復(fù)合酶解法制備海帶浸提液的提取工藝研究

鄧加聰，林丹茹，陳 林， 鄭 虹

（1.福建技術(shù)師范學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，福建福清 350300；2.福建世紀(jì)東潤食品科技有限公司，福建福州 350200）

海帶是一種海洋巨藻，具有很高的營養(yǎng)價值，富含碘、海藻酸、海帶多糖、甘露醇、蛋白質(zhì)、粗纖維、各種微生素及微量元素等對人體身體有益的功能性成分[1-3]。目前，常見的海帶加工食品有鹽漬海帶、即食海帶涼菜、海帶干和海帶結(jié)等[4-7]。

甘露醇在醫(yī)療上可作為利尿劑和脫水劑，用于治療腦積水、動脈硬化、高血壓等疾病，還可作為治療冠心病的特效藥[8-11]；海藻酸鈉鹽在醫(yī)療上，可用于預(yù)防白血病和骨痛病，除此之外還作為穩(wěn)定劑、增稠劑和乳化劑廣泛應(yīng)用于牙膏、冰激凌等行業(yè)中[12-14]；海帶多糖是目前研究較多的一種成分，從海帶中分離出的海帶多糖具有增強(qiáng)免疫力、抗癌和防癌等功效，同時在抗凝血、抗病毒、減肥、降血糖和降血脂等方面具有顯著功效[15-17]。海帶不僅味美，而且其提取產(chǎn)物在醫(yī)藥、化工和食品行業(yè)中都有很大用處，海帶都有廣闊的應(yīng)用前景[18-19]。

目前，海帶中有效產(chǎn)物提取方法主要有水提法、微波提取法、超聲波提取法、酸提取法、酶提取法等[20-23]。與常規(guī)提取法相比，酶解法具有提取率高、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，但是成本較高，因此研究一種高效、低成本的酶解法是目前研究熱點(diǎn)[24-25]。

采用復(fù)合酶法制備海帶浸提液，探究其最佳制備工藝條件，旨在為海帶浸提液的制備研究提供新方法、新思路，為海帶浸提液的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

木瓜蛋白酶（酶活力105U/g）、果膠酶（酶活力105U/g）、蛋白酶（酶活力105U/g），河南正邦實(shí)業(yè)有限公司提供；干海帶，霞浦溢源海洋食品開發(fā)有限公司提供；水楊酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、葡萄糖、硫酸、苯酚、甘露醇等試劑均為分析純，國藥試劑有限公司提供。

1.1.2 儀器與設(shè)備

THZ-C 型臺式恒溫振蕩器，江蘇太倉科技有限公司產(chǎn)品；XL-06A 型多功能粉碎機(jī)，廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司產(chǎn)品；BSA224S 型電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；UV-2100 型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)品；PHS-3C 型酸度計(jì)，上海赫爾普國際貿(mào)易有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同酶類及酶添加量對海帶浸提液制備的影響

分別選用纖維素酶（0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%）、果膠酶（0，0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%）、木瓜蛋白酶（0，0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%）3 種酶對海帶粉進(jìn)行酶解，酶解反應(yīng)初始條件為料液比1∶30（g∶mL），海帶粉用量2 g，酶解液pH 值5.5，酶解溫度55 ℃，酶解時間60 min 后，于100 ℃水浴中滅酶10 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min，測定海帶浸提液中甘露醇、海藻酸及多糖的含量。

1.2.2 復(fù)合酶添加量對海帶浸提液制備的影響

將纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶按8∶2∶3比例進(jìn)行混勻，配成復(fù)合酶。酶解反應(yīng)初始條件為取海帶粉用量2 g，按料液比1∶30（g∶mL），加入一定量的復(fù)合酶（0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%），酶解液pH 值5.5，酶解溫度55 ℃，酶解時間60 min 后，于100 ℃水浴中滅酶10 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min，測定海帶浸提液中甘露醇、海藻酸及多糖的含量。

1.2.3 酶解時間對海帶浸提液制備的影響

取2 g 海帶粉加入蒸餾水60 mL，將酶解液pH值調(diào)至5.5，加入1.5%復(fù)合酶，于55 ℃下酶解一定時間（30，60，120，180，240 min），測定海帶浸提液中甘露醇、海藻酸及多糖的含量。

1.2.4 酶解溫度對海帶浸提液制備的影響

取2 g 海帶粉加入蒸餾水60 mL，將酶解液pH值調(diào)至5.5，加入1.5%復(fù)合酶，于不同溫度（35，40，45，50，55，60 ℃）下酶解90 min，測定海帶浸提液中甘露醇、海藻酸及多糖的含量。

1.2.5 料液比對海帶浸提液制備的影響

取2 g 海帶粉分別加入不同量的蒸餾水（使料液比控制在1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45），酶解液pH 值調(diào)至5.5，加入1.5%復(fù)合酶，于55 ℃下酶解90 min，測定海帶浸提液中甘露醇、海藻酸及多糖的含量。

1.2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對海帶浸提液制備的影響

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取酶解溫度、料液比、酶解時間和復(fù)合酶添加量4 個因素，采用四因素三水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對海帶浸提液制備的影響進(jìn)行探討。

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平設(shè)計(jì)

