外周血微核試驗(yàn)檢測(cè)可降解生物材料補(bǔ)片的遺傳毒性

王國(guó)偉，孫曉霞，車(chē)國(guó)喜，蓋瀟瀟，屈秋錦，王 焱，汪曉飛，杜曉丹*，劉成虎，*

(1.山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗(yàn)研究院/國(guó)家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101；2.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 102629)

在疝修補(bǔ)術(shù)的發(fā)展過(guò)程中，隨著無(wú)張力疝修補(bǔ)概念的提出及現(xiàn)代材料學(xué)的發(fā)展，以聚丙烯材料為代表的人工合成補(bǔ)片在臨床上得到了廣泛的應(yīng)用。人工合成補(bǔ)片具有恢復(fù)快、并發(fā)癥少、復(fù)發(fā)率低的特點(diǎn)，基本達(dá)到疝修補(bǔ)手術(shù)的要求。但在術(shù)后出現(xiàn)的感染、黏連、侵襲性腸瘺、局部硬結(jié)、異物感等并發(fā)癥一直不能得到很好的解決[1-2]。在這種背景下，可降解生物材料補(bǔ)片應(yīng)運(yùn)而生了?？山到馍锊牧涎a(bǔ)片主要由膠原蛋白、彈性纖維等成分組成，其中膠原蛋白的含量最多，使其具有一定的強(qiáng)度與剛度[3]。在臨床應(yīng)用中，可降解生物材料補(bǔ)片以“三維立體支架”的形式植入到機(jī)體缺損或薄弱部位，通過(guò)多種機(jī)制吸引宿主細(xì)胞向支架移位并生長(zhǎng)，為細(xì)胞提供生長(zhǎng)的場(chǎng)所和空間，宿主細(xì)胞分泌新的細(xì)胞外基質(zhì)成分，形成自身組織，完成對(duì)缺損組織的修復(fù)和重建[4]。隨著可降解生物材料補(bǔ)片在臨床應(yīng)用中逐漸推廣，其作為一種長(zhǎng)久植入體內(nèi)的醫(yī)療器械，評(píng)價(jià)其在長(zhǎng)期植入過(guò)程中潛在的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)是生物相容性研究中的重要部分。

流式體內(nèi)微核技術(shù)借助流式細(xì)胞儀高通量檢測(cè)的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，在化合物的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)中有廣泛的應(yīng)用前景[5]。目前應(yīng)用流式體內(nèi)微核技術(shù)的研究中，主要以急性暴露后的小鼠或大鼠模型外周血中網(wǎng)織紅細(xì)胞微核(micronucleus of reticulocytes，MN-RET)作為關(guān)注重點(diǎn)，對(duì)于外周血中成熟紅細(xì)胞微核(micronucleus of mature erythrocytes，MN-NCE)與 遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)的研究相對(duì)較少。本研究從小鼠外周血中MN-RET 和MN-NCE 兩個(gè)方面探索可降解生物材料補(bǔ)片體內(nèi)潛在遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠48只(雌雄各半)，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2021-0006。

1.2 樣品與主要試劑、設(shè)備

外科生物補(bǔ)片(腹壁修補(bǔ)專(zhuān)用)，主要成分為纖維蛋白原與己內(nèi)酯共聚物，規(guī)格為140 mm×60 mm，由上海松力生物技術(shù)有限公司提供。PBS、甲醇、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CP)、碘化丙啶、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的磷脂結(jié)合蛋白(Annexin V-FITC)、3-16P離心機(jī)、3-18KS離心機(jī)(Sigma公司)，蘇木素染液、伊紅染液(北京索萊寶科技有限公司)，甲醛、二甲苯、無(wú)水乙醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；小鼠的微核流式加強(qiáng)型檢測(cè)試劑盒(BD公司)；0.9%氯化鈉注射液(辰欣藥業(yè)股份有限公司)。Cytoflex 流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter 公司)，CLASS II 生物安全柜(NuAire 公司)，MS3BS25 電動(dòng)渦旋儀(IKA 公司)，振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚儀器有限公司)，石蠟、超低溫冰箱、組織脫水機(jī)、自動(dòng)組織包埋機(jī)、全自動(dòng)切片機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾科技)，自動(dòng)組織染色封片工作站(日本櫻花儀器公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)液制備取外科生物補(bǔ)片，按照6 cm2/mL的浸提比例，以0.9%氯化鈉注射液為浸提介質(zhì)，(37±1) ℃，60 r/min振蕩浸提(72±2) h制備樣品試驗(yàn)液。

