固定化表面展示錳過氧化物酶對(duì)甲基橙的吸附特性

王艷君,黃佳瑤,陳少煌,趙鵬飛

(1.福建技術(shù)師范學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院,福清 350300;2.食品軟塑包裝技術(shù)福建省高校工程研究中心,福清 350300)

印染廢水來源及污染物成分十分復(fù)雜,具有水質(zhì)變化大、有機(jī)物含量高、色度高(主要為含偶氮染料)等特點(diǎn),直接排放危害人類健康和生態(tài)環(huán)境,同時(shí)造成水資源浪費(fèi)。如何減少廢水中偶氮染料的含量,同時(shí)有效控制其初級(jí)降解產(chǎn)物的危害,已成為印染廢水處理的主要問題?，F(xiàn)行的含偶氮染料的廢水處理方法,包括物理法、化學(xué)法、生物法等。生物法具有耗能低、代謝徹底、環(huán)境友好等特點(diǎn),是應(yīng)用最為廣泛的處理方法[1-2];但從目前的應(yīng)用狀況來看,投資和運(yùn)行費(fèi)用較高,有的操作復(fù)雜、后續(xù)處理程序繁瑣而難以推廣,尤其是對(duì)含有機(jī)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、高濃度的偶氮染料廢水的處理更具難度。隨著染料產(chǎn)品種類日益繁多,并朝著抗光解、抗氧化、抗生物氧化方向發(fā)展,染料廢水處理難度加大。廢水中還含有鹵化物、硝基物、苯胺、酚類,以及無機(jī)鹽等原料、輔料及副產(chǎn)品,更增加了該類廢水處理的難度。因此,尋求高效、低廉、簡(jiǎn)化的偶氮染料廢水處理技術(shù)已成為化學(xué)、環(huán)境和生物學(xué)家共同努力的目標(biāo)。

利用生物方法,主要有好氧法、厭氧法和以細(xì)菌、真菌、藻類、酶為基礎(chǔ)的微生物修復(fù)技術(shù),以微生物來減輕或消除偶氮染料廢水的污染已有報(bào)道。如摩根菌(Morganellasp.)[3]、裂褶菌(Schizophyllumsp.)[4-5]、小球藻(Chlorellavulgaris)[6]等微生物均被考慮用作偶氮染料廢水的生物處理劑。最初,國內(nèi)外主要通過大規(guī)模的微生物篩選方法,從自然界中獲得對(duì)偶氮染料具有吸附及降解功能的天然菌株,研究發(fā)現(xiàn),在多種微生物細(xì)胞內(nèi)普遍存在對(duì)偶氮染料具有降解功能的酶類,脫色原因均是染料被酶分解,特別是偶氮雙鍵被打開[7]。在真菌中是以白腐真菌(Phanerochaetcchrysosporium)為主要的偶氮染料廢水脫色降解菌[8-9],它的降解機(jī)理主要是在好氧條件下產(chǎn)生的胞外酶類,如木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)、漆酶(LaC)和錳依賴過氧化物酶(MnP),其中,MnP是主要的染料降解脫色的胞外酶[10-11],該酶具有高度的非特異性和強(qiáng)氧化性,對(duì)許多結(jié)構(gòu)不同、穩(wěn)定性高的有機(jī)物具有廣譜的降解能力[12-13]。因而真菌在偶氮染料廢水處理中具有極大的優(yōu)勢(shì),但在實(shí)際應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)絲狀真菌的生長速度較慢,且對(duì)周圍環(huán)境的高鹽、高堿等耐受性較差,酵母菌由于兼具細(xì)菌生長速度快和絲狀真菌的高產(chǎn)胞外酶等優(yōu)點(diǎn),同時(shí)又可避免細(xì)菌不能將染料徹底降解的缺陷和絲狀真菌生長緩慢的不足,在染料脫色方面具有巨大應(yīng)用潛力。酵母菌是一大類群?jiǎn)渭?xì)胞真菌,具有生長代謝速度快,可產(chǎn)生多種酶類、反應(yīng)器設(shè)計(jì)容易,廢水處理效率高、耐受高有機(jī)負(fù)荷和高鹽環(huán)境,成為污水處理技術(shù)中很有前途的菌種資源。

酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于可將外源蛋白錨定于細(xì)胞表面,利用全細(xì)胞作為生物催化劑,可省去酶的純化步驟,提高全細(xì)胞催化劑的反復(fù)利用率,該方法也被廣泛用于蛋白質(zhì)文庫篩選[14]、疫苗研制[15]、生物催化劑[16]等領(lǐng)域,也在多種酶[17-18]的生物催化過程中發(fā)揮了重要作用。

本實(shí)驗(yàn)室已成功篩選到高產(chǎn)錳過氧化物酶的裂褶菌(Schizophyllumcommune),并獲取錳過氧化物酶基因構(gòu)建了酵母表面展示載體,本研究以此為基礎(chǔ),預(yù)期在偶氮染料的生物降解領(lǐng)域及構(gòu)建全細(xì)胞偶氮染料催化劑發(fā)揮重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與試劑

酵母菌株EBY100購自Invitrogen公司、酵母表面展示質(zhì)粒pYD1-mnp為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

YNB培養(yǎng)基:葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母粉1%、瓊脂粉2%。MD培養(yǎng)基:YNB 0.67%、葡萄糖2%、亮氨酸0.01%、瓊脂粉2%。YNB-CAA培養(yǎng)基:YNB 0.67%、酸水解酪氨酸0.5%、半乳糖2%、瓊脂粉2%。

變性鮭魚精DNA:在-20 ℃下保存,使用時(shí)沸水浴中煮沸5 min。FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)、HA抗體購自碧云天生物技術(shù)公司。

1.1.2 醋酸鋰轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞

吸取酵母細(xì)胞EBY100感受態(tài)100 μL,加入質(zhì)粒DNA 1 μg、100 μg的鮭魚精DNA混勻;吸取700 μL的1×LiAC/40%PEG-3350/1×TE液體與上述EBY100感受態(tài)混勻,于30 ℃水浴鍋內(nèi)孵育30 min后加入88 μL的DMSO,置于42 ℃水浴鍋內(nèi)孵育7 min,5 000 r/min離心30 s,取上清液20 μL,加入1 mL的1×TE離心30 s后取上清液加入50 μL的1×TE混勻后涂布于MD培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng)3～5 d;挑取單菌落接種至YNB-CAA液體培養(yǎng)基中,30 ℃、250 r/min培養(yǎng)過夜,提取酵母基因組為模板,以pYD1特異性引物(5′-AGTAACGTTTGTCAGTAATTGC-3′/5′-GTCGATTTTGTTACATCTACAC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,獲取陽性轉(zhuǎn)化子保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 誘導(dǎo)酵母轉(zhuǎn)化子產(chǎn)酶

吸取10 μL EBY100/mnp轉(zhuǎn)化子菌液于YNB-CAA誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中,30 ℃,180～220 r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)144 h,每隔12 h取樣一次,用于測(cè)定酶活性及后續(xù)SDS-PAGE試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 酶活的測(cè)定

(1)酵母轉(zhuǎn)化子產(chǎn)MnP酶活測(cè)定。酶活性測(cè)定方法為2,6-二甲氧基苯酚(DMP)法,于469 nm處測(cè)定2,6-二甲氧基苯酚(2.6-DMP)的氧化量進(jìn)行MnP的酶活計(jì)量[19]。測(cè)定體系為4 mL,其中0.1 mmol/L酒石酸鈉緩沖液3.36 mL(pH 4.5),10 mmol/L MnSO4200 μL,10 mmol/L 2.6-DMP 200 μL,10 mmol/L H2O240 μL,酶液樣品200 μL。30 ℃水浴5 min,以4 mL蒸餾水做對(duì)照,測(cè)定其吸光度在469 nm處3 min內(nèi)單位時(shí)間的吸光度變化值。以上試劑濃度均為終濃度,DMP被氧化后的產(chǎn)物的消光系數(shù)ε=49 600(L/mol·cm)。

一個(gè)酶活單位定義為每分鐘內(nèi)生成1 mol產(chǎn)物所需的酶液。酶活的計(jì)算方法[20]:U=(106×ΔA×V總)/(V酶×ε×ΔT×L),其中,ΔA為單位時(shí)間內(nèi)吸光度的變化值;V總為反應(yīng)體系的總體積,各方法反應(yīng)體系均為4 mL;V酶為參與反應(yīng)酶液的體積;ε為不同消光系數(shù);ΔT為單位時(shí)間,均為1 min;L為比色皿的直徑,本實(shí)驗(yàn)所用比色皿直徑為1 cm;1 mol和mmol之間的單位換算為103,L和mL之間的單位換算為103,故總乘以106。

