仙茅有效成分含量與土壤因子相關(guān)性研究

王樹(shù)生，楊軍文，鄧重梨，張金渝，楊美權(quán)，鄧國(guó)賓*

（1.西南林業(yè)大學(xué) 生物多樣性保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650224； 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 藥用植物研究所，云南 昆明 650205）

仙 茅（Curculigo orchioidesGaertn）為 石 蒜 科（Amaryllidaceae） 草本植物，分布于我國(guó)四川和云南等地，是我國(guó)傳統(tǒng)藥用植物之一。仙茅常以其根莖入藥，用于腎虛陽(yáng)痿、滑精遺精、精冷不育、腰膝冷痛、寒濕痹痛、尿頻遺尿等癥狀的治療［1-2］?，F(xiàn)代藥理研究表明，仙茅主要化學(xué)成分有酚類、酚苷類、木脂素類、三萜皂苷類、黃酮類、生物堿類等［3］，具有抗氧化、抗炎癥、調(diào)節(jié)免疫和抗骨質(zhì)疏松等作用［4］。近年來(lái)，仙茅已經(jīng)逐漸被開(kāi)發(fā)為各種臨床用藥和保健品，這使得野生仙茅資源面臨枯竭。人工栽培代替野生藥材已成發(fā)展趨勢(shì)，但盲目的人工栽培導(dǎo)致其品質(zhì)參差不齊、質(zhì)量穩(wěn)定性差，難以滿足藥材內(nèi)在質(zhì)量的要求。因此，如何在滿足市場(chǎng)需求的同時(shí)保證仙茅藥材的質(zhì)量成為仙茅藥材栽培的重要任務(wù)。研究表明，中藥材品質(zhì)主要與遺傳因素和生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān)。藥用植物中有效成分的形成與積累受環(huán)境因素的影響較大，除了受氣候季節(jié)變化的影響外，還受土壤中礦物質(zhì)種類和土壤肥力等因素的影響。環(huán)境因素是中藥材形成道地性的重要原因，影響藥材的生長(zhǎng)發(fā)育和次生代謝物質(zhì)的積累，對(duì)藥材質(zhì)量有重要影響［5-7］。Lang 等研究表明，阿勒泰地區(qū)3 種典型的藥用多年生草本植物甘草、大黃、澤瀉與土壤中的氮、磷、鉀以及有機(jī)質(zhì)等存在不同程度相關(guān)性［8］。Yuan等研究發(fā)現(xiàn)，土壤pH、全氮、全磷和有效磷是影響栽培鐵皮石斛主要藥用品質(zhì)的關(guān)鍵因子［9］。因此，明確土壤因子與仙茅藥材質(zhì)量之間關(guān)系，是揭示藥材有效成分成因和提高品質(zhì)的關(guān)鍵［10-11］。

近年來(lái)，對(duì)仙茅的研究多集中在化學(xué)成分分析和藥理作用等方面［12-13］，鮮見(jiàn)關(guān)于其有效成分含量與土壤因子相關(guān)性的研究報(bào)道。鑒于此，本研究以20 個(gè)野生種群仙茅及其根際土壤為實(shí)驗(yàn)材料，分析了旨在為仙茅科學(xué)種植、品質(zhì)提升和藥用價(jià)值保護(hù)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

2021年9月于仙茅采收期在云南文山、臨滄、西雙版納和四川宜賓采集20 個(gè)野生種群仙茅根莖及其根際土壤樣品。每個(gè)種群采集5株長(zhǎng)勢(shì)較為均一且健康的仙茅根莖，采樣時(shí)先去除土壤表層的腐殖質(zhì)及枯枝落葉層，挖取完整的仙茅根莖，采用抖根法收集根際土壤，將土壤樣品等量混合，混合后的土壤樣品和根莖樣品分別裝入無(wú)菌塑封袋內(nèi)。仙茅根莖經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所張金渝研究員鑒定為石蒜科仙茅屬植物仙茅的根莖。把樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，土壤樣品自然風(fēng)干后研磨過(guò)篩，密封保存，用于理化性質(zhì)測(cè)定；仙茅根莖經(jīng)蒸餾水洗凈后自然風(fēng)干，稱取質(zhì)量，粉碎后密封保存?zhèn)溆?。其他信息詳?jiàn)表1。

