外泌體來(lái)源的miR-1246對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移和自噬的影響

彭美蘭，王璐，劉麗麗，閆振鵬，閻婷

山西醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，山西太原030001

中國(guó)是食管癌高發(fā)國(guó)家之一，發(fā)病率在我國(guó)癌癥中列第6 位，死亡率列第4 位，均高于全球平均水平［1-2］。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，包括內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及各種生物活性物質(zhì)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［3-5］。外泌體是直徑為30～150 nm 的脂質(zhì)雙層膜囊泡，幾乎所有活細(xì)胞均能分泌外泌體［6-7］。腫瘤微環(huán)境中富含腫瘤細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體，腫瘤外泌體在細(xì)胞間發(fā)揮通訊作用，可能通過(guò)外泌體提供的自分泌信號(hào)調(diào)控腫瘤的局部生長(zhǎng)［8-9］。自噬是存在于真核細(xì)胞中高度保守的生物代謝過(guò)程，可降解細(xì)胞質(zhì)中的蛋白和受損的細(xì)胞器等物質(zhì)，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)［10-11］。SQSTM1／P62 是選擇性自噬的底物，也是重要調(diào)節(jié)物，在某些腫瘤類(lèi)型中，自噬具有關(guān)鍵的促腫瘤作用，對(duì)于支持腫瘤生長(zhǎng)非常重要［12-13］。

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是長(zhǎng)度為17～25 個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA，轉(zhuǎn)錄后可調(diào)節(jié)目標(biāo)mRNA 的表達(dá)［14-15］。miRNA 通過(guò)與特定mRNA 的3'UTR 區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA 的翻譯抑制或降解［16］。外泌體在體內(nèi)的穩(wěn)定性極好，廣泛分布于各種體液，是miRNA 理想的轉(zhuǎn)運(yùn)體［17-18］。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miRNA 是細(xì)胞間的重要通訊分子，可作為許多腫瘤的診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)，與腫瘤的轉(zhuǎn)移、自噬等密切相關(guān)［17，19］。本研究通過(guò)對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）細(xì)胞外泌體和正常食管上皮細(xì)胞外泌體進(jìn)行miRNA 測(cè)序分析，篩選出差異基因miR-1246，并探究miR-1246 對(duì)ESCC 細(xì)胞遷移和自噬的影響，為后續(xù)其作用機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1組織樣本 ESCC組織和癌旁組織均源自山西省腫瘤醫(yī)院155 例食管癌患者，所有患者均通過(guò)病理學(xué)檢查和影像學(xué)檢查確診為ESCC。本研究通過(guò)山西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的倫理審批（文件號(hào)：山西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)201301 號(hào)），患者及家屬均知情同意。

1.2細(xì)胞及基因序列 人ESCC 細(xì)胞株KYSE150、KYSE450、TE9 和正常食管上皮細(xì)胞系Het-1A 均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，由山西醫(yī)科大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心食管癌發(fā)病機(jī)理及轉(zhuǎn)化研究中心重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)；miR-1246 mimic 及其陰性對(duì)照（miR-1246 mimic NC）、miR-1246 inhibitor 及其陰性對(duì)照（miR-1246 inhibitor NC）、micrOFF inhibitor NC（5FAM）序列均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司。

1.3主要試劑及儀器 RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液、DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液及胰酶均購(gòu)自山西賽奧生物科技有限公司；外泌體提取試劑盒（KGPE001-10）購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑（11668-019）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；RNAiso plus試劑（9109）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT Master Mix 及TB Green?Premix Ex Taq?Ⅱ試劑均購(gòu)自日本TaKaRa公司；小鼠抗GAPDH單克隆抗體（60004-1-Ig）購(gòu)自美國(guó)Proteintech 公司；兔抗TSG101 單克隆抗體（ab125011）及兔抗Calnexin 多克隆抗體（ab22595）均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；兔抗SQSTM1／p62 多克隆抗體（5114S）購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG（BA1054）及山羊抗小鼠IgG（BA1050）均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；ECL 顯影液購(gòu)自美國(guó)Perkinelmer 公司；納米粒徑分析儀器購(gòu)自廈門(mén)福流生物科技有限公司。

