氧化應激致自噬在光氣誘導的急性肺損傷中的作用

郭曉潔，劉鵬暉，龍 子，李佳威，涂永梅，李文麗，*，劉啟玲*

(1.陜西中醫(yī)藥大學公共衛(wèi)生學院，陜西 咸陽 712046；2.空軍軍醫(yī)大學軍事預防醫(yī)學系軍事毒理學與防化醫(yī)學教研室，陜西省自由基生物學與醫(yī)學重點實驗室，陜西 西安 710032)

光氣是一種劇毒氣體，問世已有200 余年，在第一次世界大戰(zhàn)期間曾被作為化學武器使用[1-2]。雖然光氣的毒性非常強，但它在工業(yè)生產(chǎn)過程中發(fā)揮著重要作用。目前，光氣被廣泛應用于工業(yè)生產(chǎn)中，如農(nóng)藥、塑料、染料、聚氨酯的合成以及冶金行業(yè)，并且在制藥生產(chǎn)過程中同樣是一種不可或缺的中間體[3]。近年來，在工業(yè)生產(chǎn)中因操作不當導致光氣泄漏事故頻發(fā)，最終造成職業(yè)人員的傷亡。例如在2021年河南宇銳化工科技有限公司三車間發(fā)生光氣和氯化氫混合氣體泄漏，造成2人死亡、13人住院治療，直接經(jīng)濟損失300.93萬元。然而，現(xiàn)有研究對于光氣暴露的毒性機制仍不清楚，并且缺乏特效救治手段[4-5]。因此，研究光氣的毒性機制并確定有效的治療策略是目前亟須解決的重大科學問題。

光氣暴露主要損害呼吸系統(tǒng)。光氣引起的急性肺損傷(acute lung injury，ALI)通常與短時間內(nèi)吸入大量光氣有關[6-7]。而長期、低劑量接觸可引起慢性通氣不足、難治性肺水腫及其他相關肺部損傷，最終導致急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)的發(fā)生[8-9]。在呼吸道接觸光氣后，初期主要癥狀為輕度干咳，早期還會伴有黏膜刺激癥狀[10]。如果暴露者仍長時間處于致病環(huán)境中，呼吸道刺激癥狀會在幾小時內(nèi)迅速發(fā)展，通常表現(xiàn)為劇烈咳嗽、胸悶以及喘息[7]。在大量或長時間吸入光氣后，會出現(xiàn)典型ALI 的臨床癥狀，包括肺水腫、呼吸困難和低氧血癥，嚴重時可能發(fā)展為ARDS[11]。在ALI的晚期，患者往往會出現(xiàn)慢性肺部疾病，包括氣流受阻、纖維化[12]、氣道高反應性以及氣體交換障礙等[13-14]。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是一類性質(zhì)非?；顫姷姆肿樱跈C體內(nèi)過量蓄積時會通過攻擊關鍵的生物大分子，最終導致組織細胞的損傷。在生理條件下，通過保持氧化還原穩(wěn)態(tài)的平衡，肺組織中的ROS 含量始終保持在一個較低的水平[15]。已有研究表明，過量ROS 會引起肺內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞損傷[16]，同時伴有肺毛細血管通透性的增加和肺泡表面活性物質(zhì)的減少，導致肺水腫和肺不張，最終發(fā)展為ALI[17]。研究表明，這些受損細胞會激活自噬以維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[18-19]，但過度自噬也會導致細胞死亡。既往研究顯示，ROS介導的大分子和細胞器氧化或輕度氧化應激激活自噬通路，清除受損的大分子和蛋白聚集物，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。自噬是受ROS和氧化應激調(diào)節(jié)的最重要的生物反應之一[20]。

由于氧化還原平衡穩(wěn)態(tài)的破壞在光氣暴露誘導的ALI 中具有重要的調(diào)控作用，因此提示我們，過量ROS在肺組織中蓄積可能是光氣發(fā)揮其毒作用的關鍵環(huán)節(jié)之一。但目前光氣暴露是否能夠誘導肺組織ROS水平上升，以及ROS 水平上升后誘導ALI 發(fā)生的機制仍不清楚。本研究旨在闡明大鼠光氣暴露模型中肺組織ROS水平的變化，并將自噬作為研究的新方向，初步明確氧化應激是否調(diào)控自噬緩解光氣誘導的ALI，為光氣肺損傷的救治提供潛在干預靶點和策略。

