大孔樹脂純化青蒿多酚的工藝設(shè)計及其體外抗病毒活性研究

王云雨，王健*，張麗，萬新煥，牛鳳菊，周長征

(1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東濟南 250300；2. 新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院藥學(xué)部，新疆烏魯木齊 830011)

青蒿又名“方潰”“草蒿”“荻”和“菣”等[1]，為黃花蒿(Artemisia annuaLinn.)的干燥地上部位，屬一年生型菊科蒿屬的清熱解毒草本植物[2]。 青蒿作為一種醫(yī)食兩用植物[1]，除富含多糖、蛋白質(zhì)、萜類等有機活性成分之外[3]，還含有抗氧化、抗病毒、抗瘧、抗腫瘤、防治心血管疾病等活性的“健康衛(wèi)士”——多酚類化合物[4-7]。 多酚類物質(zhì)的提取方式通常包括溶劑萃取法、超臨界CO2萃取法、超聲波輔助提取法、生物酶提取法等[8-9]，其分離純化方法則有配位沉淀法、分子篩層析分離法、大孔吸附樹脂分離法及膜分離法等[7]。

目前對多酚類化合物的體外活性研究主要集中于其抗氧化活性，且研究表明其具有一定的抗病毒活性[5]。 人呼吸道合胞病毒(RSV)作為肺炎鏈球菌科的一種包膜病毒，是引起免疫低下人群下呼吸道感染最常見的病原菌之一，且目前尚無批準(zhǔn)的疫苗或特異性藥物來對抗其感染[10]。近年來以干擾素和病毒唑治療RSV 等病毒感染性疾病的研究屢見不鮮，但因其臨床效果不太理想且價格昂貴，所以仍存在較大的爭議[11]。 單純皰疹病毒(HSV)是α 皰疹病毒亞科的病原體，一般在外周組織中增殖繼而于三叉神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元細胞核中以雙鏈-DNA(ds-DNA)片段體的形式建立潛伏期，被激活后可到達神經(jīng)末梢感染鄰近的周圍上皮組織，如口腔、生殖器黏膜和眼上皮等[12]。 研究表明，青蒿提取物可在分子水平上發(fā)揮抗ds-DNA 抗體的活性，故猜測其具有抑制潛伏期HSV 的活性[13]。 傳統(tǒng)抗病毒藥物多為化藥，一般對機體刺激性較大且極易產(chǎn)生耐藥性，故可能給患者帶來二次傷害。 我國傳統(tǒng)中草藥因分布廣泛易得、藥效溫和且可避免耐藥性的產(chǎn)生等優(yōu)點，或?qū)⒊蔀檠兄瓶共《局苿┑摹靶滦恰盵14]。

本研究旨在篩選適宜的大孔樹脂型號及最優(yōu)提純工藝以提高青蒿中多酚類化合物的提取純度，并采用體外試驗對其抗病毒活性加以驗證及進一步的研究，以期為青蒿資源的開發(fā)與應(yīng)用提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青蒿，安徽省亳州市；Vero 細胞，山東省第一醫(yī)科大學(xué)微生物研究所；呼吸道合胞病毒(RSV)、單純皰疹病毒(HSV)、腸道病毒71 型(EV71)，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病研究所流感病毒研究室。

福林-酚(folin-ciocaileu)試劑、胰酶、青鏈霉素混合液(100×，penicillin-streptomycin solution)雙抗、MTT(二苯基四氮唑溴鹽)、大孔樹脂(D101、DM130、X-5、HPD-100、NKA-9、AB-8)，北京索萊寶科技有限公司；二甲亞砜，天津富宇精細化工有限公司；1640 培養(yǎng)基，Gibco；胎牛血清、PBS，美國Biological Industries 公司；利巴韋林注射液(產(chǎn)品批號:2104030641)，山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司；阿昔洛韋(CAS 號:59277-89-3)，上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司；沒食子酸、無水乙醇、無水碳酸鈉、濃鹽酸、氫氧化鈉等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗儀器

