來自混合菌群的聚乙烯醇降解酶的性能

張潔，王強(qiáng)，范雪榮，王平，向中林，張穎

（1江南大學(xué)生態(tài)紡織教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2江蘇聯(lián)發(fā)紡織股份有限公司，江蘇省生態(tài)染整技術(shù)重點實驗室，江蘇 海安 226601）

來自混合菌群的聚乙烯醇降解酶的性能

張潔1，王強(qiáng)1，范雪榮1，王平1，向中林2，張穎1

（1江南大學(xué)生態(tài)紡織教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2江蘇聯(lián)發(fā)紡織股份有限公司，江蘇省生態(tài)染整技術(shù)重點實驗室，江蘇 海安 226601）

以在無錫桃花山垃圾填埋場篩選出的具有較好降解聚乙烯醇（PVA）能力的混合菌群所產(chǎn)的PVA降解酶為研究對象，對其對不同聚合度和醇解度的PVA的降解能力以及降解條件進(jìn)行了研究，并對其降解PVA的機(jī)理進(jìn)行了初步探索。實驗結(jié)果表明，PVA降解酶降解PVA的能力受PVA聚合度和醇解度的影響較大，對PVA1799的降解效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對PVA1788和PVA124的降解效率；混合菌群產(chǎn)生的PVA降解酶降解PVA的最適溫度為40℃，最適pH為7.0；Fe2+對PVA降解酶酶活有一定的促進(jìn)作用，外加Fe2+能使酶活提高26%左右。PVA降解酶在最適條件下作用1 g/L的PVA1799 6 h后，PVA相對分子質(zhì)量降低14.8%，熔點由221.3℃ 降低至216.7℃。高效液相色譜（HPLC）結(jié)果分析表明降解產(chǎn)物中存在乙酸，碘仿反應(yīng)表明降解產(chǎn)物中存在甲基酮，PVA的降解途徑有可能是長碳鏈上相鄰的兩個羥基被氧化成羰基后水解斷裂并最終產(chǎn)生乙酸。

PVA降解酶；酶學(xué)性質(zhì)；相對分子質(zhì)量；降解產(chǎn)物

聚乙烯醇（PVA）是一種通過聚乙酸乙烯酯水解而得到的水溶性高聚物［1-2］。由于其具有諸多優(yōu)良的物理性能，如良好的黏附性、漿膜強(qiáng)韌性、耐磨性以及抗水和耐油污等，在紡織工業(yè)中作為上漿劑被廣泛使用［3］，但是其可生化性較差，是紡織工業(yè)棉織物退漿廢水中的主要污染物之一，PVA廢水的排放會給環(huán)境造成極大的危害［2］。在紡織工業(yè)中，若能使用PVA降解酶在退漿階段實現(xiàn)對PVA的生物降解，不僅能大大減少PVA廢水的排放，還能避免傳統(tǒng)堿退漿過程中高溫和氧化造成的棉纖維損傷［4］，PVA降解酶是一種具有市場前景的紡織退漿用酶［2］。PVA降解酶是一個酶系的總稱，這個酶系中的酶可以相互配合作用以催化PVA降解。

自20世紀(jì)70年代以來，國內(nèi)外學(xué)者篩選出多株可以降解PVA 的微生物，包括假單胞菌、放線菌、不動桿菌及芽孢桿菌等［5-8］。但是單一菌株存在培養(yǎng)周期長、酶產(chǎn)量低及降解不徹底的問題。在此基礎(chǔ)上也有研究者展開了關(guān)于不同微生物之間協(xié)同作用徹底降解PVA的研究［3,9-12］。

本文作者所在實驗室在前期研究中于無錫桃花山垃圾填埋場篩選出一個可完全降解2g/L PVA的混合菌群，經(jīng)MiSeq高通量測序方法［13-14］分析發(fā)現(xiàn)其中含有Stenotrophomonas（寡養(yǎng)單胞菌）、Pseudomonas（假單胞菌）、Sphingopyxis（鞘氨醇單胞菌）等菌屬，該混合菌群能夠產(chǎn)生具有較高活性的PVA降解酶，通過對發(fā)酵液及細(xì)胞破碎液的分析發(fā)現(xiàn)，該混合菌群產(chǎn)生的PVA降解酶基本分布在細(xì)胞膜上和細(xì)胞內(nèi)。本文主要研究了混合菌群所產(chǎn)的PVA降解酶降解PVA的條件、對不同聚合度和醇解度PVA的降解能力并對其降解PVA的機(jī)理進(jìn)行了初步探索。研究結(jié)果將對實現(xiàn)PVA降解酶在退漿工藝中的工業(yè)化應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1　實驗部分