表1 采樣信息Tab.1 Geographic of the sample acquisition information

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑

U3000 型Thermo 高效液相色譜儀［賽默飛世爾（中國(guó)）有限公司］；SP-7560 型紫外分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；LXJ-IIB 型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；AU-S2 型純水機(jī)（四川科瑞峰環(huán)境科技有限公司）；PHS-3C 型pH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；FP6140型火焰光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司）；WFX-1308型原子吸收分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器有限公司）；K9840 型凱氏定氮儀（濟(jì)南海能未來(lái)技術(shù)集團(tuán)股份有限公司）；KQ-500DE 型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；BSA224S-CW 型分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；HH-S8 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金怡儀器科技有限公司）；HY-1 型渦旋儀（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾器（天津市騰達(dá)過(guò)濾器件網(wǎng)）。

試劑：無(wú)水乙醇為優(yōu)級(jí)純，乙腈和甲醇均為色譜純，以上試劑均購(gòu)自隴西化工；純水為實(shí)驗(yàn)室自制。蘆丁（批號(hào)：MUST-21011510，成都曼斯特生物科技有限公司；純度≥98%），沒(méi)食子酸（批號(hào)：21080585，壇墨質(zhì)檢標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；純度≥98%），仙茅苷（批號(hào)：B21352，上海源葉生物科技有限公司；純度≥9%）。

1.2.2 仙茅有效成分含量測(cè)定

按照《中國(guó)藥典》2020 版（一部）仙茅項(xiàng)下的高效液相色譜法對(duì)仙茅苷進(jìn)行測(cè)定，色譜條件：C18（5 μm × 4.6 mm × 250 mm），以乙腈-0.1%磷酸溶液（21∶79）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm，理論板數(shù)按仙茅苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000［2］；總黃酮［14］和總多酚［15］均采用紫外分光光度計(jì)法進(jìn)行測(cè)定。每個(gè)樣品進(jìn)行2次重復(fù)。

1.2.3 土壤因子含量測(cè)定

參照《土壤農(nóng)化分析方法》［16］測(cè)定土壤樣品中的pH 值、有機(jī)質(zhì)、全鉀、速效鉀、緩效鉀、全氮、堿解氮、全磷、有效磷、交換性鈣和交換性鎂，以上每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和整理，分別采用SPSS 23.0、 DPS 7.05 和Origin 2018 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、聚類分析以及圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 仙茅有效成分含量分析

依據(jù)1.2.2 所述方法對(duì)20 個(gè)不同居群仙茅樣本中仙茅苷、總黃酮和總多酚等有效成分含量進(jìn)行測(cè)定，其結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 仙茅有效成分含量測(cè)定Tab.2 The determination of the content of active ingredients in C.orchioides

通過(guò)對(duì)20 個(gè)不同居群仙茅有效成分的含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)（表2），仙茅苷、總黃酮、總多酚3種有效成分含量均存在一定差異（P＜0.05），且不同成分間的差異程度也不同。所有樣品的仙茅苷含量均符合2020 年版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)（不少于0.10%），其含量在0.10% ～ 0.37%之間，平均值為0.25%，其中YWS-02 樣品中的仙茅苷含量最高，是YBN-01 樣品（最低）的3.7倍。總黃酮含量在7.97 ～ 23.01 mg/g之間，平均值為14.61 mg/g，其中SYB-01 樣品中的總黃酮含量最高，是YLC-05 樣品（最低）的2.89 倍?？偠喾雍吭?.81 ～ 17.24 mg/g之間，平均值為9.11 mg/g，其中SYB-01 樣品中的總多酚含量最高，是YLC-05樣品（最低）的2.97 倍。從變異系數(shù)來(lái)看，各有效成分變異系數(shù)為27.77% ～ 36.00%，均處于中等變異范圍（10% ～ 100%）內(nèi)，說(shuō)明不同居群間仙茅有效成分含量濃度存在一定差異，品質(zhì)相對(duì)不穩(wěn)定。

