抗生素聯(lián)合抗程序性細(xì)胞死亡蛋白1抗體治療在H22肝癌小鼠模型中的抗腫瘤作用

劉莉，鄧向亮，韓亮，葉昊

1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院及附屬第二醫(yī)院，廣東云浮 527300；3.廣東省光與健康工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510006

2020 年全球發(fā)生了1 930 萬新癌癥病例和近1 000萬癌癥死亡病例，嚴(yán)重威脅人們的生命健康［1］。其中原發(fā)性肝癌是我國第四大常見惡性腫瘤，也是我國第二大腫瘤死因，導(dǎo)致中國的癌癥負(fù)擔(dān)不斷增加［2］。免疫檢查點(diǎn)單克隆抗體治療腫瘤是通過激活T 細(xì)胞殺死癌細(xì)胞，目前已成為腫瘤治療的重大突破［3］，但其價(jià)格昂貴［4］，不同癌癥有效性不同，存在耐藥性。其應(yīng)用的局限性為：不同癌癥有效性不同，存在耐藥性，價(jià)格昂貴，可導(dǎo)致肺結(jié)核、腸炎、垂體損傷等不良反應(yīng)［4-5］。合理的聯(lián)合免疫治療可能是提高臨床抗腫瘤療效的解決方案。研究證實(shí)，聯(lián)合治療比單獨(dú)化療具有更長的總生存期，可改善免疫檢查點(diǎn)單克隆抗體治療出現(xiàn)的不良反應(yīng)［6］。研究證實(shí)，腸道菌群的改變可抑制腫瘤生長及重新編程腫瘤微環(huán)境，從而增加抗程序性細(xì)胞死亡蛋白1（programmed cell death protein 1，PD1）抗體的耐藥性［7-8］。一方面，抗生素（antibiotic，ATB）會(huì)影響腸道中微生物的多樣性，導(dǎo)致生態(tài)失調(diào)和免疫力受損，并與癌癥患者的不良生存率有關(guān)［9-10］；另一方面，ATB 又可預(yù)防小鼠肝臟腫瘤［11］。對于ATB 矛盾的作用，進(jìn)一步分析ATB 分類是聯(lián)合治療腫瘤的重要前提。研究證實(shí)，口服廣譜和窄譜ATB 在癌癥治療上存在顯著差異［12］。廣譜ATB 的使用不利于接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的患者的預(yù)后［13］，而窄譜ATB 聯(lián)合免疫療法治療肝癌的作用目前尚不明確。

頭孢菌素類ATB 會(huì)干擾細(xì)菌細(xì)胞壁合成，導(dǎo)致感染性微生物的分解。頭孢曲松鈉屬于頭孢菌素類第三代半合成ATB，僅通過腸胃外途徑給藥，且具有穿越血腦屏障的能力，在調(diào)節(jié)腸道微生物群和免疫力方面發(fā)揮關(guān)鍵作用［14］。頭孢曲松鈉對大腸埃希菌、肺炎桿菌、吲哚陽性變形桿菌、流感桿菌、沙雷桿菌、腦膜炎球菌、淋球菌有強(qiáng)大殺菌作用，其主要活性與革蘭陰性細(xì)菌有關(guān)，還能夠?qū)箤Φ谝淮偷诙^孢菌素耐藥的革蘭陰性桿菌。隨著耐藥性和不良反應(yīng)的增加，頭孢曲松鈉的使用具有了局限性［15］。屬于窄譜抗菌藥物的林可霉素可有效治療大多數(shù)厭氧菌和革蘭陽性球菌感染，在臨床經(jīng)常與其他藥物聯(lián)合配伍使用，并且其抗菌性能夠減少因雜菌引發(fā)的腸道菌群的失調(diào)［16］。因此，兩種ATB 聯(lián)合使用既可緩解頭孢曲松鈉產(chǎn)生的細(xì)菌耐藥性，也可抵抗混合感染中對兩者敏感性低或無敏感性的細(xì)菌。