1.1主要試劑

PVA1799（聚合度1700，醇解度98%～99%）、PVA1788（聚合度1700，醇解度87.0%～89.0%）、PVA124（聚合度2400，醇解度98%～99%），阿拉丁試劑；酵母粉，英國Oxoid公司；其他試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

培養(yǎng)基：PVA 3.0 g、NH4Cl 8.0 g、KH2PO42.0g、酵母粉1.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、FeSO4·7H2O 0.02g、無水CaCl20.1g、NaCl 0.02g、蒸餾水1000mL，pH 6.4。

碘-碘化鉀溶液：稱取2.5g KI用少量水溶解，后再加入0.65g I2，完全溶解后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶，定容搖勻，棕色試劑瓶避光保存。

硼酸溶液：稱取4g硼酸，用少量水溶解后定容到100mL。

1.2主要儀器

AL-204型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；TS-2102C型恒溫培養(yǎng)箱，上海天呈實驗儀器制造有限公司；TG16-WS型臺式高速離心機(jī)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；JY98-IIIN型超聲細(xì)胞粉碎儀，寧波SCIENTZ生物科技股份有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計，日本SHIMADZU公司；Waters 600 高效液相色譜儀，美國Waters公司；FD-IA-50型冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Q200 DSC差示掃描量熱儀，美國TA儀器公司。

1.3實驗方法

1.3.1菌種來源

從無錫桃花山垃圾填埋場篩選的混合菌群。

1.3.2PVA降解酶的制備

菌種保藏使用移液槍吸取培養(yǎng)72h的發(fā)酵液1mL至含0.5mL甘油的冷藏管中，于-70℃冰箱保藏。每次解凍一個甘油管或?qū)⑸洗伟l(fā)酵結(jié)束的混合體系吸取1mL接入裝有30 mL濃度為3g/L的PVA培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)3天。培養(yǎng)完成后，將發(fā)酵液于10000r/min下離心10min，收集沉淀物。用去離子水洗滌并離心（重復(fù)3次）后，將沉淀物溶于10mL磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.0，濃度為20mmol/L），超聲破碎（4℃，400W，工作3s，停2s，工作時間為30min），離心收集上清即為PVA降解酶粗酶液［15］。

1.3.3PVA含量測定

通過Finley法測定PVA的含量。取一定量的待測液，加入6mL顯色劑（碘化鉀-碘1mL，硼酸5mL），定容至25mL并搖勻，顯色15min，以空白樣為參比，測定其在645nm處的吸光度［16］。

1.3.4PVA降解酶酶活測定

粗酶液和反應(yīng)底物（1g/L PVA1799）等體積混合，將此混合體系置于30℃水浴中反應(yīng)6h，分別測定反應(yīng)前后的混合液在645nm處的吸光度。每分鐘吸光度下降0.001定義為一個酶活單位［17］。

1.3.5粗酶液對不同類型PVA的降解

將粗酶液和不同的反應(yīng)底物（PVA1788、PVA1799、PVA124濃度均為1g/L）等體積混合，將這些混合體系置于30℃水浴中反應(yīng)，分別于3h、6h、9h、12h、24h取樣，測定此時混合液中的PVA濃度。

1.3.6PVA降解酶最適pH的測定

配制一系列pH為4.0～10.0、濃度為0.2mol/L的緩沖溶液，其中檸檬酸緩沖溶液pH為4.0～6.0，磷酸鹽緩沖溶液pH為7.0～8.0，碳酸鈉緩沖溶液pH為9.0～10.0，將PVA1799溶于上述不同pH的緩沖溶液，配成濃度為1g/L的PVA溶液，然后按照PVA降解酶酶活測定方法測定其酶活。為減少實驗誤差，每個樣品均做3個平行樣。

1.3.7PVA降解酶最適溫度的測定

將等體積的PVA降解酶和底物（1g/L PVA1799，溶于最適pH的緩沖溶液中）混合，將該混合體系置于20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃的水浴中振蕩反應(yīng)6h，然后分別測定其酶活。為了減少實驗誤差，每個樣品均做3個平行樣。

