基因編輯遞送系統(tǒng)：將“手術刀”送進突變細胞

楊嘉敏 平淵

基因編輯是指特異性改變基因序列，利用酶來對DNA鏈進行剪切，移除已有的DNA片段，或者插入代替的DNA片段的技術。在過去的20多年里，以核酸酶為基礎的基因編輯工具的出現(xiàn)，帶來了基因編輯技術的蓬勃發(fā)展。與傳統(tǒng)的基因編輯技術相比，基于核酸酶的基因編輯技術減少了外源基因的隨機插入，提高了對基因組特定片段進行精確修飾的概率。

基于DNA核酸酶的基因編輯技術發(fā)展迅速，從第一代鋅指核酸酶（zinc-finger nuclease， ZFN）基因編輯系統(tǒng)、第二代轉錄激活因子樣效應物核酸酶[transcription activator-like （TAL） effector nuclease， TALEN]基因編輯系統(tǒng)，到第三代CRISPR/ Cas9系統(tǒng)，基因編輯效率不斷提高，成本不斷降低，應用范圍不斷擴大。

1996年，相關研究團隊將兩種不同的鋅指蛋白（zinc finger protein， ZFP）（負責識別DNA位點）和FokⅠ內切酶的切割區(qū)域（負責切割DNA）連接在一起，構建了ZFN基因編輯系統(tǒng)。該技術使人工定點誘導雙鏈DNA斷裂成為現(xiàn)實，實現(xiàn)了基因編輯技術里程碑式的突破；2001年開始陸續(xù)用于不同物種的基因編輯，不僅可構建基因編輯模式生物，還可用于遺傳育種和基因治療。

然而，ZFN系統(tǒng)存在精準性欠佳和細胞毒性等問題，隨后出現(xiàn)的TALEN基因編輯系統(tǒng)在一定程度上改善了上述問題。和ZFN系統(tǒng)類似，TALEN系統(tǒng)由識別特異DNA序列的轉錄激活效應蛋白（TALEs）及Fok I內切酶組成。該技術設計簡單，大大提高編程性能，自2011年建立后迅速用于構建基因修飾動物模型、遺傳育種和基因治療等領域。

第三代基因編輯技術的出現(xiàn)很快掩蓋了ZFN和TALEN的光芒。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由核酸酶Cas9和特異性識別基因組序列的向導RNA（guiding RNA， gRNA）組成。發(fā)揮DNA剪切功能的Cas9元件是通用的，因此只需要根據靶基因的不同設計相應的gRNA即可，其設計難度和復雜度遠低于ZFN和TALEN，大大拓展了CRISPR/Cas系統(tǒng)的應用前景[1]。2012年，系列體外實驗證明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)用于基因編輯的可能性[1]，2013年，該系統(tǒng)被應用于哺乳動物細胞中基因組的多位點精準編輯[1]，這些發(fā)現(xiàn)引發(fā)了基因編輯研究和應用的爆炸性增長。

基因編輯工具只有被遞送到靶點部位才能真正發(fā)揮作用，其在應用于疾病治療時主要有兩種遞送形式：一是從患者體內提取需要改造的細胞，在體外用基因編輯技術進行工程化改造后，再回輸至患者體內；二是通過各種形式的制劑實現(xiàn)基因編輯系統(tǒng)在體內的遞送，把基因“手術刀”遞送至靶組織或靶細胞中進行治療。