本研究選擇頭孢曲松鈉和克林霉素聯(lián)合抗PD1抗體免疫療法治療小鼠肝癌，研究窄譜ATB 對H22移植瘤的影響，為提高免疫治療效果提供有效的方法和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級BALB／c小鼠（雄性，3 ～4周齡，體質(zhì)量18 ～20 g）、SPF 級KM 小鼠（雌性，3 周齡，體質(zhì)量18 g）購自遼寧長生生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SYXK（粵）2017-0125，動(dòng)物合格證號：99410100013479。所有動(dòng)物均在溫度（20±2）℃、相對濕度36%的屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，可自由進(jìn)食、飲水。本實(shí)驗(yàn)均以科研為目的進(jìn)行小鼠的養(yǎng)殖和使用，并經(jīng)廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審理批準(zhǔn)，按科技部《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》、《廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》等相關(guān)規(guī)定（國科發(fā)財(cái)字［2006］398號、廣東省第十一屆人民代表大會(huì)常務(wù)委員會(huì)公告［41號］）進(jìn)行。

1.2細(xì)胞 小鼠肝癌H22細(xì)胞由廣州中醫(yī)藥大學(xué)提供，在RPMI-1640 培養(yǎng)基中，37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)至80%密度時(shí)，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3主要試劑及儀器 RPMI1640 培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；InVivoMab 抗小鼠PD1（CD279）購自美國Bioxcell 公司，批號：BE0273；IL-2、IL-10、IFNγ ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司，批號：BA-120H、AF5105、DF6045；伊紅和蘇木精染料購自北京蘭杰柯科技有限公司；頭孢曲松鈉和鹽酸林可霉素購自上海麥克林生化科技有限公司；DAB 顯色試劑盒購自北京中山金橋生物科技有限公司，批號：9017；兔抗鼠特異性單抗APC-cy7-CD3、APC-CD8購自美國Biolegend（San Diego）公司，批號：100235、 100712；兔抗鼠特異性單抗PE-CD69購自廣州譽(yù)德生物科技有限公司，批號：12-0691-81；兔抗鼠特異性單抗CD3和CD8 購自美國Affinity Biosciences 公司；HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG（批號：A0208）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；流式細(xì)胞儀（FACS CantoⅡ型）、FlowJo軟件購自美國BD 公司；Image J 購自美國NIH 公司；GraphPad Prism 8.0.1購自美國San Diego公司。

1.4小鼠腫瘤模型的建立及分組、給藥 為提高移植瘤活性，進(jìn)行KM 小鼠腹水造模試驗(yàn)。取KM 小鼠，腹腔注射0.1 mL H22細(xì)胞懸液（2 × 107個(gè)／mL）制備腹水細(xì)胞，10 d 后，抽取腹水5 mL，用PBS 離心（200×g，5 min）洗滌2 次，將細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基中，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)／mL。將BALB／c小鼠分為5 組，每組8 只：正常（Normal）組、模型（Model）組、抗PD1（PD1）組、頭孢曲松納+鹽酸林可霉素（ATB）組、抗PD1 聯(lián)合ATB（PD1+ATB）組。除Normal組小鼠外，其余小鼠均腋下接種0.1 mL H22細(xì)胞（2×107個(gè)／mL），建立H22荷瘤小鼠模型。ATB 使用時(shí)間和劑量與治療腫瘤療效密切相關(guān)，因此采取短期在免疫治療中使用ATB［17-18］。于建模后腫瘤大小超過100 mm3，第8 和13 天分別腹腔注射抗PD1單抗，250 μg／只，免疫治療同時(shí)灌胃頭孢曲松鈉（100 mg／kg）加鹽酸林可霉素（200 mg／kg）7 d，Normal組灌胃生理鹽水，0.2 mL／只。觀察小鼠狀態(tài)。

1.5聯(lián)合給藥對腫瘤生長和脾指數(shù)影響的檢測 腫瘤移植成功后，每隔2 d用游標(biāo)卡尺測量小鼠腫瘤的長短徑，計(jì)算腫瘤體積，并繪制曲線。第1 ～15天記錄小鼠自然死亡和存活情況。第15 天后，頸椎脫臼處死小鼠，分離腫瘤和脾臟組織稱重，按下式計(jì)算脾臟指數(shù)。