1.4細(xì)胞培養(yǎng) ESCC 細(xì)胞系KYSE150、KYSE450 和TE9用含10%FBS、1%青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液，Het-1A 和HeLa 細(xì)胞用含10% FBS、1%青-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液，均于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5外泌體提取及鑒定 KYSE150細(xì)胞融合度達(dá)50%時(shí)，棄培養(yǎng)液，PBS 洗滌2 次，加入新鮮RPMI1640，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；收集細(xì)胞培養(yǎng)液，300 ×g離心10 min；收集上清，2 000×g離心10 min；收集上清，10 000×g離心30 min；收集上清，用外泌體提取試劑盒提取外泌體。電鏡下觀察外泌體形態(tài)，納米粒徑分析儀檢測(cè)外泌體粒徑。

1.6外泌體標(biāo)志物的檢測(cè) 采用Western blot法。BCA法測(cè)定KYSE150 細(xì)胞來(lái)源外泌體（1.5 項(xiàng)制備，經(jīng)PBS 洗脫）及HeLa 細(xì)胞總蛋白（細(xì)胞裂解液提取）的蛋白質(zhì)濃度。分別取兩種蛋白樣品，經(jīng)10% SDSPAGE 分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用5%脫脂奶粉于室溫封閉1 h；分別加入小鼠抗GAPDH 單克隆抗體（1∶10 000稀釋?zhuān)⑼每筎SG101單克隆抗體（1∶1 000稀釋?zhuān)?、兔抗Calnexin 多克隆抗體（1∶1 000 稀釋?zhuān)? ℃孵育過(guò)夜；TBST 洗滌3 次，加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔或羊抗小鼠IgG（1∶5 000 稀釋?zhuān)?，室溫孵? h；TBST洗滌3次，ECL法顯影。

1.7ESCC細(xì)胞與正常食管上皮細(xì)胞外泌體中miRNA的差異分析 按1.5 項(xiàng)方法提取KYSE150、KYSE450和Het-1A 細(xì)胞外泌體，送深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行RNA測(cè)序，分析Het-1A與KYSE150及Het-1A與KYSE450外泌體中的差異表達(dá)miRNA。

1.8差異表達(dá)miRNA的KEGG Pathway富集分析 于深圳華大基因股份有限公司Dr.TOM多組學(xué)數(shù)據(jù)挖掘系統(tǒng)中對(duì)差異表達(dá)miRNA進(jìn)行KEGG Pathway富集分析。

1.9miR-1246在ESCC 腫瘤組織及癌旁組織中表達(dá)水平的檢測(cè) 將155例ESCC 患者的癌組織和癌旁組織送至深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序［20］，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.10細(xì)胞轉(zhuǎn)染 KYSE150細(xì)胞融合度達(dá)60%時(shí)，在Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染miR-1246mimic及miR-1246 mimic NC，轉(zhuǎn)染終濃度均為50 nmol／L。按上述方法將miR-1246 inhibitor及miR-1246 inhibitor NC、micrOFF inhibitor NC（5FAM）轉(zhuǎn)染TE9細(xì)胞，轉(zhuǎn)染終濃度均為100 nmol／L。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.11miR-1246對(duì)ESCC細(xì)胞遷移影響的檢測(cè)