WD-9415F 型超聲波清洗器，北京六一生物科技有限公司；微型中藥粉碎機，邢臺潤聯(lián)科技開發(fā)有限公司；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，鄭州鞏義市英峪予華儀器廠；離心機，長沙湘智離心機儀器有限公司；FA-1004N 電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；水浴振蕩器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；紫外可見分光光度計X-5 型，上海元析儀器有限公司；P301 酸度計，山東歐萊博儀器有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱，日本三洋公司；生物安全柜，Thermo 公司；倒置顯微鏡，日本Olympus 公司；超低溫冰箱，中科美菱低溫科技股份有限公司；細胞培養(yǎng)瓶、96 孔細胞培養(yǎng)板，美國Corning 公司；酶標(biāo)儀，美國BioTek 儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 粗青蒿多酚樣品的制備 稱取洗凈、烘干(30 ℃)后的粗碎青蒿300 g，粉碎后過0.25 mm篩，精確稱取200.0 g 粉末于圓底燒瓶中，以固液比為1∶10(g/mL)、40%乙醇浸泡6 h。 后于功率125 W、40 ℃條件下水浴超聲提取2 次，每次30 min。 提取液以32 層紗布過濾，合并濾液。 將濾液抽濾，3 000 r/min 離心10 min 后以40 ℃減壓濃縮至含生藥量1 g/mL。 按照樣品∶無水乙醇(mL ∶mL)為1∶0.25、1∶0.5、1∶1、1∶2 依次加入相應(yīng)體積的無水乙醇以除去粗提液中的部分多糖及蛋白質(zhì)，靜置2 h 后以4 000 r/min 離心10 min，取上清液進行減壓濃縮(40 ℃)至無醇味，將濃縮液保存于-20 ℃冰箱中，后進行冷凍干燥，凍干后的粗品置于4 ℃條件下備用。

1.3.2 提取液中多酚含量的測定 采用福林-酚比色法[15]。 精密稱取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%)0.0100 g 于100 mL 容量瓶中，以純水溶解并定容，搖勻即得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。 分別移取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于10 mL 棕色容量瓶中，后分別加入1.0 mL 福林酚試劑、質(zhì)量濃度為10%的碳酸鈉溶液2.0 mL并以純水定容，搖勻后避光反應(yīng)2 h，測定760 nm 波長處的吸光度值，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程:y ＝11.9810x ＋0.0454，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9996。 式中x 為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度C(mg/mL)，y 為吸光度值A(chǔ)。 標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

移取樣品溶液0.5 mL 于10 mL 棕色容量瓶中，加入1.0 mL 福林酚試劑與10%碳酸鈉溶液2.0 mL后以純水定容，搖勻后避光反應(yīng)2 h，測定760 nm 波長處的吸光度值并代入回歸方程，得其多酚質(zhì)量濃度。

1.3.3 大孔樹脂的預(yù)處理 分別取10.0 g D101、DM130、X-5、HPD-100、NKA-9、AB-8 大孔樹脂，以體積分數(shù)為95%乙醇活化24 h，攪拌均勻放出氣泡后以純水洗至無醇味，以5 倍柱體積的5% HCl 浸泡2 h 后以純水洗至中性，以相同體積2% NaOH 浸泡2 h 后以純水洗至中性，最終以大量純水浸泡，備用。

1.3.4 大孔樹脂型號的篩選 取預(yù)處理的6 種濕樹脂各10.0 g 于250 mL 具塞錐形瓶中，各加入10.0 mL 質(zhì)量濃度為1 g/mL 的青蒿多酚粗提液，吸附30 min 后置于28 ℃、150 r/min 水浴恒溫振蕩儀上，振蕩吸附6 h 并收集其上清液(0.5 mL/h)。自收集的各組(以0.5 mL/h 收集的單個樣品為一組)上清液中分別取樣以測定多酚濃度C1，同時測定初始提取液的多酚濃度C0。 將吸附飽和的樹脂進行抽濾，并以40 ～60 mL 純水潤洗2 次至表面無明顯殘留的多酚溶液。 加入10.0 mL 體積分數(shù)為70%乙醇后再次置于搖床上，相同條件下恒溫振蕩6 h 并收集上清液(0.5 mL/h)，測其多酚濃度C2。 將所得數(shù)據(jù)代入公式(1)～(3)以計算各樹脂的吸附量(mg/g)、吸附率及解吸率(%)即可篩選出最佳型號。