1.6聯(lián)合給藥對IL-2、IFNγ、IL-10 細(xì)胞因子分泌水平影響的檢測 頸椎脫臼處死小鼠時(shí)，經(jīng)小鼠眼眶后采血分離血清，采用ELISA 法檢測血清中IL-2、IFNγ、IL-10 細(xì)胞因子分泌水平，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7聯(lián)合給藥對CD3+、CD8+T 細(xì)胞比例影響的檢測

采用流式細(xì)胞術(shù)。取小鼠腸系膜淋巴結(jié)，經(jīng)PBS 研磨過濾后，加入兔抗鼠特異性單抗（APC-cy7-CD3 和APC-CD8）染色30 min；PBS洗滌2次，置0.2 mL緩沖液重懸溶液后，上流式細(xì)胞儀檢測CD69、CD3和CD8比例。同種型對照［Normal 組淋巴細(xì)胞中分別單染（CD3、CD8），設(shè)為陰性對照（Control）組］。利用FlowJo軟件分析陽性細(xì)胞比例。

1.8聯(lián)合給藥對組織病理學(xué)及CD3和CD8蛋白表達(dá)影響的檢測 將小鼠腫瘤包埋在4%多聚甲醛中并石蠟切片，HE 染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。采用免疫組化（immunohistochemistry，IHC）法，將石蠟切片常規(guī)脫蠟，高溫抗原修復(fù)20 min 后，3% H2O2和10% BSA 37 ℃孵育；切片與兔抗鼠特異性單抗CD3 和CD8 4 ℃過夜復(fù)溫；加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 孵育1 h；加入DAB顯色試劑作用3 ～5 min；Olympus光學(xué)顯微鏡下掃描觀察玻片，檢測CD3 和CD8 蛋白的表達(dá)。采用Image J 軟件分析陽性面積比例，確定相對蛋白表達(dá)量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用GraphPad Prism 8.0.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以平均值±SEM表示，并重復(fù)進(jìn)行至少3 次獨(dú)立試驗(yàn)。腫瘤體積組間比較采用雙因素方差分析，其他組間采用單因素方差分析、t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1聯(lián)合給藥對腫瘤生長和脾指數(shù)的影響 聯(lián)合治療16 d 后，3 個(gè)治療組小鼠均存活，且腫瘤生長速度均比Model 組慢。PD1 + ATB 組腫瘤體積低于PD1組（t=1.266，P=0.032 4），且腫瘤重量與PD1 組差異較大（t=1.136，P＜0.000 1）。見圖1。表明PD1+ATB 聯(lián)合治療可有效抑制肝癌異種移植小鼠腫瘤生長，并較PD1單獨(dú)治療效果更好。與Normal組相比，Model 組小鼠脾臟明顯增大（t= 5.804，P= 0.002）；與Model 組相比，PD1+ATB 組脾臟指數(shù)更顯著低于PD1組（t=2.636，P=0.048 5）。見圖2。表明PD1+ATB 聯(lián)合治療可緩解炎癥引起的脾臟腫大，可有效調(diào)節(jié)免疫器官，促進(jìn)免疫活性提高。

圖1 聯(lián)合給藥對小鼠腫瘤生長的影響Fig.1 Effect of combined administration on tumor growth in mice

圖2 聯(lián)合給藥對小鼠脾臟指數(shù)的影響Fig.2 Effect of combined administration on mouse spleen index

2.2聯(lián)合給藥對IL-2、IL-10、IFNγ 細(xì)胞因子分泌水平的影響 與Normal 組相比，Model 組IL-2、IL-10 和IFNγ 水平顯著降低（t分別為8.489、3.18、3.015，P分別為0.002 2、0.042、0.019 8）；與Model 組相比，PD1+ATB 組IL-2、IL-10、IFNγ 和分泌水平顯著升高（t分別為3.326、7.573、5.282，P均＜0.05），且IL-2、IL-10水平顯著高于PD1組（t分別為0.520 2、0.577 5，P分別為0.006 9、0.005 8）。見圖3。表明PD1+ATB聯(lián)合治療可促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放，并激活肝癌異種移植小鼠的免疫反應(yīng)。