1 材料與方法

1.1 動物及其飼養(yǎng)

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，8 周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心。將所有大鼠圈養(yǎng)在環(huán)境溫度為(24±2)℃，相對濕度為(55±5)%的動物籠里，自由攝入水和飼料，12 h/12 h明暗交替。每日定時觀察動物一般狀況，經(jīng)過4～5 d 的適應性喂養(yǎng)后進行后續(xù)實驗。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 主要試劑光氣(氣瓶規(guī)格：體積10 L、氣壓150 bar)購于德國林德公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)檢測試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR(quantitative realtime PCR，qPCR)試劑盒購于TIANGEN 公司；雷帕霉素(rapamycin，RPM)、乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)購于中國MCE 公 司(AY-22989，HY-B0215)；NF-E2 相關因子2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)、血紅素氧合酶-1(heme oxygenase1，HO-1)、SOD 和CAT抗體購于美國Affinity 公司；LC3II/LC3I、Beclin-1 和P62 抗體購于美國Abcam 公司；β-actin 抗體購于Bioworld公司。

1.2.2 主要儀器光氣鼻吸入染毒設備，購于德國拜耳公司；全身體積描記檢測系統(tǒng)，購于Whole Body Plethsmography 公 司；Nikon ECLIPSE Ni-U 正置熒 光顯微鏡、FLUOstar Omega多功能酶標儀、蛋白電泳系統(tǒng)、半干轉(zhuǎn)裝置及凝膠成像與分析系統(tǒng)、T100 梯度PCR 儀、實時定量PCR 儀，均購于美國Bio-Rad 公司；超微量分光光度計，購于美國Denovix公司。

1.3 方 法

1.3.1 動物分組和處理為探討光氣暴露動物模型最適濃度，通過隨機數(shù)字表法將50 只SD 大鼠隨機分為對照組、染毒后6、12、24和48 h組，每組10只。自適應喂養(yǎng)1 周后，對照組大鼠鼻吸入空氣，光氣染毒組大鼠鼻吸入41 mg/m3的光氣，動態(tài)染毒30 min。染毒結(jié)束后，分別在6、12、24和48 h時測定大鼠肺功能，隨后使用戊巴比妥鈉(50 g/L)麻醉并處死大鼠，取大鼠肺組織和肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)進行相關指標的檢測，后選擇染毒后12 h組作為本研究動物模型(后稱光氣組)。為探討自噬在光氣誘導的急性肺損傷中的作用，將40只大鼠隨機分為對照組、光氣組、RPM處理組和RPM對照組，每組10 只。RPM 處理組和RPM 對照組在光氣暴露和空氣

暴露后立即給予自噬激動劑RPM(5 mg/kg)，腹腔注射處理，對照組和光氣組注射相同體積的生理鹽水。為探討氧化應激對自噬的調(diào)控作用，另取40只大鼠分為對照組、光氣組、NAC處理組和NAC對照組，每組10只。NAC處理組和NAC對照組在光氣暴露和空氣暴露后立即給予抗氧化劑NAC(200 mg/kg)，腹腔注射處理。對照組和光氣組處理如前所述。光氣暴露后12 h麻醉大鼠收集肺組織和BALF。

1.3.2 肺濕質(zhì)量與肺系數(shù)檢測肺濕質(zhì)量與肺系數(shù)是肺水腫的重要指標。取下肺組織，擦干表面血液，立即稱取質(zhì)量。肺系數(shù)為每只大鼠的肺濕質(zhì)量與體質(zhì)量的比值。

1.3.3 肺泡灌洗液總蛋白濃度測定大鼠處死后，取出完整的雙肺進行心肺分離，將大鼠右主支氣管結(jié)扎，使用5 mL注射器經(jīng)灌胃針將3 mL生理鹽水緩慢注入左肺，停留30 s 后吸出收集于EP 管內(nèi)。重復以上步驟一次，將兩次收集的BALF 在4 ℃條件下，1 000 r/min 離心5 min，吸取上清使用BCA 法測定總蛋白濃度。

1.3.4 組織病理學檢測選擇未行BALF 收集的大鼠右肺組織，使用預冷的PBS 洗滌，再用4% PMO 固定，連續(xù)梯度濃度的乙醇脫水，石蠟包埋，切成5 μm 切片，蘇木精、伊紅染色。使用光學顯微鏡進行組織病理學觀察。