1.3.2 動(dòng)物分組隨機(jī)將動(dòng)物分為介質(zhì)對(duì)照組、環(huán)磷酰胺低劑量組(25 mg/kg)、環(huán)磷酰胺高劑量組(50 mg/kg)及樣品試驗(yàn)組，每組6只，雌雄各半。

1.3.3 動(dòng)物處理與取樣采用腹腔注射的方式，給予受試物容積為10 mL/kg，分長(zhǎng)、短周期方案。每日給予受試物1次，短周期連續(xù)給予受試物3 d，于末次給予受試物后24 h，小鼠眼眶靜脈取血約100 μL 至含350 μL 抗凝劑管中；長(zhǎng)周期連續(xù)給予受試物14 d 后按上述方法取血，同時(shí)無(wú)菌條件下摘取小鼠脾臟置于培養(yǎng)皿中。

1.3.4 血液樣本處理提前準(zhǔn)備固定液(將2 mL甲醇加至15 mL離心管中，-80 ℃過(guò)夜)，將血液樣本顛倒混合均勻，使用移液器吸取180 μL 加至對(duì)應(yīng)已提前低溫預(yù)冷的固定液管中，置于-80 ℃條件下固定3 d；將固定血樣從冰箱中逐一取出，立即加入12 mL緩沖液，輕輕混勻后離心(300～400 g)10 min，棄上清液，保留大約50 μL用于重懸細(xì)胞，重懸后4 ℃保存樣本；取試劑盒提供的20 μL 瘧原蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)品與80 μL標(biāo)記溶液I(每份樣本包含100 μL 緩沖液、1 μL RNA酶以及1 μL CD71 抗體配制)混合均勻，分別另取20 μL 瘧原蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)品、CD71-陰性樣品、陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照以及各組試驗(yàn)樣本與80 μL標(biāo)記溶液II(每份樣本包含100 μL標(biāo)記溶液I以及0.5 μL CD61抗體配制)混合均勻，室溫避光孵育30 min，保證RNA 徹底降解；孵育結(jié)束后，加入1.5 μL DNA染液(每份樣本包含2 mL緩沖液以及50 μL DNA染料)上機(jī)進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血中的微核應(yīng)用流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)采集軟件，利用瘧原蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)品以及CD71-陰性樣品調(diào)節(jié)儀器電壓、各通道的熒光補(bǔ)償。儀器校準(zhǔn)后，以采集20 000 個(gè)網(wǎng)織紅細(xì)胞(reticulocytes，RET)作為數(shù)據(jù)采集終點(diǎn)，分別獲取樣品試驗(yàn)組、介質(zhì)對(duì)照組、環(huán)磷酰胺組小鼠外周血中的網(wǎng)織紅細(xì)胞微核(MN-RET)和成熟紅細(xì)胞微核(MN-NCE)等數(shù)據(jù)。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟細(xì)胞的凋亡以及脾臟病理檢查取部分小鼠脾臟，用一次性注射器活塞研磨脾臟，反復(fù)移行，使脾細(xì)胞分離；用PBS 沖洗，收集沖洗液并轉(zhuǎn)移至無(wú)菌離心管中；300 g 離心10 min 后棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液，反應(yīng)1 min，加入細(xì)胞培養(yǎng)液終止反應(yīng)；300 g 離心10 min 后棄上清，用預(yù)冷的PBS沖洗脾臟細(xì)胞懸液，300 g離心5 min后，加入300 μL 緩沖液，每管加入5 μL Annexin V-FITC 混勻后，避光孵育15 min，孵育結(jié)束后每管加入5 μL PI染液，上機(jī)檢測(cè)；將剩余小鼠脾臟組織置于10%福爾馬林溶液中，常規(guī)石蠟切片、HE 染色，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以的形式表示，采用Student'st(等方差，雙尾)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，選擇與對(duì)照組比較的Dunnett 法進(jìn)行兩兩比較，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細(xì)胞儀核準(zhǔn)結(jié)果