2.3聯(lián)合給藥對CD3+、CD8+T 細(xì)胞比例的影響 與Normal 組相比，Model 組小鼠腸系膜淋巴結(jié)組織中CD3+、CD8+T細(xì)胞比例降低（t分別為7.814、5.571，P分別為0.006 4、0.009 5）；與Model組相比，PD1+ATB組CD3+、CD8+T 細(xì)胞比例顯著增加（t分別為5.079、2.848，P分別為0.022 3、0.010 9）。見圖4 和圖5。表明PD1+ATB 聯(lián)合治療增加了淋巴結(jié)中T 淋巴細(xì)胞數(shù)量，并激活了肝癌異種移植小鼠的免疫反應(yīng)，顯著改善了皮下移植腫瘤的免疫微環(huán)境。

注：與Normal組相比，a表示P ＜0.05，aa表示P ＜0.01；與Model組相比，b 表示P ＜0.05，bb 表示P ＜0.01；cc 表示與PD1+ATB 組相比，P ＜0.01。n=6（單因素方差分析）。

圖5 聯(lián)合給藥對小鼠腸系膜淋巴結(jié)組織中CD3+（A）、CD8+（B）T細(xì)胞比例的影響Fig.5 Effect of combined administration on proportions of CD3+（A）and CD8+（B）T cells in mesenteric lymph nodes of mice

2.4聯(lián)合給藥對組織病理學(xué)的影響 與Model 組相比，PD1+ATB 組HE 染色表現(xiàn)為腫瘤內(nèi)浸潤的T 細(xì)胞顯著增加，胞漿染色信號增強(qiáng)，細(xì)胞核數(shù)量增多，而PD1 組腫瘤內(nèi)浸潤的T 細(xì)胞較少。見圖6。表明PD1+ATB聯(lián)合治療可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞壞死，調(diào)節(jié)免疫功能。

圖6 聯(lián)合給藥對組織病理學(xué)的影響（HE，×200）Fig.6 Effect of combined administration on histopathology（HE staining，×200）

2.5聯(lián)合給藥對CD3、CD8蛋白表達(dá)的影響 與Model組相比，PD1+ATB組腫瘤組織中CD3、CD8蛋白表達(dá)水平顯著升高（t分別為7.95、3.211，P分別為0.000 1、0.011 4），且顯著高于PD1組（t分別為4.494、3.211，P分別為0.011 4、0.047 4）。見圖7 和圖8。表明PD1 + ATB 組腫瘤組織中CD3+和CD8+T 細(xì)胞浸潤水平較高，激活T 細(xì)胞功能強(qiáng)于PD1 組，與流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果一致。

圖7 IHC法檢測聯(lián)合給藥對腫瘤CD3、CD8表達(dá)水平的影響（×200）Fig.7 Analysis of effect of combined administration on expression levels of CD3 and CD8 in tumor by IHC assay（×200）

圖8 聯(lián)合給藥對腫瘤組織CD3（A）、CD8（B）表達(dá)的水平影響Fig.8 Effect of combined administration on expression levels of CD3（A）and CD8（B）in tumor tissue

3 討 論

使用抗PD1 抗體作為有效的一線癌癥免疫療法是人類抗癌的里程碑。但約2／3 的患者對單獨(dú)免疫治療無反應(yīng)，迫切需要新策略來增強(qiáng)抗癌免疫力［19］。聯(lián)合治療能夠預(yù)測生物標(biāo)志物，支持免疫治療敏感性、分類多樣性和特定腸道細(xì)菌類群豐度之間的聯(lián)系，這些物種復(fù)合物具有內(nèi)在的免疫調(diào)節(jié)特性，從而可最大限度地發(fā)揮抗PD1 抗體耐藥性的臨床益處［20-21］。隨著腸道微生物對免疫反應(yīng)和癌癥的影響逐漸受到關(guān)注，ATB 已成為癌癥免疫治療的潛在生物標(biāo)志物之一。ATB 與抗PD1 抗體聯(lián)合免疫治療的最優(yōu)組合策略是目前以抗PD1 抗體抑制劑為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療亟待解決的熱點(diǎn)問題。研究發(fā)現(xiàn)，ATB 對腫瘤治療效果不同，其主要影響因素包含ATB 分類、給藥劑量、給藥時(shí)間等［17-18］。窄譜和廣譜ATB 對癌癥治療效果差異明顯，其中ATB 分類可能是其重要的影響因素［12］。