(2)不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酶活性的影響。誘導(dǎo)產(chǎn)酶的時(shí)間從第12小時(shí)至第144小時(shí)。每隔12 h取樣一次,酶活性的測(cè)定方法同上。

(3)不同溫度、pH對(duì)酶活性的影響。溫度設(shè)定為20、30、40、50和60 ℃中水浴20 min,水浴后迅速冷卻降溫,測(cè)定錳過氧化物酶的酶活。pH值分別設(shè)定為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0和5.5。

(4)產(chǎn)酶最適碳源選擇及最佳碳源濃度測(cè)定。以不加半乳糖的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基(YNB-CAA培養(yǎng)基)為基礎(chǔ),設(shè)置葡萄糖、乳糖、半乳糖、蔗糖、麩皮、麥芽糖等6種不同碳源進(jìn)行產(chǎn)酶活性測(cè)定。以上述測(cè)定結(jié)果獲得的最適碳源為基礎(chǔ),分別加入0.008、0.012、0.016、0.020、0.024、0.028 g/mL的半乳糖,檢測(cè)不同碳源濃度對(duì)產(chǎn)酶活性的影響。

(5)產(chǎn)酶最適氮源選擇及最佳氮源濃度測(cè)定。以不加YNB的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基(YNB-CAA培養(yǎng)基)為基礎(chǔ),設(shè)置硝酸鉀、硫酸銨、蛋白胨、YNB不同的氮源處理,篩選出最適氮源。以上述測(cè)定結(jié)果獲得的最適氮源為基礎(chǔ),分別加入0.005 6、0.006 0、0.006 4、0.006 8、0.007 2和0.007 6 g/mL的YNB,檢測(cè)不同氮源濃度對(duì)產(chǎn)酶活性的影響。

1.2.2 SDS-PAGE檢測(cè)

制備SDS-PAGE分離膠濃度為 12%,濃縮膠濃度為5%,電泳緩沖液pH值為8.8。蛋白樣品為前面每12 h測(cè)酶活時(shí)所保存的樣品。

1.2.3 免疫熒光檢測(cè)

制片封閉結(jié)束后添加一抗HA抗體(小鼠單抗),使用比例為1∶40,使用1%的BSA稀釋,在玻片周圍添加20～50 μL,4 ℃過夜,于0.01 mol/L PBS溶液中泡洗3次,每次5～10 min;添加二抗FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L),使用比例為1∶500,使用1%的BSA稀釋,在玻片周圍添加20～50 μL,室溫避光放置30 min后于0.01 mol/L PBS中浸泡3次,每次5～10 min;置于免疫熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 固定化酵母細(xì)胞及轉(zhuǎn)化子

取6 g氯化鈣,溶于300 mL去離子水中,配成含量為2%的溶液,放置到42 ℃的水浴鍋中,用注射器(11#)將海藻酸鈉-酵母菌混合液在一定高度下緩慢滴入氯化鈣溶液中造粒后置于4 ℃冰箱中固定化1 h。過濾掉容器內(nèi)的液體,用去離子水洗滌所得固體一次后,再次過濾備用。將海藻酸鈉固定化釀酒酵母EBY100微球(簡(jiǎn)稱SA-EBY100)和海藻酸鈉固定化釀酒酵母EBY100-MnP微球(簡(jiǎn)稱SA-EBY100-MnP)于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 甲基橙吸附率

取一定量的固定化酵母和一定濃度的甲基橙溶液,在150 r/min下恒溫振蕩3 h使吸附平衡,分離后取上清液于464 nm 處測(cè)定吸光度,計(jì)算得到固定化酵母對(duì)甲基橙的吸附率和吸附量。

吸附率:η=[(A-B)/A)]×100%;其中,A為甲基橙的初始濃度,mol/L;B為吸附后的甲基橙濃度,mol/L。

平衡吸附量:Qe=[(Co-Ce) ×V]/m;其中,Qe為材料的平衡吸附量,mg/g;Ce為吸附平衡后溶液中甲基橙的濃度,mg/L;Co為初始甲基橙的濃度,mg/L;V為甲基橙溶液的體積,L;m為加入的吸附劑的質(zhì)量,g。