然而，在遞送過程中存在諸多挑戰(zhàn)。首先，為了防止不良反應的產生，需要把基因編輯工具準確遞送體到內的特定部位。筆者團隊曾在2021年開發(fā)了一種具有炎癥靶向性的基因編輯前藥系統(tǒng)[3]，選用一種受小分子調控的Cas9變體，并將這種小分子設計成只有在炎癥環(huán)境中才能被激活的前藥，從而減少了基因編輯治療過程中的組織脫靶問題。其次，基因編輯工具通過細胞膜進入細胞并非易事。對于CRISPR/ Cas系統(tǒng)而言，遞送主要分為gRNA的遞送和Cas蛋白的遞送。其中，gRNA可以直接以RNA形式遞送，或通過質粒DNA形式遞送到體內后再完成轉錄；而Cas蛋白有3種遞送形式：遞送對應的質粒DNA、mRNA或直接遞送蛋白。這些生物大分子由于尺寸問題和特殊的荷電性質，往往需要特定的載體或物理方法來介導進入細胞[4]，如使用病毒載體和非病毒載體、采用顯微注射、電穿孔、基于微流控的技術等物理方法等[5]。

病毒系統(tǒng)是相對來說比較成熟的基因編輯遞送系統(tǒng)，常用的載體有整合酶缺陷型慢病毒載體、腺相關病毒載體和腺病毒載體。

整合酶缺陷型慢病毒載體

整合酶缺陷型慢病毒載體由慢病毒改造而來，由于整合酶缺陷而無法將目的基因整合入宿主的基因組中，具有一定的安全性。這類系統(tǒng)可被用于遞送ZFN基因編輯工具。在體外，整合酶缺陷型慢病毒可通過遞送ZFN基因編輯工具的mRNA和供體DNA模板，在各種細胞中實現(xiàn)基因編輯。然而在某些細胞系內，該系統(tǒng)的編輯效率并不高，同時，其基因編輯效果會隨著靶點細胞的分裂而逐漸減弱[2]。

腺相關病毒載體

腺相關病毒載體是一種含有單鏈線狀DNA的小型無包膜病毒，其基因組中包含兩個反向末端重復序列，通常需要在輔助病毒的幫助下才能發(fā)揮作用。而重組腺相關病毒從野生型腺相關病毒改造而來，傳遞基因時不需要輔助病毒，已被廣泛用于基因編輯系統(tǒng)的體內和體外遞送。有研究表明，在某些情況下，用腺相關病毒載體遞送基因編輯工具的效率高于整合酶缺陷型慢病毒載體[2]，且遞送CRISPR基因編輯工具時可以實現(xiàn)持久的編輯[6]。然而，這類編輯系統(tǒng)的應用也存在一系列的挑戰(zhàn)，如重組腺相關病毒載體所能荷載的基因組大小有限，僅5.0 kb左右，使用時需要控制“貨物”的大小；同時，它的持久編輯功能可能導致CRISPR/ Cas工具過表達，造成脫靶效應；此外，還可能會帶來免疫原性問題，引發(fā)一些免疫毒性[6]。

腺病毒載體

腺病毒載體是一種含雙鏈DNA的病毒，由于感染能力較強、基因不整合到宿主細胞等優(yōu)點，是目前臨床上最常用的基因治療病毒載體。第一項用于人體的基因編輯臨床試驗就是利用的腺病毒載體遞送系統(tǒng)。CCR5是存在于T細胞表面的一種可以協(xié)助HIV病毒入侵的受體，在體外用攜帶ZFN基因編輯工具的載體系統(tǒng)敲除CCR5基因后，產生不會被HIV感染的T細胞。自體移植后，抗HIV小分子藥物治療中斷后，CCR5敲除的T細胞比正常T細胞存活得更好[7]。

非病毒介導的基因編輯遞送系統(tǒng)盡管基因組編輯酶的效率不如病毒遞送方法，但其核酸酶活性具有瞬時優(yōu)勢。更重要的是，與病毒載體不同，非病毒載體可以重復給藥，從而提高基因編輯成功的機會。

物理遞送方法

通過物理方法破壞細胞膜或使之變形，將基因編輯工具遞送到細胞內，常用的物理遞送方法有顯微注射、電穿孔、微流控等。

顯微注射是轉染效率極高的一種遞送方法，且遞送的“貨物”大小不受限制，常用于遞送核酸類大分子，如用微米級別的針頭穿破細胞膜，將可以編碼CRISPR/Cas工具的質粒DNA直接注射到細胞中。該方法還可以用于遞送mRNA等，從而在胞內表達基因編輯工具[5]。