2.2 土壤理化性質(zhì)分析

20 個(gè)不同居群仙茅土壤因子含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。根據(jù)全國(guó)第二次土壤普查養(yǎng)分分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（表4），分析仙茅生長(zhǎng)地土壤的養(yǎng)分特征。結(jié)果顯示：土壤pH 值為3.9 ～ 6.6，平均值為5.01，其中表明所有土壤樣品屬于酸性土壤。有機(jī)質(zhì)含量為14.10 ～177.76 g/kg，其中YLC-05 樣品中的有機(jī)質(zhì)含量最高，是SYB-01 樣品（最低）的12.60 倍。參考全國(guó)土壤養(yǎng)分含量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，除SYB-05、YBN-02、SYB-02和SYB-01外，大部分居群的土壤有機(jī)質(zhì)含量為1級(jí)或2 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬于豐富至極豐富水平。有效磷含量為0.20 ～ 16.30 mg/kg，其中YBN-05 樣品中的有效磷含量最高，是YWS-01 樣品（最低）的80.50 倍，僅有YBN-05 樣本為3 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)屬于中等水平，其余樣本均為4 級(jí)至6 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬于缺乏至極缺乏水平。全磷含量為0.12 ～ 1.62 g/kg，其中YBN-01樣品中的全磷含量最高，是YLC-04 樣品（最低）的13.03 倍，大部分樣本為3 級(jí)或4 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬于中等或缺乏水平。全氮含量為1.22 ～ 163.57 g/kg，其中SYB-03 樣品中的全氮含量最高，是YBN-02 樣品（最低）的134.40 倍，大部分樣本為1 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬于極豐富水平，部分樣本為2 級(jí)或3 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬于豐富或中等水平。堿解氮含量為0.22 ～ 849.00 mg/kg，其中YLC-01 樣品中的堿解氮含量最高，是SYB-01 樣品（最低）的3 807.17 倍，除SYB-05、SYB-03、SYB-04、SYB-02 和SYB-01 樣本外，其余樣本均為1 級(jí)至3級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬于為中等至極豐富水平。全鉀含量為4.90 ～ 47.00 g/kg，其中YBN-01 樣品中的全鉀含量最高，是YBN-03 樣品（最低）的9.59 倍，僅有YBN-03 樣本為6 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬于極缺乏水平，其余樣本1 級(jí)至5 級(jí)均有分布，屬于缺乏至極豐富水平。速效鉀含量為6.33 ～ 228.33 mg/kg，其中YLC-01 樣品中的速效鉀含量最高，是YBN-03 樣品（最低）的36.05倍，YLC-01 樣本為1 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬于極豐富水平，YWS-05 和YBN-03 為6 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬于極缺乏水平，其余樣本集中在2 級(jí)至5 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬于較缺乏至豐富水平。緩效鉀含量為23.33 ～ 2 564.00 mg/kg，其中YLC-01 樣品中的緩效鉀含量最高，是SYB-03 樣品（最低）的109.89 倍，YWS-05 和YBN-05 為5 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬于較缺乏水平，YBN-03 和SYB-03 為6 級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬于較缺乏水平，其余樣本為1 級(jí)至四級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬于缺乏至極豐富水平。交換性鈣含量為158.37 ～1 526.80 mg/kg，其中SYB-01 樣品中的交換性鈣含量最高，是YLC-04 樣品（最低）的9.64 倍；交換性鎂含量為0.27 ～ 5.23 mg/kg，其中YLC-01 樣本中的交換性鎂含量最高，是SYB-01樣本（最低）的19.16倍。

表3 各土壤因子含量測(cè)定Tab.3 Determination of the content of soil factors

表4 土壤養(yǎng)分含量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)Tab.4 Grading standards for soil nutrient content

從變異系數(shù)來(lái)看，pH 值變異系數(shù)為12.86%，變異程度較小。有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮、有效磷、堿解氮、全鉀、速效鉀、緩效鉀、交換性鈣、交換性鎂均有不同程度變異，變異范圍為48.90% ～ 170.65%。其中變異程度最大的是全氮，變異系數(shù)為170.67%。結(jié)果表明，野生仙茅主要分布在略偏酸性土壤，且除pH外，其余土壤指標(biāo)含量在不同居群及同一居群內(nèi)均存在顯著差異。

2.3 土壤聚類分析

以20 個(gè)不同居群仙茅11 個(gè)土壤因子含量為變量，采用系統(tǒng)聚類法對(duì)居群進(jìn)行分析（圖1），發(fā)現(xiàn)當(dāng)閾值為10 時(shí)，20 個(gè)不同居群土壤因子可以分為3組：第一類是將 YLC-01 單獨(dú)聚為一類，第二類為YLC-02、YLC-03、YLC-04、YLC-05，第三類將其余樣本分為一類。分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)， YLC-01 樣品的堿解氮、速效鉀、緩效鉀和交換性鎂的含量顯著高于其他樣本，所以單獨(dú)聚為一類；而YLC-02、YLC-03、YLC-04、YLC-05 樣本的有機(jī)質(zhì)、堿解氮、和交換性鎂含量較高，全磷和交換性鈣含量較低，所以聚為第二類；第三類樣本中各土壤因子含量互有高低，而且并無(wú)規(guī)律所以聚為一類。