用瘧原蟲(chóng)標(biāo)準(zhǔn)品、CD71-陰性樣品校準(zhǔn)儀器電壓以及熒光補(bǔ)償后的結(jié)果如圖1 所示。儀器校準(zhǔn)后，用試劑盒所提供的陰性對(duì)照品與陽(yáng)性對(duì)照品上機(jī)檢測(cè)后，RET 百分率、MN-RET 百分率數(shù)據(jù)均在參考值范圍內(nèi)，如表1所示。

表1 試劑盒中陰性對(duì)照品與陽(yáng)性對(duì)照品實(shí)測(cè)數(shù)值和對(duì)應(yīng)的參考值范圍

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品校準(zhǔn)儀器電壓及熒光補(bǔ)償

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠外周血中的微核率

短周期給予受試物3 d 后，與介質(zhì)對(duì)照組比較，樣品試驗(yàn)組小鼠外周血中RET、MN-RET 和MN-NCE百分率均未見(jiàn)顯著差異(P>0.05)；25、50 mg/kg 環(huán)磷酰胺組小鼠外周血中RET 百分率均顯著降低而MN-RET 百分率均顯著升高(均為P<0.01)。長(zhǎng)周期給予受試物14 d后，與介質(zhì)對(duì)照組比較，樣品試驗(yàn)組小鼠外周血中RET、MN-RET 和MN-NCE 百分率亦未見(jiàn)顯著性差異，但是環(huán)磷酰胺兩個(gè)劑量組小鼠外周血中MN-NCE百分率均顯著升高(均為P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 小鼠外周血微核試驗(yàn)結(jié)果(%，x±s，n=6)

2.3 脾臟細(xì)胞凋亡情況及脾臟病理切片組織學(xué)觀(guān)察結(jié)果

長(zhǎng)周期給予受試物14 d 后，用Annexin V-FITC與PI雙染法檢測(cè)脾臟細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與介質(zhì)對(duì)照組相比，25、50 mg/kg環(huán)磷酰胺組晚期凋亡細(xì)胞率均顯著升高(P<0.05或P<0.01)，如圖2所示。同時(shí)對(duì)脾臟進(jìn)行HE 染色后組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，與介質(zhì)對(duì)照組相比，樣品試驗(yàn)組小鼠的脾臟無(wú)明顯病理性改變；50 mg/kg環(huán)磷酰胺組小鼠脾臟出現(xiàn)明顯的白髓萎縮、淋巴細(xì)胞減少，紅髓擴(kuò)張、髓外造血增加等病理性改變，如圖3所示。

圖2 Annexin V-FITC與PI雙染檢測(cè)脾臟細(xì)胞凋亡結(jié)果

3 討論

可降解生物材料補(bǔ)片是伴隨免疫和組織工程學(xué)發(fā)展而產(chǎn)生的新興組織修復(fù)材料。隨著市場(chǎng)需求的發(fā)展，生物補(bǔ)片種類(lèi)也不斷豐富，包括神經(jīng)外科生物補(bǔ)片、生物疝補(bǔ)片、生物盆底補(bǔ)片、腹股溝疝生物補(bǔ)片等細(xì)分產(chǎn)品[6]。伴隨可降解生物材料類(lèi)補(bǔ)片市場(chǎng)份額的不斷擴(kuò)大，針對(duì)該類(lèi)醫(yī)療器械產(chǎn)品的安全性評(píng)價(jià)問(wèn)題逐漸引起關(guān)注。由于可降解材料的降解速度與預(yù)期降解產(chǎn)物濃度有很大的不確定性，一種或多種預(yù)期產(chǎn)物濃度的增加可能會(huì)改變體外生物學(xué)試驗(yàn)體系的pH值/滲透壓，而體內(nèi)條件下同時(shí)存在灌注及碳酸鹽平衡，所以體外試驗(yàn)結(jié)果可能不能反映體內(nèi)反應(yīng)?！犊晌蔗t(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià) 第1部分：可吸收植入物指南》指出，若評(píng)價(jià)一種新可吸收材料的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)，宜考慮進(jìn)行一項(xiàng)體內(nèi)試驗(yàn)[7]。傳統(tǒng)的體內(nèi)微核試驗(yàn)閱片過(guò)程耗時(shí)、結(jié)果易受操作者主觀(guān)判斷的影響、統(tǒng)計(jì)能力有限[8-10]。因此，本研究通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)小鼠外周血中的微核進(jìn)行分析，探索出評(píng)價(jià)可降解生物材料補(bǔ)片體內(nèi)潛在遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)的方法。

