高效液相色譜法測定香花秋海棠藥用成分含量

陶仕珍，羅 茜，張靜美，劉 強(qiáng)*

（1.云南林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明650224；2.云南現(xiàn)代民族藥工程技術(shù)研究中心，云南 昆明650501）

秋海棠屬（Begonia）植物種類繁多，分布廣泛，位列全世界第6 大被子植物科屬，目前全世界對秋海棠屬的研究、開發(fā)和應(yīng)用主要集中在系統(tǒng)分類學(xué)、地理分布、分子生物學(xué)、資源保護(hù)和園藝觀賞等方面［1］。在我國，對秋海棠屬植物的傳統(tǒng)利用，除了觀賞應(yīng)用外，在其產(chǎn)地還將它們作藥用、食用［2］。管開云等［2］對國產(chǎn)26種秋海棠的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，有24種作藥用，其中8種既被作為民間中藥、野生蔬菜和飲料，也被作為飼料加以利用，其中香花秋海棠有藥用的記錄，可用于止癢，治療皮膚疥瘡，在廣西、廣東以全草入藥，云南僅以根莖入藥。在我國220多種秋海棠中有藥用用途記載的就有32種，既有內(nèi)服、也有外用［3］。目前從秋海棠屬幾種植物全草或根莖中分離得到的主要化學(xué)成分有黃酮類、皂苷、強(qiáng)心苷、甾醇等，有關(guān)秋海棠屬植物成分的研究還較少，應(yīng)加強(qiáng)對秋海棠屬植物化學(xué)成分、藥理作用、活性成分等方面的研究，才能更廣泛地開發(fā)其藥用、食用價值［4］。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載，香花秋海棠全草可利咽、消食、消腫，用于咽喉腫痛、食滯、跌打損傷［5］，還可用于清熱散瘀、消食健胃［3］，但對其生藥成分的測定至今未見報道。

高效液相色譜（High performance liquid chromatography， HPLC）法是化學(xué)化工和藥物行業(yè)最常用的儀器分析手段，由于其具有高壓強(qiáng)、高效率、高速度、高靈敏度、操作方便、極易回收、可降低樣品消耗量等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于中藥材活性成分測定［6，7］，在秋海棠屬藥材含量的測定中也有應(yīng)用［8-10］。本研究采用HPLC法對香花秋海棠中黃酮類、酚酸類化學(xué)成分的含量進(jìn)行測定，以期深入了解香花秋海棠生藥成分和藥用價值，為其藥用資源的開發(fā)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 試藥

香花秋海棠（Begonia handelii），又叫大香秋海棠、短莖秋海棠，為秋海棠科（Begoniaceae）秋海棠屬植物，是多年生肉質(zhì)草本，根狀莖匍匐，無直立莖，雌、雄異株，花呈白色或粉紅色，有芳香氣味。生長于海拔100～1 500 m 的森林里遮蔽潮濕的環(huán)境中；在我國主要分布于云南、廣東、廣西、海南；國外在老撾、緬甸、泰國、越南也有分布［11-12］。本實(shí)驗(yàn)所用樣品香花秋海棠材料來自于云南林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院金殿校區(qū)林木種苗培育溫室內(nèi)扦插繁殖的植株。

1.2 試劑耗材

甲醇（批號： 1107720708）和乙腈（批號： 210365）均購自默克股份兩合公司，甲醇和乙腈均為色譜純。對照品信息：蘆?。ㄅ枺?100080-20181，純度：91.7%）和兒茶素（批號： 110877-202005，純度：95.1%）購自中國食品藥品檢定研究院，表兒茶素（批號： 80460050）購自詩丹德，原兒茶酸（批號： C12977937，純度：97.0%）和原兒茶醛（批號： C12326334，純度：98.0%）購自麥克林。微孔濾膜0.45 μm。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件