同顯微注射一樣，電穿孔也是較為成熟的物理遞送方法，通過電場作用增加細胞膜的通透性，從而介導DNA、核糖核蛋白復合物等生物大分子進入。研究顯示，與DNA相比，電穿孔方法導入核糖核蛋白復合物時具有更高的效率，且不易形成脫靶。但由于在體內難以控制電穿孔需要的各種參數，該技術目前多被用于體外基因編輯。

基于微流控的技術通過誘導細胞進入小孔徑的通道，造成細胞膜的瞬間形變，從而導入與基因編輯工具相關的生物大分子。相對于電穿孔法，這種通過機械變形來改變細胞膜通透性的方法具有更強的安全性，然而效率相對較低[8]。

合成納米粒遞送載體

除物理方法遞送基因編輯系統(tǒng)外，人工合成的納米材料也可以將基因編輯工具遞送進細胞內，目前研究較多的納米粒載體有脂質體類、聚合物等。

脂質納米粒是一種常見的人工合成基因編輯遞送系統(tǒng)，用于基因編輯遞送的陽離子脂質體通常由三部分組成：陽離子頭部、疏水尾部和兩者之間的連接基團[4]。一般情況下，呈電中性的物質更易穿過細胞膜，而陽離子脂質納米粒不僅以靜電結合力將“貨物”成功裝載，還給“貨物”裝上了一層電中性的偽裝，使得這些生物大分子可以過細胞膜。和病毒載體相似，脂質納米粒應用范圍較廣，可用于體內和體外的基因編輯；不同的是，脂質納米粒免疫原性較弱，相對更為安全[5]。目前，已成功利用脂質納米粒載體向哺乳動物細胞遞送CRISPR/Cas9基因編輯工具。

然而，脂質納米粒載體在遞送過程中也存在一些挑戰(zhàn)。首先，納米顆粒被轉入細胞時會被小泡包裹，進一步發(fā)展成溶酶體，若所遞送的“貨物”無法“逃脫”，則會被分解，繼而失效。其次，基因編輯工具若無法進入細胞核，則不能真正發(fā)揮作用。再次，基因治療需要在靶細胞中發(fā)揮作用[5]。因此，若要實現(xiàn)較高的基因編輯效率，需要對脂質納米粒載體系統(tǒng)進行相關修飾，如用聚乙烯亞胺改變其荷載能力、用二油?；字Ｒ掖及吩鰪娭|體的膜融合能力，或用靶向肽增加其靶向能力等。

除了脂質納米粒載體，以高分子水凝膠納米顆粒、金納米粒、石墨烯氧化物、黑磷納米薄片等材料為基礎的人工合成的聚合物也在基因編輯遞送方面有所應用[9]。例如，合成能夠實現(xiàn)多功能核定位的核殼人工病毒，利用其裝載表達CRISPR/Cas9質粒，可實現(xiàn)特定基因的敲除；合成可生物降解的多肽和多糖雜交載體，利用其遞送CRISPR/Cas9質?；騧RNA和sgRNA復合物，可靶向巨噬細胞進行基因編輯等。然而，脂質納米粒和聚合物納米粒易對細胞造成損害，且存在體內基因編輯效率較低等問題。

基因編輯效率高的病毒載體存在脫靶和安全性問題，而安全性相對較高的非病毒載體的遞送效率又不高。因此近年來，科學家將目光放在了病毒樣顆粒上。

病毒樣顆粒是指保留了病毒的部分結構（如包膜和衣殼），但不具有病毒基因組的載體系統(tǒng)，可以實現(xiàn)mRNA、蛋白質及核糖核蛋白復合物的胞內遞送。目前，病毒樣顆粒大多由慢病毒改造而來，其中HIV-1是最常用的慢病毒。Gag蛋白是HIV-1的主要結構蛋白。研究人員用HIV-1蛋白酶剪切連接子將Cas9和Gag蛋白連接起來，利用病毒樣顆粒和T細胞之間的親和力，實現(xiàn)了對T細胞的靶向基因編輯。

