度,重復(fù)3 次試驗(yàn),結(jié)果分別為1.274,1.261,1.276 mg/mL,平均總黃酮質(zhì)量濃度為1.27 mg/mL,對(duì)比其各參數(shù)其他水平下所獲得的質(zhì)量濃度,該結(jié)果為最高,表明正交試驗(yàn)方法得當(dāng),結(jié)果可靠。
通過(guò)單因素試驗(yàn)分析影響葛根總黃酮提取的4 個(gè)因素,表明4 個(gè)因素對(duì)于總黃酮質(zhì)量濃度的影響均較大,但是由于溫度越高,質(zhì)量濃度越高,為了提升試驗(yàn)效果,因此在正交試驗(yàn)時(shí)將提取溫度這個(gè)參數(shù)定為100 ℃,以提取時(shí)間、料液比和顆粒大小3 個(gè)因素開(kāi)展三因素三水平正交試驗(yàn)。結(jié)果表明,葛根顆粒大小0.25 cm,料液比1∶25,提取溫度100 ℃,提取時(shí)間為100 min 條件下進(jìn)行提取,獲得葛根總黃酮質(zhì)量濃度為最高,為1.27 mg/mL。
在企業(yè)中以葛根為原料生產(chǎn)相關(guān)的藥品或者食品時(shí),其提取一般按照師傅傳承下來(lái)的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行,參數(shù)為固定的,未進(jìn)行科學(xué)的優(yōu)化。通過(guò)對(duì)葛根提取進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn),能夠提高葛根的利用率,縮短提取時(shí)間,降低能量的消耗,降低企業(yè)的生產(chǎn)成本,提升企業(yè)的效益。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了葛根提取的工藝參數(shù),為后續(xù)葛根酵素的發(fā)酵生產(chǎn)奠定了良好的試驗(yàn)基礎(chǔ)。