1.3.5 全身體積描記系統(tǒng)檢測大鼠肺功能光氣染毒后6、12、24 和48 h，將大鼠放入全身體積描記檢測倉，大鼠適應5 min 后，進入15 min 的正式監(jiān)測程序，獲取大鼠支氣管收縮系數(shù)，呼氣末暫停和呼吸暫停指標。

1.3.6 DHE 染色檢測ROS 含量取新鮮的肺組織放置在自制凹槽內(nèi)，立即加入適量的OCT包埋劑浸沒組織，液氮速凍10～20 s 后置入恒冷箱切片機冰凍切片，厚度為5 μm，組織固定液固定30 min 后蒸餾水洗凈待用。將50 μL濃度為10 mol/L的DHE溶液滴入切片中，在37 ℃下孵化30 min。PBS清洗3遍后滴加封閉液，使用熒光顯微鏡觀察圖像，最后使用ImageJ軟件進行量化分析。

1.3.7 組織免疫熒光染色法檢測肺組織4HNE 的表達將肺組織切片脫蠟后經(jīng)過高溫抗原修復，用含0.3% Triton X-100 透膜后，血清封閉。切片與兔抗4HNE 在4 ℃孵育過夜。PBS 洗滌后，滴加二抗，室溫下避光孵育30 min，DAPI 復染細胞核10 min，觀察細胞核。PBS 充分洗滌后封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，使用ImageJ軟件進行量化分析。

1.3.8 肺勻漿抗氧化酶活性檢測稱取所需質(zhì)量的肺組織，按質(zhì)量(g)∶體積(mL)=1∶9 的比例，加入生理鹽水制成組織勻漿。采用SOD、CAT和GSH檢測試劑盒分別測定肺勻漿中SOD、CAT 的活力和GSH 含量，嚴格按照試劑盒內(nèi)說明書操作。

1.3.9 Western blot檢測氧化還原及自噬相關蛋白表達水平用組織研磨機將標本放入組織溶解緩沖液中勻漿，制備肺組織蛋白提取物。裂解液經(jīng)離心取上清，用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)所需的分子質(zhì)量分離范圍，在10%或12%的SDS-PAGE 凝膠中，加入30 μg 蛋白樣品，電泳結(jié)束后，并將其均勻地分布在PVDF 膜表面，以便進一步的分析。使用以下一抗Nrf2、HO-1、SOD、CAT(均按1∶1 000 稀釋)，Beclin-1(1∶2 000稀釋)，P62(1∶10 000稀釋)和LC3II/LC3I(1∶2 000稀釋)在4 ℃條件下封閉過夜。洗滌后，將膜與辣根過氧化物酶結(jié)合抗體室溫下孵育1 h。再次洗膜后使用凝膠成像系統(tǒng)對蛋白可視化，以β-actin作為內(nèi)參，采用ImageJ軟件進行量化。

1.3.10 RNA 提取和定量PCR按照說明書使用TRIzol法提取每只大鼠的肺組織總RNA。根據(jù)260 nm波長下的吸光度值計算RNA含量，通過A260/A280比值來確定RNA 純度。用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄總RNA。以β-actin為內(nèi)源性對照，進行qPCR反應，qPCR引物見表1。循環(huán)條件為95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s。采用2-ΔΔCT法計算Nrf2、HO-1、SOD 和CAT的mRNA相對表達水平。

表1 qPCR引物序列信息

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，應用GraphPad Prim 9.0 軟件進行分析，組間差異采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 光氣暴露對大鼠肺組織的損傷效應

為了明確光氣暴露對大鼠肺組織的損傷效應，我們使用41 mg/m3光氣經(jīng)呼吸道動態(tài)暴露30 min后，在各個時間點對大鼠各項指標進行檢測，結(jié)果見圖1。HE 染色結(jié)果顯示，光氣暴露后不同時間點均產(chǎn)生了一定損傷效應。與對照組相比，暴露后6 h，肺泡內(nèi)有明顯炎性滲出，肺泡壁部分斷裂，但基本能夠維持肺泡正常結(jié)構。暴露后12 h，肺泡融合，肺間質(zhì)增厚，炎性細胞增多。而暴露后24和48 h，肺組織的病理結(jié)構有所恢復，炎性滲出有所減輕。肺濕質(zhì)量及肺系數(shù)結(jié)果顯示，與對照組相比，各個時間點均有變化，但暴露后12 h 組變化最為顯著。此外，大鼠BALF 總蛋白濃度、支氣管收縮系數(shù)、呼氣末暫停以及呼吸暫停等指標均表現(xiàn)出了相似的結(jié)果。由此可見，使用41 mg/m3光氣經(jīng)呼吸道暴露30 min能夠誘導大鼠發(fā)生ALI，并且在暴露后12 h 時損傷效應最為顯著。