1.11.1過(guò)表達(dá)miR-1246 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-1246 mimic 及miR-1246 mimic NC 的KYSE150細(xì)胞中miR-1246的表達(dá)水平。根據(jù)NCBI中登錄的人miR-1246（100302142）及GAPDH序列（2597），經(jīng)Primer 3 Input在線工具設(shè)計(jì)PCR特異性擴(kuò)增引物，miR-1246正向引物：5'-AATGGATTTTTGGAGCAGG-3'，反向引物：5'-GTCGTATCCAGTGCAATTG-3'；GAPDH正向引物：5'-CAACGACCACTTTGTCAAGCTC-3'，反向引物：5'-GGTCTACATGGCAACTGTGAGG-3'。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。用RNAiso plus 試劑提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT Master Mix 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。采用Transwell 小室試驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)miR-1246 對(duì)ESCC 細(xì)胞遷移影響。將上述兩組細(xì)胞經(jīng)0.05%胰酶消化，300 ×g離心3 min，取沉淀，PBS 洗滌1 次，用新鮮RPMI1640重懸，計(jì)數(shù)，將5×104～1×105個(gè)細(xì)胞接種至小室中，小室上方加入200μL 新鮮的RPMI1640，下方加入600μL 含20% FBS 的RPMI1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)液，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育36 h；并去小室上方細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定小室下方細(xì)胞20 min；用0.4%結(jié)晶紫染色30 min。置顯微鏡觀察并拍攝。

1.11.2抑制表達(dá)miR-1246 采用熒光標(biāo)記法檢測(cè)miR-1246 inhibitor NC在TE9細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。采用Transwell小室試驗(yàn)檢測(cè)抑制表達(dá)miR-1246對(duì)ESCC細(xì)胞遷移影響，方法同1.11.1項(xiàng)。

1.12miR-1246 對(duì)食管鱗癌細(xì)胞自噬影響的檢測(cè)取1.11 項(xiàng)中的KYSE150 及TE9 細(xì)胞，Western blot 法檢測(cè)細(xì)胞中SQSTM1／p62 蛋白含量，其中一抗為兔抗SQSTM1／p62 多克隆抗體（1∶1 000 稀釋?zhuān)?，方法?.6 項(xiàng)，ECL 法顯影，應(yīng)用Image J 1.6.0 軟件進(jìn)行分析。

1.13統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)采用均值± 標(biāo)準(zhǔn)差（x ± s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1外泌體的鑒定 電鏡下觀察可見(jiàn)，KYSE150 細(xì)胞來(lái)源的外泌體形狀完整、近似球形囊泡樣結(jié)構(gòu)，外形符合典型的外泌體特征，見(jiàn)圖1。粒徑為50 ～80 nm，大小符合典型的外泌體特征，見(jiàn)圖2。外泌體標(biāo)志物TSG101 蛋白（相對(duì)分子質(zhì)量約45 000）呈陽(yáng)性，Calnexin 蛋白（相對(duì)分子質(zhì)量約75 000）呈陰性，見(jiàn)圖3。上述結(jié)果表明，提取的外泌體質(zhì)量合格，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 外泌體形態(tài)的鏡下觀察（×40）Fig. 1 Morphology observation of exosomes under electron microscopy（×40）

圖2 外泌體粒徑的分析圖Fig.2 Size analysis of exosomes

圖3 Western blot 法檢測(cè)外泌體標(biāo)志物Calnexin（A）及TSG101蛋白（B）的表達(dá)情況Fig. 3 Western blot analysis of exosome marker proteins Calnexin（A）and TSG101（B）

2.2ESCC細(xì)胞與正常食管上皮細(xì)胞外泌體中miRNA的差異分析 Het-1A與KYSE150及Het-1A與KYSE450的差異表達(dá)miRNA 分別為105 及112 個(gè)，其中59 個(gè)為共同差異表達(dá)miRNA，上調(diào)的差異基因miRNA 共39 個(gè)。miR-1246 在Het-1A 外泌體中低表達(dá)，在KYSE450 和KYSE150 外泌體中均高表達(dá)，提示miR-1246在ESCC細(xì)胞外泌體中顯著上調(diào)。見(jiàn)表1。

表1 Het-1A與KYSE150及Het-1A與KYSE450共表達(dá)miRNA的差異倍數(shù)Tab.1 Difference multiple of co-differentially expressed miRNA up-regulated in Het-1A and KYSE150,Het-1A and KYSE450

2.3差異表達(dá)miRNA的KEGG Pathway富集分析差異表達(dá)miRNA主要富集在自噬代謝通路上，見(jiàn)圖4。

圖4 差異表達(dá)miRNA的KEGG Pathway富集圖Fig.4 KEGG Pathway enrichment analysis of differentially expressed miRNAs