色譜柱： Z0RBAX SB-Aq（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流動相： 表兒茶素、蘆丁測定為乙睛 ∶ 0.2%冰醋酸水溶液 = 18 ∶ 82，原兒茶酸、原兒茶醛、兒茶素測定為乙睛 ∶ 0.2%冰醋酸水溶液 = 32 ∶ 68； 流速： 1 mL/min；檢測波長： 280 nm；柱溫： 25℃；進(jìn)樣量： 10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備溶液的制備

精密稱取對照品原兒茶酸11.94 mg，原兒茶醛10.82 mg，兒茶素5.50 mg，表兒茶素10.47 mg，蘆丁10.15 mg，分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制得儲備液。

2.2.2 對照品溶液的制備

分別精密量取原兒茶酸對照品儲備液330 μL，原兒茶醛對照品儲備液110 μL，兒茶素對照品儲備液1 mL，表兒茶素對照品儲備液0.5 mL，蘆丁對照品儲備液60 μL置于同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得含有原兒茶酸38.219 94 μg/mL、原兒茶醛11.663 96 μg/mL、兒茶素52.305 00 μg/mL、表兒茶素52.350 00 μg/mL 和蘆丁5.584 53 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

精密稱取香花秋海棠藥材粉末5.0 g 置于具塞錐形瓶中，準(zhǔn)確加入200 mL 70%甲醇溶液，水浴回流提取1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加適量的水溶解，過聚酰胺柱（0.600 mm ～ 0.150 mm，柱內(nèi)徑1.5 cm，濕法裝柱），分別用水、95%乙醇各100 mL洗脫，收集乙醇洗脫液，回收溶劑至干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，通過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，可得供試品溶液。

2.3 測定方法

參照蔣佳雯和劉卉等人建立的秋海棠屬植物成分測定方法［8，9］，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測定。根據(jù)公式（1）計算得測定樣品各成分含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各對照品溶液的峰面積

各對照品溶液重復(fù)測定6 次峰面積取平均值，見表1。各對照品平均峰面積用于計算供試樣品的對應(yīng)成分含量。

表1 對照品溶液的峰面積測定Tab.1 Mean peak areas of control samples

3.2 香花秋海棠莖5種藥用成分含量

取雙樣，同時對香花秋海棠莖的化學(xué)成分峰面積進(jìn)行兩次重復(fù)測定，通過與對照品進(jìn)行比對，檢測出5 種化學(xué)成分分別是蘆丁、表兒茶素、兒茶素、原兒茶酸、原兒茶醛，經(jīng)上述公式計算各成分的含量，取其平均值，相對偏差為0.00%～0.15%，均 ＜ 2%，測定結(jié)果有效，見表2。

表2 香花秋海棠莖5種藥用成分含量測定Tab.2 Determination of five medicinal ingredients in the stems of Begonia handelii

3.3 香花秋海棠葉5種藥用成分含量

取雙樣，同時對香花秋海棠葉的化學(xué)成分峰面積進(jìn)行兩次重復(fù)測定，通過與對照品進(jìn)行比對，檢測出4 種化學(xué)成分分別是蘆丁、兒茶素、原兒茶酸、原兒茶醛，經(jīng)上述公式計算各成分的含量，取其平均值，相對偏差為0.01% ～ 0.12%，均 ＜ 2%，未檢測出表兒茶素，測定結(jié)果有效，見表3。

表3 香花秋海棠葉5種藥用成分含量測定Tab.3 Determination of five medicinal ingredients in the leaves of Begonia handelii

4 討論

4.1 香花秋海棠的5種藥用成分分析

經(jīng)HPLC 法測定，檢測出香花秋海棠莖中的黃酮類化學(xué)成分3 種，分別為蘆?。–27H30O16）、表兒茶素（C15H14O6）、兒茶素（C15H14O6）；酚酸類化學(xué)成分2種，分別為原兒茶酸（C7H6O4）和原兒茶醛（C7H6O3）。葉中的黃酮類化學(xué)成分2種，分別為蘆丁和兒茶素；酚酸類化學(xué)成分2種，分別為原兒茶酸和原兒茶醛。