因此，本研究模擬了H22肝癌細(xì)胞接種BALB／c小鼠，為減少腸道中的大部分細(xì)菌，選擇頭孢曲松鈉和鹽酸林可霉素作為窄譜ATB治療。排除其他影響試驗(yàn)的因素，選擇短期口服ATB，同時(shí)進(jìn)行抗PD1 抗體免疫治療。結(jié)果顯示，PD1+ATB組小鼠皮下移植瘤體積明顯小于其他干預(yù)組。研究表明，腫瘤免疫治療的有限療效是缺乏足夠數(shù)量的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞或T 細(xì)胞，這些細(xì)胞無法通過各種因素進(jìn)入腫瘤微環(huán)境［22］。本研究的腫瘤組織切片HE 染色和IHC 法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗PD1 抗體結(jié)合ATB 的使用有助于提高腫瘤組織CD3+和CD8+T 細(xì)胞浸潤水平，促進(jìn)腫瘤組織壞死范圍的擴(kuò)大（P＜0.05）。ATB 與抗PD1抗體聯(lián)合治療的抗腫瘤機(jī)制與免疫功能的調(diào)節(jié)有關(guān)。正常情況下，淋巴結(jié)或脾臟中的免疫系統(tǒng)會(huì)對外來抗原作出反應(yīng)，并促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞增殖。淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫反應(yīng)功能的重要細(xì)胞成分，是幾乎所有免疫功能的主要執(zhí)行者。為了確定聯(lián)合治療對免疫系統(tǒng)的影響，本研究使用流式細(xì)胞儀分析了腸系膜淋巴結(jié)中T 細(xì)胞的比例。結(jié)果顯示，ATB 與抗PD1 抗體聯(lián)合治療可促進(jìn)CD3+和CD8+T 細(xì)胞增加（P＜0.05）?？筆D1 抗體分子與配體細(xì)胞程序性死亡-配體1（programmed cell death-ligand 1，PDL1）和細(xì)胞程序性死亡-配體2（PDL2）結(jié)合會(huì)傳導(dǎo)抑制信號并減少T 細(xì)胞增殖，使癌細(xì)胞能夠逃避免疫監(jiān)視和破壞［23］。抗PD1／PDL1單抗藥物通過阻斷其表達(dá)結(jié)合，使T 細(xì)胞能夠正常殺死腫瘤細(xì)胞［24］。但其具有不良反應(yīng)和有效率低的局限性［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，ATB影響免疫細(xì)胞因子并調(diào)節(jié)免疫功能［25-26］。如IL-2 不僅可誘導(dǎo)T 淋巴細(xì)胞增殖，還誘導(dǎo)可能具有抗腫瘤潛力的NK 細(xì)胞群的擴(kuò)增。本研究血清ELISA 檢測結(jié)果顯示，ATB 與抗PD1抗體聯(lián)合治療可提高IL-2、IL-10和IFNγ細(xì)胞因子分泌水平（P＜0.05）。

綜上所述，ATB 與抗PD1 抗體聯(lián)合治療是通過提高腫瘤組織T細(xì)胞浸潤水平，增加免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子IL-2、IL-10、IFNγ和T淋巴細(xì)胞數(shù)量，激活T細(xì)胞免疫功能來持續(xù)激活免疫系統(tǒng)，抑制腫瘤。窄譜ATB可能通過改善免疫功能來促進(jìn)抗PD1 抗體對腫瘤的治療。目前ATB如何消除或調(diào)節(jié)癌癥患者免疫抑制的具體機(jī)制尚不完全清楚，有必要對其進(jìn)行前瞻性研究來確定腫瘤特異性微生物特征，以利于腫瘤的早期診斷和后續(xù)治療。