2.4miR-1246在ESCC 腫瘤組織及癌旁組織中的表達(dá)水平 miR-1246在腫瘤組織中高表達(dá)（36.27），而在癌旁組織中表達(dá)較低（7.55），且兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.299，P＜0.000 1）。大部分患者腫瘤組織中miR-1246表達(dá)量與癌旁組織的比值＞1，見(jiàn)圖5。表明miR-1246在ESCC腫瘤組織中普遍高表達(dá)。

圖5 miR-1246在ESCC患者腫瘤組織與癌旁組織中表達(dá)水平的比值Fig.5 Relative expression levels of miR-1246 in tumor tissues and paracancer tissues of patients with ESCC

2.5miR-1246對(duì)ESCC細(xì)胞遷移的影響

2.5.1過(guò)表達(dá)miR-1246 轉(zhuǎn)染miR-1246 mimic及miR-1246 mimic NC序列的KYSE150細(xì)胞中miR-1246的相對(duì)表達(dá)量分別為1.00 和1.72，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 7.558，P＜0.05）；細(xì)胞遷移數(shù)量分別為169和115 個(gè)，前者明顯少于后者（t=4.119，P＜0.05），見(jiàn)圖6。表明過(guò)表達(dá)miR-1246可促進(jìn)KYSE150細(xì)胞遷移。

圖6 轉(zhuǎn)染miR-1246 mimic NC（A）及miR-1246 mimic（B）后KYSE150細(xì)胞的遷移情況（標(biāo)尺：100μm）Fig. 6 Migration of KYSE150 cells after transfection with miR1246 mimic NC（A）and miR-1246 mimic（B）（scale：100μm）

2.5.2抑制表達(dá)miR-1246 miR-1246 inhibitor NC 在TE9 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率達(dá)90%，見(jiàn)圖7。轉(zhuǎn)染miR-1246 inhibitor及miR-1246 inhibitor NC 的TE9細(xì)胞遷移數(shù)量分別為41和112個(gè)，前者顯著少于后者（t=9.067，P＜0.01），見(jiàn)圖8。表明抑制表達(dá)miR-1246 可降低TE9細(xì)胞的遷移能力。

圖7 miR-1246 inhibitor NC 在TE9 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染情況的鏡下觀察（標(biāo)尺：200μm）Fig.7 Microscopic observation of transfection efficiency of miR-1246 inhibitor NC in TE9 cells（scale：200μm）

圖8 轉(zhuǎn)染miR-1246 inhibitor（A）及miR-1246 inhibitor NC（B）后TE9細(xì)胞的遷移情況（標(biāo)尺：100μm）Fig.8 Migration of TE9 cells after transfection with miR-1246 inhibitor（A）and miR-1246 inhibitor NC（B）（scale：100μm）

2.6miR-1246對(duì)食管鱗癌細(xì)胞自噬的影響

2.6.1過(guò)表達(dá)miR-1246 轉(zhuǎn)染miR-1246 mimic 及miR-1246 mimic NC 的KYSE150 細(xì)胞自噬標(biāo)志物SQSTM1／p62 的相對(duì)表達(dá)水平分別為0.65 和1.00，前者顯著低于后者（t= 48.150，P＜0.001），見(jiàn)圖9。表明過(guò)表達(dá)miR-1246可促進(jìn)食管癌細(xì)胞自噬。

圖9 過(guò)表達(dá)miR-1246對(duì)KYSE150細(xì)胞中SQSTM1／p62蛋白表達(dá)水平的影響Fig. 9 Effect of overexpression of miR-1246 on the expression level of SQSTM1／p62 protein in KYSE150 cells

2.6.2抑制表達(dá)miR-1246 轉(zhuǎn)染miR-1246 inhibitor及miR-1246 inhibitor NC 的TE9 細(xì)胞中自噬標(biāo)志物SQSTM1／p62 的相對(duì)表達(dá)水平分別為2.38 和1.00，前者顯著高于后者（t=51.270，P＜0.001），見(jiàn)圖10。表明抑制表達(dá)miR-1246可抑制食管癌細(xì)胞自噬。