檢測出莖中5 種藥用成分的含量分別為蘆丁2.17 μg/g、表兒茶素1.11 μg/g、兒茶素2.73 μg/g、原兒茶酸4.56 μg/g、原兒茶醛1.08 μg/g；葉中只檢測出4 種藥用成分的含量，分別是蘆丁13.44 μg/g、兒茶素4.02 μg/g、原兒茶酸2.01 μg/g、原兒茶醛5.86 μg/g，未檢測出表兒茶素。從測定的數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，莖、葉中各成分含量差異明顯：蘆?。ㄈ~） ＞ 蘆?。ㄇo），兒茶素（葉） ＞ 兒茶素（莖），原兒茶醛（葉） ＞ 原兒茶醛（莖），原兒茶酸（葉） ＜ 原兒茶酸（莖），表兒茶素只在莖中檢測到，見表2、表3。將香花秋海棠莖、葉混合使用藥效成分比單一使用豐富，且各成分含量也增高，有利于提高用藥療效。

蘆丁具有抗病毒、抑菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、清除自由基、增強(qiáng)免疫力、抗衰老、抗脂質(zhì)過氧化、抗急性胰腺炎、抗自由基活性等作用［13-14］。表兒茶素及兒茶素具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、保護(hù)心血管、調(diào)節(jié)糖脂代謝、調(diào)節(jié)免疫力、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等作用［15-16］。原兒茶酸具有抗氧化、抗炎、抗高血糖、抗纖維化以及保護(hù)心血管和神經(jīng)系統(tǒng)的作用，還有抗菌、祛痰平喘、解蛇毒的功效［17］。原兒茶醛具有抗菌、抗炎、擴(kuò)張冠狀動脈和抑制血小板凝聚作用［18-19］。香花秋海棠莖葉中測定出了以上5 種藥用成分，初步驗(yàn)證了香花秋海棠清咽、消腫、清熱散淤、止癢的藥用功效，對其藥效的進(jìn)一步研究有一定的參考作用。其療效是否還與別的化學(xué)成分有關(guān)，由于無對照品，本次試驗(yàn)無相關(guān)的測定，有待后續(xù)進(jìn)一步的研究。

對香花秋海棠5種藥用成分蘆丁、表兒茶素、兒茶素、原兒茶酸、原兒茶醛的含量測定，為香花秋海棠民間傳統(tǒng)藥用療效找到了相應(yīng)依據(jù)，可為今后深入研究該植物藥用價值提供一定理論依據(jù)。

4.2 與近緣物種藥用成分的比較分析

因本次調(diào)查采樣地位于保護(hù)區(qū)，且香花秋海棠只是零散分布，數(shù)量少，為了保護(hù)野生種質(zhì)資源，只采了幾個葉片作為人工繁殖材料供本次實(shí)驗(yàn)用。香花秋海棠與秋海棠（Begonia grandis）、中華秋海棠（Begonia grandissubsp.sinensis）的藥用功效相近［19-21］。本次測定出人工繁殖栽培香花秋海棠的5種藥用成分含量與涂志超等［20］測定的產(chǎn)于湖北宜昌、恩施野生秋海棠以及產(chǎn)于湖北京山市、鐘祥市中華秋海棠相比較，人工溫室栽培香花秋海棠各藥用成分平均含量明顯低于野生的秋海棠和中華秋海棠。這反映出藥材的產(chǎn)地不同、生境不同，其成分含量有差異，也說明道地藥材是藥材品質(zhì)的重要保障，在中藥材生產(chǎn)中用盡可能完善的仿野生栽培技術(shù)，才能保證藥材的品質(zhì)、藥效不降低。香花秋海棠藥效成分含量是否與產(chǎn)地、生長環(huán)境、栽培技術(shù)等因素有關(guān)，還有待下一步做深入的測定分析。