式中，m 為濕樹脂質(zhì)量，V 為上樣液體積。

1.3.5 HPD-100 樹脂的靜態(tài)吸附動力學(xué)分析分別取1.3.4 中HPD-100 樹脂靜態(tài)吸附過程中每小時所得樣液，按1.3.2 中的測定方式得其多酚濃度，計算吸附率并繪制吸附曲線。

1.3.6 上樣液質(zhì)量濃度對吸附率的影響 取10.0 g 預(yù)處理的HPD-100 濕樹脂6 份，加入質(zhì)量濃度分別為25、50、100、200、500、800 mg/mL 的青蒿多酚粗提液各10.0 mL，密封置于28 ℃水浴恒溫振蕩儀上，以150 r/min 振蕩吸附6 h 并收集其上清液(0.5 mL/h)，測其多酚濃度并按公式(2)計算吸附率。

1.3.7 上樣液pH 值對吸附率的影響 取10.0 g預(yù)處理的HPD-100 濕樹脂8 份，加入pH 值分別為1、2、3、4、5、6、7、8 的青蒿多酚粗提液(質(zhì)量濃度為50 mg/mL)各10.0 mL，密封置于28 ℃水浴恒溫振蕩儀上，以150 r/min 振蕩吸附6 h 并收集上清液(0.5 mL/h)，測其多酚濃度并按公式(2)計算吸附率。

1.3.8 乙醇體積分數(shù)對解吸率的影響 取10.0 g預(yù)處理的HPD-100 濕樹脂7 份，加入質(zhì)量濃度為50 mg/mL、pH 值為2.0 的青蒿多酚粗提液各10.0 mL，密封置于28 ℃水浴恒溫振蕩儀上，以150 r/min振蕩吸附6 h，加入體積分數(shù)分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇洗脫液各10.0 mL，密封置于28 ℃水浴搖床上，以150 r/min振蕩6 h 并收集其上清液(0.5 mL/h)，測其多酚濃度并按公式(3)計算解吸率。

1.3.9 HPD-100 樹脂的動態(tài)吸附與解吸 (1)動態(tài)吸附曲線的繪制:取20.0 g 預(yù)處理的HPD-100 濕樹脂1 份，以濕法裝柱的方式裝入半徑為2.0 cm 的層析柱，以純水平衡24 h 后加入質(zhì)量濃度為50 mg/mL、pH 值為2.0 的青蒿多酚粗提液，以2 BV/h(1BV＝36.4 mL)的流速過柱并測定每1 BV 流出液中的總多酚濃度Ct，當(dāng)其達到泄漏點[流出液的總多酚含量(C′t)開始不低于上樣液中總多酚含量(C′0)10%時的上樣體積]停止上樣并繪制動態(tài)吸附曲線。

(2)洗脫曲線的繪制:按1.3.9(1)中的方式裝柱并將質(zhì)量濃度為50 mg/mL、pH 值為2.0 的青蒿多酚粗提液以2 BV/h 的流速上樣13 BV，經(jīng)5 BV 純水洗脫除雜后，以體積分數(shù)為70%乙醇洗脫至無紫外吸收(280 nm)，每0.5 BV 收集一次洗脫液并測定其總多酚濃度，繪制洗脫曲線。

將含總多酚的洗脫液進行減壓濃縮至無醇味，冷凍干燥后測定多酚純度(混合物中總多酚的質(zhì)量占其總質(zhì)量的百分比)。

1.3.10 青蒿多酚抗病毒活性的研究 (1)細胞復(fù)蘇:將保存于液氮中的Vero 細胞取出并置于37℃條件下融化，后將其放入離心機中以1 500 r/min離心5 min，棄去上清液后以1 mL 細胞生長液(10% 1640 培養(yǎng)基)吹打后移入細胞培養(yǎng)瓶，補加培養(yǎng)液使瓶內(nèi)液體容積達6 mL。 標(biāo)記后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并定時鏡檢(12 h檢1 次)。

(2)細胞傳代:待Vero 細胞長成單層且在細胞培養(yǎng)瓶瓶底覆蓋率約90%時，棄去原培養(yǎng)液并以2 mL PBS 沖洗2 ～3 次，后向瓶中加入1 mL 0.25%胰酶細胞消化液(含EDTA)，輕輕晃動使其覆蓋瓶底，置于培養(yǎng)箱中消化5 ～8 min。 輕輕拍打培養(yǎng)瓶使貼壁細胞脫落，立即加入3 mL 10%1640 終止消化，吹打均勻后以1 傳2 的方式進行傳代，標(biāo)記后繼續(xù)培養(yǎng)。