圖10 抑制表達(dá)miR-1246 對(duì)TE9 細(xì)胞中SQSTM1／p62蛋白表達(dá)水平的影響Fig.10 Effect of miR-1246 inhibition on SQSTM1／p62 protein expression in TE9 cells

3 討論

食管癌是高度惡性的消化道腫瘤之一，具有高侵襲性［21］。由于食管癌患者早期無(wú)明顯癥狀，很難早期發(fā)現(xiàn)，確診時(shí)多數(shù)為晚期且發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者5 年生存率較低［22-23］。有研究表明，在食管癌中，細(xì)胞可通過(guò)攝取腫瘤來(lái)源的外泌體改變其基因表達(dá)和表型，導(dǎo)致細(xì)胞周期發(fā)生變化并加速細(xì)胞的遷移活動(dòng)［24］。本研究對(duì)提取的外泌體進(jìn)行鑒定及RNA 測(cè)序，結(jié)果顯示，miR-1246在ESCC細(xì)胞外泌體中顯著上調(diào)。本研究還發(fā)現(xiàn)，miR-1246 在食管鱗癌腫瘤組織中普遍高表達(dá)。有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-1246可作為ESCC的新型診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物［25］，這對(duì)于早期檢測(cè)原發(fā)性ESCC 及轉(zhuǎn)移，降低疾病的發(fā)病率和死亡率具有重要意義。另有研究發(fā)現(xiàn)，miR-1246 與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)，可促進(jìn)肺癌的轉(zhuǎn)移［26］。本研究結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-1246 可促進(jìn)KYSE150 細(xì)胞遷移。推測(cè)miR-1246 可能通過(guò)EMT相關(guān)通路促進(jìn)食管鱗癌的轉(zhuǎn)移。

腫瘤細(xì)胞的自噬能夠維持線粒體功能，減少DNA損傷，增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)壓力的抵抗力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的代謝和生長(zhǎng)［27］。本研究結(jié)果表明，外泌體差異miRNA主要富集在自噬代謝通路上，可促進(jìn)ESCC自噬的發(fā)生，但其作用機(jī)制尚未明確。有研究在TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)miR-1246 靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BCL2 為miR-1246 的候選靶基因，BCL2 是一種抗自噬蛋白，通過(guò)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處的自噬蛋白Beclin 1的BH3結(jié)構(gòu)域直接相互作用，抑制細(xì)胞自噬［28］。因此，推測(cè)在miR-1246促進(jìn)ESCC 自噬過(guò)程中，BCL2 可能是miR-1246潛在的抑制靶點(diǎn)，但尚需進(jìn)一步研究確證。

外泌體miRNA的包裹和釋放均具有選擇性［18，29］，是通過(guò)特有的分選機(jī)制進(jìn)入外泌體［18］，如在健康供體的血清外泌體中，miR-21 的水平低于膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者［30］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-105 由轉(zhuǎn)移性BC 細(xì)胞特異性表達(dá)和分泌，可通過(guò)外泌體分泌轉(zhuǎn)移至內(nèi)皮細(xì)胞，從而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用［31］。因此，在食管癌中miR-1246 是否存在外泌體中含量遠(yuǎn)高于腫瘤組織的現(xiàn)象，是否通過(guò)特殊分選機(jī)制被特異性包裹進(jìn)入外泌體，值得深入研究。通過(guò)這種機(jī)制，腫瘤細(xì)胞選擇性釋放miR-1246，成為腫瘤微環(huán)境中的組成部分，從而反向促進(jìn)食管癌細(xì)胞自噬和轉(zhuǎn)移。但在該過(guò)程中，外泌體是否通過(guò)影響中間受體細(xì)胞促進(jìn)食管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，需要進(jìn)一步探討。

綜上所述，miR-1246可促進(jìn)ESCC細(xì)胞的自噬和轉(zhuǎn)移，為基于外泌體組成的食管癌腫瘤微環(huán)境的研究奠定了基礎(chǔ)。