相比于傳統(tǒng)的病毒載體，病毒樣顆粒不包含病毒的遺傳物質，不會將外源DNA整合到宿主基因組，也不會引起感染，可能比其他使用實際病毒的遞送方法更安全。同時，這種遞送系統(tǒng)往往保留和病毒侵染、釋放相關的蛋白質，可以達到比較高的遞送效率，為基因編輯工具的體內精準應用又增添了一絲曙光。

目前，大量基于基因編輯的治療方法正在全球范圍內開展臨床試驗，為癌癥、心血管疾病、神經病變、代謝類疾病、眼部疾病等疑難雜癥提出了許多潛在的治療方案。美國研發(fā)的NTLA-2001基因編輯療法在治療轉甲狀腺素蛋白淀粉樣變性患者的臨床I期試驗中，取得了令人振奮的結果；Editas公司開發(fā)的基因編輯療法EDIT-301也在進行人體臨床研究，有望治療鐮狀細胞病與輸血依賴性β地中海貧血癥；基于CRISPR技術改造的CAR-T細胞療法CTX110得到美國FDA授予的再生醫(yī)學先進療法認定，用于治療復發(fā)或難治性CD19+B細胞惡性腫瘤。

基因編輯技術有巨大的臨床應用潛力，然而，想要將這把“手術刀”安全地用于治療時，仍有許多問題需要解決。例如，有些疾病涉及的細胞更新速度很快，而目前的基因編輯技術多用于可以持久發(fā)揮療效的永生細胞；治療有些疾病時需要編輯大量的基因，而目前的基因編輯遞送技術無法實現(xiàn)這樣的效率；基因編輯遞送方法眾多，但并沒有哪種方法是絕對完美的，仍需要去選擇平衡其編輯效率、安全性和靶向性。不過，基因編輯遞送系統(tǒng)的發(fā)展速度十分迅速，我們有理由相信，未來會有更多精準、有效、安全的基因編輯療法出現(xiàn)，越來越多的疾病將找到合適的治療方法。

[1]Lander E S. The heroes of CRISPR. Cell， 2016.

[2]Yin H， Kauffman K J， Anderson D G. Delivery technologies for genome editing. Nature Reviews Drug Discovery， 2017，16（6）： 387-399.

[3]Yan X， Pan Q， Xin H， et al. Genome-editing prodrug： Targeted delivery and conditional stabilization of CRISPR-Cas9 for precision therapy of inflammatory disease. Science Advances， 2021，7（50）： j624.

[4]Yin H， Kanasty R L， Eltoukhy A A， et al. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature Reviews Genetics， 2014，15（8）： 541-555.

[5]Lino C A， Harper J C， Carney J P， et al. Delivering CRISPR： a review of the challenges and approaches. Drug Deliv， 2018， 25（1）： 1234-1257.

[6]Wang D， Zhang F， Gao G. CRISPR-based therapeutic genome editing： Strategies and in vivo delivery by AAV vectors. Cell， 2020， 181（1）： 136-150.

[7]van Haasteren J， Li J， Scheideler O J， et al. The delivery challenge： fulfilling the promise of therapeutic genome editing. Nature Biotechnology， 2020， 38（7）： 845-855.

[8]Han X， Liu Z， Jo M C， et al. CRISPR-Cas9 delivery to hard-totransfect cells via membrane deformation. Sci Adv， 2015， 1（7）： e1500454.

[9]Wan T， Niu D， Wu C， et al. Material solutions for delivery of CRISPR/Cas-based genome editing tools： Current status and future outlook. Materials Today， 2019， 26： 40-66.

關鍵詞：基因編輯 遞送系統(tǒng) 病毒 合成納米粒 ■