(3)病毒毒力的測定:將凍存于-80 ℃冰箱中的RSV、EV71 和HSV 病毒“三凍三融”之后在1 000 r/min 條件下離心5 min 并收集上清液，將其進行10 倍比稀釋(100～1011)后依次加入100 μL 于被單層Vero 細胞覆蓋的96 孔板中，每孔平行3 次并設(shè)置細胞對照組，標(biāo)記后置于培養(yǎng)箱中靜待48 h。 終止培養(yǎng)后棄去原培養(yǎng)液，以PBS 沖洗兩遍后以MTT 在避光條件下染色處理4 h，之后棄去MTT 并以DMSO 進行脫色，在氣浴恒溫振蕩器中振蕩15 min 后于酶標(biāo)儀中測定A490，采用Reed-Muench 兩氏法即式(4)計算病毒的半數(shù)細胞感染量TCID50。

細胞存活率(%)＝試驗組A490值/對照組A490值×100 ；

細胞病變率(%)＝1-細胞存活率 ；

細胞比距(pd)＝(高于50%的細胞病變率-50%)/(高于50%的細胞病變率-低于50%的細胞病變率) ；

式中，C 為高于50%病變率時的首個稀釋度，Cm為倍比稀釋系數(shù)。

(4)藥物毒性的測定:將所得凍干青蒿多酚樣品以2% 1640 配制成50 mg/mL 藥物后過0.22 μm 無菌微孔濾膜除菌除雜，取100 μL 以2 倍比稀釋(20～211)加入長好單層Vero 細胞的96 孔板中，設(shè)置細胞對照(100 μL 2% 1640)、病毒對照(50 μL 2% 1640＋50 μL 病毒)和同濃度陽性藥(RSV 與EV71 以利巴韋林為陽性藥，HSV 以阿昔洛韋為陽性藥；50 μL 陽性藥＋50 μL 2% 1640)，標(biāo)記培養(yǎng)。 待病毒組病變達90%時終止培養(yǎng)并棄去原培養(yǎng)液，以PBS 沖洗2 遍后依次進行染色、脫色處理，脫色后振蕩15 min 并于酶標(biāo)儀中測定A490，依據(jù)式(5)計算藥物的半數(shù)中毒濃度(TC50)。

式中C藥物首孔表示96 孔板中首列藥物的濃度，即50 mg/mL。

(5)青蒿多酚體外抗病毒試驗:將青蒿多酚藥物的最大無毒濃度設(shè)置為初始濃度，以2%1640 依次進行2 倍比稀釋(20～211)并各加入50 μL 于長好Vero 細胞的96 孔板中，同時設(shè)置對照組[同1.3.10(4)的處理方式]。 標(biāo)記后置于培養(yǎng)箱中，待病毒組病變程度約為90%時進行染色、脫色處理，經(jīng)振蕩后以酶標(biāo)儀測定A490，并采用Reed-Muench 兩氏法即式(6)(7)計算藥物的半數(shù)有效濃度(EC50)和治療指數(shù)(TI 值)。 其中，TI值為判定藥物是否具有抗病毒效果的主要指標(biāo)。

1.4 數(shù)據(jù)整理及分析

采用SPSS 20.0 對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析，以O(shè)rigin 2022 與Microsoft Excel 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 六種大孔樹脂性能的比較

相關(guān)研究表明，樹脂的主要功能基(極性)及其孔徑、孔隙率、比表面積等因素是影響其性能的關(guān)鍵所在，而被吸附化合物的分子量也是影響大孔樹脂“去粗取精”不可忽略的因素[16]。 如表1所示，一般來說酚類化合物應(yīng)在極性樹脂上具有較好的性能，但本試驗結(jié)果表明NKA-9 的性能并不出眾，推測青蒿多酚的化合物分子量偏小，即影響其吸附、解吸效果的主要是孔容、比表面積等空間因素。 HPD-100 在這6 種樹脂中的平均孔徑最小且平均孔容和比表面積最大，故其吸附青蒿多酚的純度最高且解吸性能最佳。 6 種樹脂的吸附率不存在較大差異，但HPD-100 的解吸率優(yōu)于其他5 種樹脂。 綜合考慮，HPD-100 是純化青蒿多酚的最適樹脂。