試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品試驗(yàn)組小鼠短周期(連續(xù)給予受試物3 d)與長(zhǎng)周期(連續(xù)給予受試物14 d)外周血中的微核率相較于介質(zhì)對(duì)照組均無(wú)顯著差異(P>0.05)，表明可降解生物材料補(bǔ)片不存在遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。但值得關(guān)注的是，在短期給予受試物條件下，25、50 mg/kg環(huán)磷酰胺組小鼠外周血中的MN-RET百分率相較于介質(zhì)對(duì)照組顯著性升高(P<0.01)，而MN-NCE 百分率無(wú)顯著性差異(P>0.05)；長(zhǎng)周期給予受試物條件下，25、50 mg/kg環(huán)磷酰胺組小鼠外周血中的MN-NCE百分率相較于介質(zhì)對(duì)照組顯著性升高(P<0.01)，而MN-RET 百分率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能與Torous 等[11]的研究結(jié)果一致，即流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血微核時(shí)，MN-RET 百分率的增加與細(xì)胞分裂期的急性遺傳毒性有關(guān)；MN-NCE 百分率的增加表明可能與亞慢性或慢性接觸后累積的DNA損傷相關(guān)。所以在應(yīng)用流式微核技術(shù)評(píng)價(jià)可降解生物材料補(bǔ)片的潛在遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，要根據(jù)不同的給藥周期選擇分析外周血中的MN-RET百分率或MN-NCE百分率來(lái)評(píng)價(jià)遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。

對(duì)長(zhǎng)周期給予受試物條件下的小鼠脾臟細(xì)胞進(jìn)行凋亡檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，25、50 mg/kg環(huán)磷酰胺組脾臟細(xì)胞凋亡率顯著性高于介質(zhì)對(duì)照組；同時(shí)對(duì)脾臟HE染色后組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，50 mg/kg環(huán)磷酰胺組小鼠脾臟出現(xiàn)明顯的白髓萎縮、淋巴細(xì)胞減少，紅髓擴(kuò)張、髓外造血增加等病理性改變。有研究指出，對(duì)大鼠外周血中微核的檢測(cè)系統(tǒng)可為亞急性、亞慢性等毒理學(xué)研究提供更多的信息[12-15]。本研究的脾臟細(xì)胞凋亡結(jié)果、組織病理學(xué)檢查結(jié)果均與流式檢測(cè)小鼠外周血中MN-NCE的結(jié)果相一致，表明在長(zhǎng)周期給藥后分析小鼠外周血中的MN-NCE，對(duì)一般毒理學(xué)研究有重要的價(jià)值。

本研究通過(guò)不同給藥周期條件下分析小鼠外周血中MN-RET、MN-NCE 對(duì)流式體內(nèi)微核試驗(yàn)結(jié)果的影響，首次探索了評(píng)價(jià)可降解生物材料補(bǔ)片體內(nèi)遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)的方法。并通過(guò)將小鼠脾臟毒理學(xué)試驗(yàn)結(jié)果和外周血微核試驗(yàn)結(jié)果的分析比較，探索了將流式體內(nèi)微核試驗(yàn)結(jié)果與一般毒理學(xué)研究整合的可能性，對(duì)可降解生物材料補(bǔ)片類(lèi)產(chǎn)品安全性評(píng)價(jià)有重要意義。