1.3.8常見的金屬離子對酶活的影響

在反應(yīng)底物中分別加入Zn2+、Cu2+、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Fe2+，使它們的最終濃度均為0.5mmol/L，然后按照降解酶酶活測定方法測定其酶活（溫度和pH均為最適值）并與未加金屬離子的試樣進(jìn)行對比。

1.3.9熱分析

粗酶液與底物（1g/L PVA1799）等體積混合，將初始樣（未反應(yīng)）和反應(yīng)6h的樣冷凍干燥后進(jìn)行差示掃描量熱法（DSC）測定。將加有樣品的鋁坩堝置于鉑金樣品池中，以空的鋁坩堝作為參照。測試條件為：40～110℃，升溫速率為10℃/min，保溫10min后以10℃/min速度降溫到40℃，再以10℃/min速度升溫到260℃。

1.3.10降解前后PVA相對分子質(zhì)量測定

采用凝膠滲透色譜法（GPC）進(jìn)行PVA相對分子質(zhì)量的測定。色譜條件：檢測器為2410示差折光檢測器；流動相0.1mol/L硝酸鈉；流速0.9mL/min；柱溫45℃；進(jìn)樣量5μL。

1.3.11PVA降解產(chǎn)物分析

采用HPLC對降解產(chǎn)物進(jìn)行分析。實驗條件：流動相0.1mol/L磷酸氫二鉀，用磷酸調(diào)節(jié)pH為2.5；流速0.5mL/min，柱溫30℃；進(jìn)樣量5μL［17］。

用碘仿反應(yīng)測定反應(yīng)體系中的甲基酮：于試管中加入1mL0.5mol/L碘-碘化鉀溶液，加入5滴試樣后滴加3mol/L的氫氧化鈉溶液并不時振蕩。

2　結(jié)果與討論

2.1PVA降解酶對不同類型PVA的降解能力

考察PVA降解酶對不同類型PVA的降解能力，作用底物中PVA1788和PVA1799具有相同的聚合度和不同的醇解度，PVA1799和PVA124具有不同的聚合度和相同的醇解度（棉織物上漿漿料要求有一定的成膜性和成膜延展性，故未選擇聚合度太小的PVA進(jìn)行測定）。將粗酶液和不同的反應(yīng)底物（PVA1788、PVA1799、PVA124濃度均為1g/L）等體積混合，將這些混合體系置于30℃水浴中反應(yīng)，分別于3h、6h、9h、12h、24h于每個反應(yīng)體系取樣并測定此時樣品中剩余PVA濃度。把每個反應(yīng)體系初始PVA濃度均定為100%，用其余樣品中剩余PVA濃度為本體系中初始樣品PVA濃度的百分比值來表示各樣品的相對PVA濃度，各體系降解過程如圖1所示。

圖1　PVA降解酶對不同PVA的降解

從圖1可以看出，隨著反應(yīng)時間的增加，PVA1788的濃度幾乎不發(fā)生變化，而PVA1799和PVA124的濃度均逐漸降低。聚合度相同的情況下，醇解度高的PVA1799被迅速降解，而醇解不完全的PVA1788基本沒有被降解。醇解度均為99%的情況下，聚合度高的PVA124降解速率低于聚合度低的PVA1799，反應(yīng)結(jié)束時，PVA1799的降解率達(dá)到35%，而PVA124僅有13%。由此可見，反應(yīng)底物的醇解度和聚合度對于PVA降解酶的作用效果均有影響，且醇解度的影響更大。后續(xù)實驗均以降解效果最好的PVA1799為反應(yīng)底物，且PVA1799也是目前棉織物漿紗中最常用的PVA種類。

2.2PVA降解酶的最適反應(yīng)pH

將PVA降解酶與1g/L PVA（分別溶于pH 4.0～10.0的緩沖溶液）等體積混合，在30℃下振蕩反應(yīng)6h，分別測定PVA降解酶在不同pH下的酶活，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，PVA降解酶的酶活隨著pH值的增大呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，pH為7.0時酶活達(dá)到最大，因此，本研究中PVA降解酶應(yīng)用的最適pH為7.0。

2.3PVA降解酶的最適反應(yīng)溫度

將PVA降解酶與1g/L PVA（溶于pH為7.0的緩沖溶液）等體積混合，分別于20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃的水浴中振蕩反應(yīng)6 h，考察其在不同溫度下的酶活，結(jié)果如圖3所示。