(1)等溫吸附試驗(yàn)。分別移取濃度為10、20、30、40和50 mg/L的甲基橙溶液25 mL,加入2.5 g固定化酵母細(xì)胞,調(diào)節(jié)pH值為5.0,在30 ℃下振蕩3 h,測(cè)量甲基橙的平衡濃度Ce,計(jì)算平衡吸附量Qe,根據(jù)上述步驟,進(jìn)行不同溫度(20、25、30和35℃)下的吸附試驗(yàn)。線模型有Langmuir方程及Freundlich方程[19]。

Langmuir:Ce/Qe=Ce/Qm+1/(Qmb);Freundlich:lgQe=(1/n)lgCe+lgKF;其中,Qm為最大吸附飽和量,mg/g,Qe為溶液的平衡吸附量,mg/g,b為吸附強(qiáng)度,KF為吸附系數(shù),1/n為吸附指數(shù)[19]。

(2)吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。分別稱取2.5 g固定化酵母置于含100 mL不同濃度(10、30和50 mg/L)甲基橙溶液中,pH 5.0,在30 ℃、150 r/min下振蕩吸附,每隔一定時(shí)間取樣測(cè)定甲基橙濃度,計(jì)算不同時(shí)刻甲基橙吸附量。Qt=(Co-Ct)V/W,其中,Qt為t時(shí)刻的吸附容量,mg/g;Ct為t時(shí)刻的溶液中吸附質(zhì)的質(zhì)量濃度,mg/L;V為甲基橙溶液體積,mL;W為吸附劑用量,g。準(zhǔn)一級(jí)方程:lg(Qe-Qt)=lgQe-k1t;準(zhǔn)二級(jí)方程:t/Qt=1/k2Qe2+t/Qe,其中,Qe為吸附平衡量,mg/g,Qt為某時(shí)刻的吸附量,mg/g,K1為準(zhǔn)一級(jí)方程的動(dòng)力學(xué)常數(shù),K2為準(zhǔn)二級(jí)方程的動(dòng)力學(xué)常數(shù)[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 錳過氧化物酶基因的酵母細(xì)胞表面展示

Mnp基因兩端引入BamH I/EcoR I酶切位點(diǎn),與pYD1載體雙酶切后連接;正向插入pYD1載體。將構(gòu)建成功的載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母EBY100,通過LiAc介導(dǎo)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化子可在篩選平板MD上生長,如圖1所示,挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR及酶切鑒定進(jìn)一步確認(rèn)mnp基因片段已按預(yù)期設(shè)計(jì)的形式正確轉(zhuǎn)入EBY100。從而完成EBY100的表面展示。

(a)轉(zhuǎn)化子在MD平板上的篩選結(jié)果;(b)轉(zhuǎn)化子在MM平板上的篩選結(jié)果;(c)轉(zhuǎn)化子的酶切鑒定結(jié)果。

2.2 轉(zhuǎn)化子產(chǎn)MnP的最佳時(shí)間

錳過氧化物酶的酶活性隨培養(yǎng)時(shí)間變化,如圖2所示,轉(zhuǎn)化子所產(chǎn)錳過氧化物酶活性從第12小時(shí)到第60小時(shí)內(nèi)隨時(shí)間的增加而不斷增大,而從第60小時(shí)后至第144小時(shí)錳過氧化物酶的活性隨時(shí)間的增加而減少。在第60小時(shí)錳過氧化物酶的酶活性最高。

圖2 EBY-MnP轉(zhuǎn)化子產(chǎn)錳過氧化物酶隨培養(yǎng)時(shí)間的變化

2.3 轉(zhuǎn)化子產(chǎn)MnP的最適溫度

酵母轉(zhuǎn)化子所產(chǎn)錳過氧化物酶酶活在40 ℃酶活最高,結(jié)果如圖3所示,在20～30 ℃范圍內(nèi)錳過氧化物酶活性呈上升趨勢(shì),而30 ℃后錳過氧化物酶活性增加的幅度變大,溫度在40 ℃以后錳過氧化物酶的酶活開始下降,且錳過氧化物酶酶活下降的幅度大,到60 ℃檢測(cè)不到該酶活性。