表1 六種大孔樹脂空間結(jié)構(gòu)、吸附與解吸性能等的比較

2.2 HPD-100 樹脂的靜態(tài)吸附飽和曲線

如圖2 所示，自吸附開始的0.5 h 內(nèi)青蒿多酚被迅速吸附至HPD-100 樹脂內(nèi)部使其吸附率迅速升至46.70%，至2 h 后達到飽和狀態(tài)，此后吸附率幾乎不再變化。 故選擇2 h 為青蒿總多酚的HPD-100 最佳吸附時間。

圖2 HPD-100 樹脂的靜態(tài)吸附飽和曲線

2.3 上樣液質(zhì)量濃度對吸附率的影響

如圖3 所示，當(dāng)青蒿多酚上樣液的質(zhì)量濃度為50 mg/mL 時其在HPD-100 樹脂上的吸附率明顯優(yōu)于其他濃度。 低于該濃度時吸附率較小的主要原因是樹脂上的吸附位點仍有剩余，從而降低了樹脂的利用率。 當(dāng)質(zhì)量濃度高于50 mg/mL時化合物堵塞引起傳質(zhì)阻力增大，進而影響物質(zhì)的擴散和吸附，造成多酚化合物的損失。 故確定50 mg/mL 是其最佳上樣濃度。

圖3 上樣液質(zhì)量濃度對吸附率的影響

2.4 上樣液pH 值對吸附率的影響

如圖4 所示，當(dāng)上樣液的pH 值為1 ～3 時多酚吸附質(zhì)主要以分子狀態(tài)存在，此時其在HPD-100 樹脂上的吸附率高于90%，且不存在顯著性差異(P＞0.05)。 上樣液的pH 值不低于7 時青蒿多酚主要以離子態(tài)分布，此時不易被樹脂所吸附[17]。 當(dāng)pH 值為4 ～6 或8 時部分苷鍵發(fā)生斷裂形成了苷元和糖。 一方面，糖類化合物占領(lǐng)了部分吸附位點，造成了多酚的損失；另一方面，多酚苷元釋放后被吸附，導(dǎo)致此時多酚吸附率較中性條件時更高。 故認為pH ＝2.0 時青蒿多酚在HPD-100 樹脂上的吸附效果最佳。

圖4 上樣液pH 值對吸附率的影響

2.5 洗脫液體積分數(shù)對解吸率的影響

如圖5 所示，當(dāng)乙醇洗脫液體積分數(shù)為40%～70%時，青蒿多酚的解吸率隨乙醇體積分數(shù)的升高而增大。 推測其原因為青蒿多酚提取液成分復(fù)雜，隨乙醇體積分數(shù)增大，避免了極性較大的雜質(zhì)被洗脫下來并增大了樹脂的溶脹程度而使多酚類化合物更易被洗脫。 當(dāng)體積分數(shù)繼續(xù)增大時解吸率反而降低，但均高于40% 乙醇的解吸率(43.59%)。其原因可能是青蒿多酚極性高于該體積分數(shù)下的乙醇極性而使其溶解度降低所致。 故認為乙醇洗脫液的最適體積分數(shù)為70%。

圖5 洗脫液體積分數(shù)對解吸率的影響

2.6 HPD-100 樹脂的動態(tài)吸附與解吸

2.6.1 動態(tài)吸附曲線 大孔吸附樹脂的純化性能是其大分子功能基團的吸附性及其孔隙的篩分性相結(jié)合的結(jié)果[18]。 當(dāng)吸附目標(biāo)物的濃度高于限定值時會因吸附位點不足或孔隙堵塞等造成目標(biāo)物質(zhì)的泄露，且自其泄漏量開始高于上樣液中目標(biāo)物含量的10%時認定吸附物在目標(biāo)樹脂上達到了泄漏點。 如圖6 所示，以pH ＝2、質(zhì)量濃度為50 mg/mL 的青蒿總多酚提取物上樣，當(dāng)上樣液為13 BV 時其流出液中總多酚濃度開始達初始濃度的10%(11.39%)，繼續(xù)上樣發(fā)現(xiàn)流出液中多酚濃度迅速升高使樹脂利用率顯著降低。 故青蒿多酚的最大上樣體積為13 BV。

圖6 青蒿多酚在HPD-100 樹脂上的吸附飽和曲線

2.6.2 動態(tài)洗脫曲線 如圖7 所示，以70%乙醇溶液對青蒿多酚進行洗脫，當(dāng)洗脫液體積為2.5 BV 時流出液總多酚質(zhì)量濃度達到最大(17.48 mg/mL)，繼續(xù)洗脫至流出液在280 nm 處無明顯紫外吸收(5 BV)即認為此時多酚已被完全洗出。故認為洗脫液的最佳用量為5 BV。