圖1 光氣染毒后不同時間對大鼠肺組織的損傷效應

2.2 光氣暴露對大鼠肺組織氧化還原平衡的影響

在光氣暴露的大鼠肺組織中，我們觀察到了活性氧水平的變化。如圖2 所示，與對照組相比，在光氣暴露的大鼠肺組織中，不同時間點DHE染色的熒光強度均升高，其中暴露后12 h 組熒光強度變化最為顯著。4HNE 染色結(jié)果表現(xiàn)出了與DHE 染色結(jié)果相同的變化趨勢，表明肺組織的脂質(zhì)過氧化水平升高。檢測一系列抗氧化酶的表達水平及酶活力，如圖3 所示，發(fā)現(xiàn)光氣暴露后，Nrf2 和HO-1 的轉(zhuǎn)錄水平升高，SOD和CAT的轉(zhuǎn)錄水平降低?？寡趸傅牡鞍妆磉_水平趨勢與轉(zhuǎn)錄水平趨勢基本一致。SOD及CAT的酶活力結(jié)果顯示，光氣暴露后，與對照組相比，抗氧化酶活性降低，其中暴露后12 h 組的變化最為明顯。同時，光氣暴露組的肺組織GSH含量顯著降低。以上表明，光氣暴露后肺組織氧化還原平衡發(fā)生紊亂。

圖2 光氣染毒后不同時間大鼠ROS和脂質(zhì)過氧化水平變化

圖3 光氣染毒后不同時間大鼠抗氧化酶表達水平和活性變化(n=3)

2.3 光氣誘導的ALI與自噬的關系

除ROS 的變化外，在光氣暴露的大鼠肺組織中，我們還觀察到了自噬的變化，結(jié)果見圖4。與對照組相比，光氣暴露后大鼠肺組織中Beclin-1 和LC3II/LC3I蛋白的表達水平降低(P<0.05)，而P62蛋白的表達水平升高，說明自噬程度明顯降低。使用自噬激動劑RPM 處理后，上述分子的表達水平明顯恢復，說明RPM緩解了光氣抑制的自噬(圖4A～D)。我們觀察RPM處理后肺組織ALI情況，HE染色顯示，肺組織的病理結(jié)構有所恢復，炎性滲出有所減輕(圖4E)。并且使用RPM提高自噬水平后，肺濕質(zhì)量及肺系數(shù)有所恢復(圖4F～G)。大鼠BALF總蛋白濃度、支氣管收縮系數(shù)、呼氣末暫停時間以及呼吸暫停等指標均表現(xiàn)出了相似的結(jié)果(圖4H～K)。以上結(jié)果表明，自噬激動劑RPM能夠緩解光氣誘導的ALI。

圖4 RPM處理的光氣暴露大鼠自噬水平變化及ALI程度

2.4 ROS對自噬的調(diào)控在光氣誘導ALI中的作用

結(jié)果見圖5，使用抗氧化劑NAC 處理光氣暴露的大鼠，DHE 的熒光強度明顯下降(P<0.01)，說明NAC緩解了光氣誘導的ROS 升高(P<0.01)。由于我們已經(jīng)證實了ROS 和自噬在光氣暴露誘導的ALI 中發(fā)揮重要作用，為了探討二者之間的調(diào)控方式，我們檢測NAC處理后自噬相關蛋白的表達情況。結(jié)果表明，Beclin-1 和P62 在經(jīng)抗氧化劑處理后蛋白表達水平均有所恢復，說明ROS與自噬存在相關關系，并且在光氣暴露誘導的ALI 中，自噬程度的變化能夠由ROS 水平調(diào)控。進一步研究NAC 處理后肺組織ALI 情況，HE 染色顯示，肺組織的病理結(jié)構有所恢復，炎性滲出有所減輕(圖6A)。并且使用NAC清除活性氧后，肺濕質(zhì)量及肺系數(shù)結(jié)果有所恢復(圖6B、C)。大鼠BALF總蛋白濃度、支氣管收縮系數(shù)、呼氣末暫停以及呼吸暫停等指標均表現(xiàn)出了相似的結(jié)果(圖6D～G)。綜上所述，使用NAC處理后促進自噬水平的恢復，從而緩解了光氣誘導的ALI。