1.2.7 海帶浸提液中甘露醇的測定采用分光光度計(jì)法測定海帶浸提液中甘露醇提取量[26]。

式中：C——海帶浸提液的甘露醇質(zhì)量濃度，mg/L；

V——測定取樣體積，mL；

F——測定樣品稀釋倍數(shù)；

m——稱取海帶粉質(zhì)量，g。

1.2.8 海帶浸提液中海藻酸的測定

采用分光光度計(jì)法測定海帶浸提液中海藻酸提取量[27]。

式中：C——海帶浸提液的海藻酸質(zhì)量濃度，mg/L；

V——測定取樣體積，mL；

F——測定樣品稀釋倍數(shù)；

m——稱取海帶粉質(zhì)量，g。

1.2.9 海帶浸提液中多糖的測定

采用硫酸-苯酚法測定海帶浸提液中多糖提取量[28]。

式中：C——海帶浸提液的多糖質(zhì)量濃度，mg/L；

V——測定取樣體積，mL；

F——測定樣品稀釋倍數(shù)；

m——稱取海帶粉質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)對海帶浸提效果的影響

2.1.1 不同酶種類及酶用量對海帶浸提效果的影響

不同酶類及添加量對海帶浸提效果的影響見圖1。

圖1 不同酶類及添加量對海帶浸提效果的影響

由圖1（a）可知，當(dāng)纖維素酶添加量為2%時，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖提取量均達(dá)到最大值，因此纖維素酶的最佳添加量為2%；由圖1（b）可知，當(dāng)果膠酶添加量為0.5%時，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖提取量均達(dá)到最大值，因此果膠酶的最佳添加量為0.5%；由圖1（c）可知，當(dāng)木瓜蛋白酶添加量為0.75%時，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖提取量均達(dá)到最大值，因此木瓜蛋白酶的最佳添加量為0.75%。以上酶添加量單因素試驗(yàn)可得，纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的最佳配比為8∶2∶3。

2.1.2 復(fù)合酶添加量對海帶浸提效果的影響

復(fù)合酶添加量對海帶浸提效果的影響見圖2。

圖2 復(fù)合酶添加量對海帶浸提效果的影響

由圖2 可知，隨著復(fù)合酶添加量的增加，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖提取率也逐漸增加，當(dāng)復(fù)合酶添加量為1.5%時，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖提取率達(dá)到最高。因此，復(fù)合酶的添加量為1.5%。

2.1.3 料液比對海帶浸提效果的影響

料液比對海帶浸提效果的影響見圖3。

圖3 料液比對海帶浸提效果的影響

由圖3 可知，海帶的海藻酸、甘露醇和多糖的提取量隨著料液比的增大呈先增后降的趨勢；當(dāng)料液比為1∶35 時，海帶的海藻酸、甘露醇和有機(jī)質(zhì)的提取量均達(dá)到最大，此時提取量分別為260.00，258.80，147.72 mg/g。綜上所述，選擇1∶35 為最佳料液比。

2.1.4 酶解溫度對海帶浸提效果的影響

酶解溫度對海帶浸提效果的影響見圖4。

圖4 酶解溫度對海帶浸提效果的影響

由圖4 可知，過高或過低的酶解溫度，都不利于復(fù)合酶對海帶的酶解，從而影響提取效果。當(dāng)酶解溫度為55 ℃時，海藻酸、甘露醇和多糖的提取量達(dá)到最大。因此，選擇55 ℃為最佳酶解溫度。

2.1.5 酶解時間對海帶浸提效果的影響

酶解時間對海帶浸提效果的影響見圖5。

圖5 酶解時間對海帶浸提效果的影響

由圖5 可知，海藻酸、甘露醇和多糖的提取量隨著酶解時間的延長，逐漸增加；當(dāng)酶解時間為120 min 時，三者得率均達(dá)到最大；之后隨著酶解時間的延長，得率不再增加。因此，酶解最佳時間為120 min。

2.2 正交設(shè)計(jì)對海帶浸提效果的影響

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取酶添加量、料液比、酶解溫度和酶解時間對海帶浸提效果進(jìn)行正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以浸提液中的甘露醇、海藻酸、多糖提取量為考查指標(biāo)。

海帶提取的正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 海帶提取的正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2 可知，各因素對海帶浸提液中甘露醇和多糖提取量的影響最顯著的是料液比（C），之后依次是酶解時間（A）、酶解溫度（B）和復(fù)合酶添加量（D）；而對海藻酸提取量的影響最顯著的是酶解時間（A），之后依次是酶解溫度（B）、料液比（C）和復(fù)合酶添加量（D）。甘露醇、海藻酸和多糖的最佳浸提組合分別是A1B2C2D2、A1B1C2D2、A1B2C3D2。為了更好地確定海帶的最佳浸提條件，對3 種組合進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)。

驗(yàn)證性試驗(yàn)見表3。

表3 驗(yàn)證性試驗(yàn) /mg·g-1

由表3 可知，對甘露醇、海藻酸及多糖含量較高的組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，可確定最佳組合為A1B2C2D2，即復(fù)合酶添加量為1.5%，料液比為1∶35，酶解溫度為55 ℃，酶解時間為90 min，在該酶解條件下，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖的提取量分別為240.19，326.15，126.75 mg/g。

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對復(fù)合酶酶解海帶獲得海帶浸提液的工藝進(jìn)行研究，得到最佳的酶解工藝為復(fù)合酶添加量1.5%，料液比1∶35，酶解溫度55 ℃，酶解時間90 min，在該酶解條件下，海帶浸提液中甘露醇、海藻酸和多糖的提取量分別為240.19，326.15，126.75 mg/g。復(fù)合酶對海帶進(jìn)行酶解，跟傳統(tǒng)的熱水浸提法、酸堿浸提法、單一酶解法等提取方法，具有時間短、提取效率高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，為今后海帶資源的高值化加工提供更廣闊的前景。