圖2　PVA降解酶的最適pH

圖3　PVA降解酶的最適反應(yīng)溫度

由圖3可以看出，隨著反應(yīng)溫度從20℃到50℃，酶活先增大后減小，溫度為40℃時，酶活達(dá)到最大值。因此，PVA降解酶的最適反應(yīng)溫度為40℃。

2.4常見金屬離子對酶活的影響

在溫度為40℃、pH為7.0條件下考察不同金屬離子（濃度均為0.5mmol/L）對酶活的影響，由圖4可以看出，Ca2+、Mg2+、Mn2+及Fe2+均對酶活有不同程度的促進(jìn)作用，其中Fe2+的效果最明顯，能使酶活提高26%；而Zn2+、Cu2+均對酶活有不同程度的抑制作用，其中Zn2+的抑制效果最顯著，使酶活降低50%。

2.5降解前后PVA相對分子質(zhì)量的測定

將PVA降解酶與1g/L的PVA1799反應(yīng)底物等體積混合，在溫度為40℃、pH為7.0條件下反應(yīng)6h，對反應(yīng)前后的樣品均進(jìn)行酶失活處理，再用針頭過濾器對樣品進(jìn)行過濾（濾膜孔徑為0.22μm），通過GPC對反應(yīng)前后PVA分子量進(jìn)行測定，實驗結(jié)果如圖5所示。

比較圖5中的兩條曲線可以看出，反應(yīng)6h后樣品的肩峰消失，保留時間滯后，峰強(qiáng)度降低；對其進(jìn)行積分發(fā)現(xiàn)，重均分子量Mw較初始降低了14.8%，進(jìn)一步直觀說明PVA降解酶對PVA1799確有降解。

圖4　不同離子對PVA降解酶酶活的影響

圖5　降解前后PVA的凝膠色譜圖

2.6反應(yīng)前后樣品的DSC測試

粗酶液與反應(yīng)底物PVA799（濃度1g/L）等體積混合，在上述最適條件下（溫度為40℃、pH為7.0）反應(yīng)6h，將初始未反應(yīng)樣品和反應(yīng)后的樣品冷凍干燥后進(jìn)行DSC測試，得到曲線圖如圖6所示。

由圖6可以看出，初始樣品中PVA的熔點為221.3℃，當(dāng)反應(yīng)6h后，其熔點降至216.7℃。這可能是由于PVA分子內(nèi)和分子間存在大量的氫鍵，這使得其形成了穩(wěn)定的聚集態(tài)結(jié)構(gòu)，具有較高的結(jié)晶度，因而熔融溫度較高。PVA降解酶使得PVA大分子鏈發(fā)生斷裂，一定程度上破壞了其氫鍵結(jié)構(gòu)，降低了其結(jié)晶度，使得PVA的熔融溫度相應(yīng)降低。

圖6　反應(yīng)前后樣品的DSC曲線

2.7PVA降解酶降解PVA機(jī)理的初步探索

在混合菌群培養(yǎng)過程中及PVA降解酶降解PVA1799過程中體系pH均不斷降低，根據(jù)FUJITA等［18］提出PVA生物降解的可能途徑，推測降解產(chǎn)物中可能含有羧酸類物質(zhì)及酮類物質(zhì)，且有可能為PVA的結(jié)構(gòu)重復(fù)單元降解產(chǎn)生的乙酸，故采用分析酸類物質(zhì)的HPLC實驗條件進(jìn)行驗證。將PVA降解酶作用PVA1799 6h前后的樣品進(jìn)行HPLC測定，實驗結(jié)果如表1所示。

表1　PVA降解前后的HPLC分析結(jié)果

表1中0h數(shù)據(jù)為未反應(yīng)的溶液，因本研究中PVA降解酶為破碎細(xì)胞提取的粗酶液，故0h樣品液相色譜中出現(xiàn)了較多的峰。PVA降解酶與PVA作用6h后，與0h試樣相比，在11.348min出現(xiàn)新的峰，這與乙酸標(biāo)樣的出峰時間相吻合，表明體系中有乙酸生成，驗證了PVA降解酶的酶解作用。

甲基酮類化合物在堿性條件下與碘作用生成碘仿，碘仿為黃色晶體，容易識別，故甲基酮采用碘仿反應(yīng)進(jìn)行驗證，實驗結(jié)果如圖7所示。

從圖7中可以看出，未反應(yīng)初始樣未發(fā)生碘仿反應(yīng)，無黃色固體產(chǎn)生；反應(yīng)6h樣發(fā)生了碘仿反應(yīng)，有黃色固體產(chǎn)生，上述現(xiàn)象證明降解產(chǎn)物中存在甲基酮類物質(zhì)。