圖7 青蒿多酚在HPD-100 樹脂上的洗脫曲線

2.7 青蒿多酚純度

分別將最佳條件(HPD-100 樹脂；上樣:pH ＝2.0、質(zhì)量濃度為50 mg/mL、13 BV；洗脫:70% 乙醇、5 BV)下所得的洗脫液與粗提液減壓濃縮后進行冷凍干燥，測其多酚含量以計算純度。 結(jié)果如表2 所示，此條件下青蒿多酚純化后的純度較純化前增加1.63 倍。

表2 HPD-100 樹脂純化前后青蒿多酚純度

2.8 青蒿多酚抗病毒活性

2.8.1 病毒TCID50的測定 根據(jù)式(4)計算得RSV、HSV-1、HSV-2、EV71 的TCID50分別為10-4.601、10-3.852、10-4.460、10-3.637，試驗用100 倍TCID50作為病毒液濃度。

2.8.2 藥物TC50的測定 50 mg/mL 青蒿多酚溶液(純化后)自加入4 h 后，在顯微鏡下可見Vero細胞明顯破裂(約10%)，加藥24 h 后細胞破裂率可達90%以上。 胞中顆粒物增多且形態(tài)改變，隨藥物濃度降低對細胞毒性減小。 而對照組細胞排列緊湊且無顆粒物出現(xiàn)，細胞形態(tài)完整。 藥物與陽性藥對細胞的TC50見表3。

表3 青蒿多酚與利巴韋林、阿昔洛韋對細胞的TC50值比較

2.8.3 青蒿多酚體外抗病毒試驗 (1)青蒿多酚抗RSV:如表4 所示，青蒿多酚溶液對RSV 的抑制效果顯著強于陽性對照藥，表明其具有顯著的抗病毒效果。 推測其原因可能是提取物中的成分多樣且各物質(zhì)間可協(xié)同發(fā)揮作用，值得推廣用于制備相應(yīng)抗RSV 制劑。

表4 青蒿多酚與利巴韋林對RSV 的EC50與TI 值的比較

(2)青蒿多酚抗HSV:由表5、表6 可知，青蒿總多酚提取物對HSV-1 與HSV-2 均具有一定的滅活作用且對HSV-2 的抑制作用較強，兩者效果均優(yōu)于陽性對照，與張軍峰等[19]的研究結(jié)果無明顯差別。 故可確定青蒿總多酚也具備抗HSV 的生物活性。

表5 青蒿多酚與阿昔洛韋對HSV-1 的EC50與TI 值的比較

表6 青蒿多酚與阿昔洛韋對HSV-2 的EC50與TI 值的比較

(3)青蒿多酚抗EV71:如表7 所示，青蒿多酚對EV71 不存在明顯的體外抑制活性。

表7 青蒿多酚與利巴韋林對EV71 的EC50與TI 值的比較

3 討論與結(jié)論

本試驗探究了6 種不同型號的大孔樹脂對青蒿多酚的靜、動態(tài)吸附與解吸效果，并以單因素試驗對純化樹脂的最佳純化條件進行了研究。 結(jié)果表明，HPD-100 吸附樹脂對青蒿總多酚的純化效果最優(yōu)，其最佳純化工藝參數(shù)為靜態(tài)吸附液pH值為2.0、質(zhì)量濃度為50 mg/mL、吸附時間為2 h，最佳洗脫液的體積分數(shù)為70%；動態(tài)吸附時其最佳上樣量為13 BV，洗脫液最佳用量為5 BV。 在此條件下青蒿多酚的純度較純化前增加了1.63倍。 純化后的青蒿總多酚可表現(xiàn)出對RSV、HSV-1 及HSV-2 的顯著抑制活性，對EV71 不存在滅活作用。 王樂樂[20]研究發(fā)現(xiàn)，青蒿中存在貓眼草酚D 等多酚類物質(zhì)，可協(xié)同青蒿素等物質(zhì)發(fā)揮抗瘧、抗腫瘤活性[21]。 后續(xù)可對青蒿總多酚的活性成分、體內(nèi)抗病毒效果及其作用機制進行深入研究，以期為其資源的開發(fā)與應(yīng)用提供更加充分的理論基礎(chǔ)。