圖1 土壤因子聚類分析Fig.1 Cluster analysis of soil factors

2.4 土壤因子相關(guān)性分析

對(duì)11 個(gè)土壤因子含量進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果顯示（圖2），交換性鈣與全氮、全鉀均呈極顯著正相關(guān)；緩效鉀與速效鉀呈極顯著正相關(guān)；交換性鎂與全磷、交換性鈣呈極顯著負(fù)相關(guān)，與速效鉀、緩效鉀呈極顯著正相關(guān)；有機(jī)質(zhì)與交換性鈣呈顯著正相關(guān)，與交換性鎂呈顯著負(fù)相關(guān)；堿解氮與全氮呈顯著負(fù)相關(guān)，與交換性鈣呈極顯著負(fù)相關(guān)，與速效鉀呈顯著正相關(guān)，與緩效鉀、交換性鎂、有機(jī)質(zhì)均呈極顯著正相關(guān)；pH與全氮呈顯著負(fù)相關(guān)。綜上所述，土壤養(yǎng)分之間存在顯著或極顯著相關(guān)性，說(shuō)明仙茅土壤因子間可能存在著不同程度的促進(jìn)或抑制作用。

圖2 土壤因子相關(guān)性Fig.2 Pearson analysis of soil factors

2.5 仙茅有效成分含量和土壤因子灰色關(guān)聯(lián)度分析

利用數(shù)據(jù)分析軟件DPS 7.05 對(duì)仙茅有效成分含量與土壤因子進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。仙茅有效成分含量與土壤因子的灰色關(guān)聯(lián)值越高，說(shuō)明這些土壤因子與仙茅的各個(gè)有效成分含量關(guān)系越密切。

圖3 仙茅有效成分含量與土壤因子的灰色關(guān)聯(lián)值Fig.3 Grey correlation value between chemical composition contents and soil factors of C. orchioides

結(jié)果顯示，影響仙茅苷含量的土壤因子關(guān)聯(lián)度從高到低依次為：海拔＞pH＞速效鉀＞有效磷＞全鉀＞有機(jī)質(zhì)＞交換性鎂＞交換性鈣＞全磷＞水解性氮＞緩效鉀＞全氮；從總黃酮含量來(lái)看：pH＞全磷＞全鉀＞交換性鈣＞海拔＞緩效鉀＞速效鉀＞有效磷＞有機(jī)質(zhì)＞水解性氮＞交換性鎂＞全氮；從總多酚含量來(lái)看：pH＞全磷＞交換性鈣＞全鉀＞海拔＞有機(jī)質(zhì)＞水解性氮＞速效鉀＞緩效鉀＞有效磷＞交換性鎂＞全氮。綜合來(lái)看，海拔、pH、全鉀、全磷、有機(jī)質(zhì)、交換性鈣是影響仙茅有效成分的重要影響因素。

2.6 仙茅有效成分含量和土壤因子相關(guān)性分析

為進(jìn)一步確定影響仙茅有效成分的土壤因子，在灰色關(guān)聯(lián)度分析的基礎(chǔ)上，對(duì)仙茅的3 個(gè)有效成分含量與11 個(gè)土壤因子含量進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析。由圖4可知，仙茅苷與全磷、交換性鈣呈顯著負(fù)相關(guān)，與海拔呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；總黃酮與有機(jī)質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)，與全鉀呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；總多酚與土壤因子相關(guān)性不顯著。研究結(jié)果顯示，全鉀和海拔對(duì)促進(jìn)仙茅有效成分的形成和積累有積極作用，有機(jī)質(zhì)、全磷和交換性鈣對(duì)仙茅有效成分的形成和積累則是抑制作用。