PVA1799的降解有可能是其長碳鏈上相鄰的醇羥基均被氧化成羰基后發(fā)生鏈斷裂產(chǎn)生羧基和甲基酮，而乙酸是PVA最終降解產(chǎn)物（圖8），該降解機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

圖7　甲基酮定性測定

圖8　PVA降解酶可能降解途徑

3　結(jié) 論

（1）PVA降解酶對不同類型的PVA降解能力不同，底物的醇解度及聚合度對于PVA降解酶的催化效率均有影響，醇解度高的PVA降解效率高，PVA聚合度增大會降低PVA降解酶的催化效率。本研究中發(fā)現(xiàn)本研究室篩選于無錫桃花山垃圾填埋場的混合菌群產(chǎn)生的PVA降解酶對棉織物上漿最常用的PVA1799的降解效果較好，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于對PVA1788和PVA124。

（2）PVA降解酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，最適pH為7.0。Ca2+、Mg2+、Mn2+及Fe2+均對酶活有不同程度的促進(jìn)作用，其中Fe2+的效果最明顯；而Zn2+、Cu2+均對酶活有不同程度的抑制作用，其中Zn2+的抑制效果最顯著。

（3）經(jīng)GPC測試發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)6h后，PVA1799的分子量較原先下降了14.8%，并且通過DSC測試發(fā)現(xiàn)，在用PVA降解酶作用6h后，PVA的熔點由初始的221.3℃降低至216.7℃。GPC和DSC均證明了PVA降解酶對PVA1799具有優(yōu)良的降解作用。

（4）通過HPLC及碘仿反應(yīng)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)PVA降解酶在降解PVA1799過程中產(chǎn)生乙酸及甲基酮，有可能的降解途徑是PVA1799長碳鏈上相鄰的羥基被氧化成羰基后斷裂水解生成羧基和甲基酮，乙酸是最終降解產(chǎn)物。

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Properties of PVA-degrading enzymes produced by a mixed microbial culture

ZHANG Jie1，WANG Qiang1，F(xiàn)AN Xuerong1，WANG Ping1，XIANG Zhongling2，ZHANG Ying1
（1Key Laboratory of Eco-Textiles，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，Jiangsu，China；2Key Laboratory of Ecological Dyeing and Finishing Technology，Jiangsu Lianfa Textile Co.，Ltd.，Hai'an 226601，Jiangsu，China）

The crude PVA-degrading enzymes were extracted from a mixed culture obtained by selective culturing with PVA as the sole carbon source. The degradation capability，enzymatic properties and degradation products of the enzymes were investigated in this study. The results indicated that the degradation of PVA1799 by the PVA-degrading enzymes was much better than those of PVA1788 and PVA124. The optimal temperature for the crude enzymes was 40℃ and the optimal pH was 7.0. Fe2+addition promoted the PVA-degrading enzymes' activity. It could increase the enzyme activity by about 26%. The relative molecular mass of PVA1799 decreased by 14.8% after 6 hours under the optimum conditions. At the same time，the melting point of the PVA sample was reduced from 221.3℃ to 216.7℃ after 6h. The results of High Performance Liquid Chromatography （HPLC）analysis indicated degradation products containing acetic acid. The iodoform reaction indicated the presence of methyl ketone in degradation products. A possible degradation pathway of PVA was oxidationto carbonyl group and breaking of the two adjacent hydroxyl groups on the long carbon chain. Acetic acid is the final product.

PVA-degrading enzyme；enzymatic properties；relative molecular mass；degradation products

TQ 92

A

1000-6613（2016）11-3634-06

10.16085/j.issn.1000-6613.2016.11.037

2016-05-03；修改稿日期：2016-06-28。

江蘇省產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合創(chuàng)新資金（BY2013015-18）、教育部長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃（IRT_15R26）、教育部新世紀(jì)人才支持計劃（NCET-12-0883）及江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目（PAPD）。

張潔（1992—），女，碩士研究生，主要研究方向為紡織生物技術(shù)。聯(lián)系人：張穎，副教授，碩士生導(dǎo)師。E-mail yingzhang@jiangnan.edu.cn。