圖5 NAC處理的光氣暴露大鼠ROS及自噬水平變化

圖6 NAC處理的光氣暴露大鼠ALI程度

3 討論

ALI 發(fā)生發(fā)展過程中一個重要的病理生理變化就是肺水腫，并且其產(chǎn)生原因包含多方面因素[21]。一方面，吸入光氣后會迅速與肺泡表面活性物質(zhì)發(fā)生作用[22]。在表面活性物質(zhì)耗盡后，剩余的光氣開始與肺組織中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以及核酸發(fā)生反應，導致質(zhì)膜受損，進而破壞肺血氣屏障，最終導致肺水腫[23]。同時，這一過程伴隨著大量的炎性介質(zhì)和ROS 的釋放，導致肺泡毛細血管通透性的增加，加重了肺水腫的癥狀[24-25]?，F(xiàn)有的研究大部分集中在案例研究或人群的回顧性研究，使用動物模型深入研究其作用機制的數(shù)量相對較少，并且并未得出一致性的結(jié)論。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)光氣染毒后不同時間點，大鼠肺組織肺泡完整性受損，可見明顯出血、炎癥細胞浸潤和水腫。肺濕質(zhì)量，肺系數(shù)及BALF 明顯增加，肺功能下降，以暴露后12 h最顯著。以上指標表明我們成功建立了光氣暴露誘導SD大鼠ALI的動物模型，并且觀察到ALI 的時間-效應關系，為后續(xù)的機制研究打下了基礎。

此外，我們還在光氣暴露動物模型的肺組織中觀察到活性氧水平的明顯升高、抗氧化酶活性的明顯降低以及抗氧化酶表達水平的明顯變化，并且與ALI 的時間-效應關系變化趨勢基本一致。結(jié)果表明，光氣暴露能夠誘導肺組織中大量ROS的產(chǎn)生以及抗氧化酶系統(tǒng)的激活。與一些研究相似，光氣誘導ALI 的過程通常伴隨著CAT、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GPx)和SOD 等抗氧化酶的異常表達[26]。Nrf2是一個在細胞中普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，當機體處于氧化-抗氧化狀態(tài)失衡時，細胞核外的Nrf2 被激活，同時調(diào)控下游的抗氧化酶HO-1 表達增高，以維持細胞內(nèi)的氧化還原平衡[27]。研究表明，抑制Nrf2 會導致Nrf2 介導的抗氧化酶系統(tǒng)紊亂，引起氧化應激，進一步加重肺部損傷[28]。在本實驗中，qPCR 和Western blot 顯示，光氣組大鼠Nrf2 和HO-1 水平升高，而SOD和CAT的水平降低，我們猜測這種結(jié)果可能與不同抗氧化酶對光氣的敏感性不同有關。同時我們的研究發(fā)現(xiàn)，給予抗氧化劑NAC可以改善光氣暴露導致的氧化損傷以及肺水腫的癥狀，表明氧化損傷在光氣誘導的肺水腫中發(fā)揮關鍵作用。我們證明了氧化還原平衡紊亂可能是導致光氣誘導的ALI 早期階段一個不可或缺的環(huán)節(jié)。

大量研究表明，ROS 是營養(yǎng)缺乏導致自噬的早期誘導因素[29]。Zhang等[30]的一項研究提出，是參與葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸或血清剝奪后誘導的自噬的主要ROS。而其他研究結(jié)果表明，H2O2是饑餓狀態(tài)下首先產(chǎn)生的分子。本研究發(fā)現(xiàn)，光氣暴露后大鼠肺組織中自噬水平降低，使用NAC 處理后其程度有所恢復，與使用自噬激動劑RPM處理后結(jié)果相似，對光氣誘導的ALI 有明顯的緩解作用。因此，本研究證實，ROS能夠調(diào)控自噬程度，并且通過抑制自噬，在光氣誘導的肺水腫中發(fā)揮損傷作用。同時，我們還提出抗氧化劑治療可能是預防或改善ALI 的潛在治療策略，而在已經(jīng)產(chǎn)生ALI 時可以使用雷帕霉素等能夠激活自噬過程的藥物進行處理，以緩解光氣誘導的ALI。