3 討論與結(jié)論

仙茅的化學(xué)成分主要為酚及酚苷類、木脂樹(shù)及其三苷類、黃酮類、生物堿、多糖等［18］。仙茅根莖中很多化學(xué)成分都具有藥理活性，如仙茅苷具有抗炎［19］、抗氧化、預(yù)防骨質(zhì)疏松等藥理作用［20］；仙茅素A具有一定的補(bǔ)腎壯陽(yáng)作用［21］；Crassifoside G 等8種酚及酚甘類化合物具有很強(qiáng)的氧化活性［22］；黃酮具有保護(hù)心血管、抗氧化、降血糖等多種藥理活性［23］。上述成分是仙茅發(fā)揮藥理作用的有效成分，其含量高低決定了仙茅的品質(zhì)，探討其有效成分形成和積累的影響因素對(duì)調(diào)控其有效含量具有重要價(jià)值。

生態(tài)因子是影響藥材藥效成分含量的重要因素，包括氣候因子、土壤因子及地理因素等［24］。其中土壤是植物生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)，土壤的物理、化學(xué)性質(zhì)以及所含的各種元素對(duì)藥材生長(zhǎng)發(fā)育及次生代謝物積累均具有重要影響［25］。因此，研究土壤因子對(duì)藥材質(zhì)量的影響對(duì)于高品質(zhì)藥材的生產(chǎn)具有十分重要的意義。該研究對(duì)20 個(gè)不同居群仙茅有效成分含量及其土壤因子含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)它們之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，不同地區(qū)仙茅所生長(zhǎng)的土壤呈酸性，該研究結(jié)果與前人研究報(bào)道一致［26］。土壤中有機(jī)質(zhì)、全氮、堿解氮和緩效鉀含量豐度較高，全磷、全鉀含量豐度中等，有效磷、速效鉀含量豐度較低，且土壤因子之間存在不同程度的相關(guān)。聚類分析表明，20 個(gè)不同居群土壤被分為3個(gè)組，這種結(jié)果很有可能是由于經(jīng)緯度、海拔和氣候等因素綜合影響，導(dǎo)致各采樣點(diǎn)的土壤屬性等顯現(xiàn)出較大差別。

灰色關(guān)聯(lián)度分析法結(jié)果顯示，海拔、pH、速效鉀、全鉀、全磷、交換性鈣是影響仙茅有效成分的重要影響因素。相關(guān)性分析表明，全鉀和海拔對(duì)促進(jìn)仙茅有效成分的形成和積累有積極作用，有機(jī)質(zhì)、全磷和交換性鈣對(duì)仙茅有效成分的形成和積累則是負(fù)作用。在影響仙茅有效成分的多個(gè)土壤因子中，鉀作為品質(zhì)元素可顯著提升作物的抗性和品質(zhì)，提高藥用植物中黃酮類成分的含量［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，全鉀與總黃酮呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明鉀在仙茅總黃酮的合成和含量累積以及抗逆性方面具有積極作用。土壤中的磷對(duì)根的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的作用［28］，因此對(duì)于仙茅根莖的生長(zhǎng)發(fā)育以及有效成分的合成與累積具有重要影響。有機(jī)質(zhì)和陽(yáng)離子交換量反映了土壤肥力水平和保肥能力，是藥用植物生長(zhǎng)所需的各種養(yǎng)分的重要來(lái)源［7，29］，但有研究表明高肥力不利于地下部品質(zhì)改善和提高［30］，可能是有機(jī)質(zhì)含量過(guò)高不利于仙茅有效成分積累的原因。海拔是藥用植物生長(zhǎng)環(huán)境中的重要生態(tài)因子之一，不同的海拔具有不同的溫度、光照、土壤條件和空氣等其他生態(tài)因子，高海拔利于功效成分的合成與積累［31］，本研究結(jié)果顯示海拔與仙茅有效成分呈正相關(guān)，說(shuō)明適宜的生長(zhǎng)環(huán)境能促進(jìn)仙茅的生長(zhǎng)，從而形成優(yōu)質(zhì)的藥材?？偠喾优c土壤因子相關(guān)性不顯著，其原因需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，仙茅不同有效成分含量受土壤影響程度不同，其主要影響因素也不同，是多個(gè)因素綜合影響的結(jié)果。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)重視生態(tài)因子和土壤環(huán)境對(duì)仙茅藥材質(zhì)量的影響，種植過(guò)程中可通過(guò)適當(dāng)控制有機(jī)質(zhì)、全磷和交換性鈣的含量，合理增施鉀肥等措施促進(jìn)仙茅有效成分的形成和含量的積累。