圖3 溫度對(duì)錳過氧化物酶活性的影響

2.4 pH對(duì)錳過氧化物酶活性的影響

測(cè)定酵母轉(zhuǎn)化子產(chǎn)錳過氧化物酶在pH 3.5～4.5時(shí)逐漸升高,pH 4.5～5.5時(shí)逐漸降低,MnP活性在pH 3.5和5.5時(shí)呈現(xiàn)最低值,結(jié)果如圖4所示,pH 4.5時(shí)MnP的活性最高,pH對(duì)錳過氧化物酶酶活性的影響較大。

圖4 pH對(duì)錳過氧化物酶活性的影響

2.5 轉(zhuǎn)化子產(chǎn)MnP活性的碳源選擇及最適濃度

分別選擇不同碳源,測(cè)定轉(zhuǎn)化子產(chǎn)錳過氧化物酶的活性,由圖5可知,以麥芽糖、蔗糖為碳源時(shí),EBY100-MnP轉(zhuǎn)化子產(chǎn)MnP酶活性為0;以葡萄糖為碳源時(shí),測(cè)得的MnP酶活性較低,僅為0.81 U;半乳糖、乳糖、麩皮均可使酵母轉(zhuǎn)化子產(chǎn)MnP酶,半乳糖是EBY100-MnP轉(zhuǎn)化子產(chǎn)MnP酶的最佳碳源。

圖5 不同碳源對(duì)產(chǎn)MnP酶活性的影響

隨著半乳糖濃度升高,酶活性隨之升高,但在0.020～0.028 g/mL的半乳糖濃度下,酶活性隨之降低,可見濃度過高的半乳糖會(huì)抑制轉(zhuǎn)化子產(chǎn)錳過氧化物酶,因而選擇最佳半乳糖濃度為0.020 g/mL(圖6)。

圖6 半乳糖濃度對(duì)轉(zhuǎn)化子產(chǎn)MnP酶活性的影響

2.6 轉(zhuǎn)化子產(chǎn)MnP活性的氮源選擇及最適濃度

分別選擇不同氮源對(duì)轉(zhuǎn)化子產(chǎn)錳過氧化物酶的活性進(jìn)行測(cè)定,由圖7可知,YNB、硫酸銨、硝酸鉀、蛋白胨均可使轉(zhuǎn)化子EBY100-MnP產(chǎn)MnP酶,其中YNB為最佳的氮源,測(cè)得錳過氧化物酶活性為11.70 U。當(dāng)YNB濃度為0.007 2 g/mL時(shí),酵母轉(zhuǎn)化子(EBY100-MnP)產(chǎn)MnP酶酶活性最高(圖8),最高值為13.71U,因此,后續(xù)試驗(yàn)選擇最佳氮源YNB的添加量為0.007 2 g/mL。

圖7 不同氮源對(duì)產(chǎn)MnP酶的影響

圖8 YNB濃度對(duì)產(chǎn)MnP酶的影響

2.7 SDS-PAGE及免疫熒光檢測(cè)

經(jīng)軟件預(yù)測(cè)錳過氧化物酶基因所表達(dá)的蛋白分子量約為30 ku,與圖9所示SDS-PAGE電泳結(jié)果基本一致,并經(jīng)過免疫熒光(圖10)檢測(cè)證明外源蛋白成功錨定于酵母細(xì)胞表面。

1～3:轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)12 h的粗酶液;4～6:24 h;7～9:36 h;10～12:48 h;13～15:60 h;16～18:72 h;MK:蛋白Marker(14.4～97 ku)。

圖10 酵母轉(zhuǎn)化子的免疫熒光檢測(cè)

2.8 吸附熱力學(xué)

經(jīng)過線性回歸擬合(圖11),在不同溫度下,SA-EBY和SA-EBY-MnP對(duì)甲基橙的吸附實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與Freundlich等溫吸附方程擬合效果更佳(表1),這表明吸附劑對(duì)甲基橙的吸附不僅僅是一個(gè)單組分的單層均勻吸附過程,還是固定化酵母吸附劑中各組分均有發(fā)揮一定的吸附作用。

表1 SA-EBY及SA-EBY-MnP對(duì)甲基橙的吸附等溫線常數(shù)

(a)EBY-MnP對(duì)甲基橙的吸附等溫線;(b) EBY對(duì)甲基橙的吸附等溫線。

通常1/n在0～1,其值的大小體現(xiàn)吸附劑吸附能力的高低,1/n越小,表示吸附能力越好,1/n在0.1～0.5表示較好吸附,而1/n大于2時(shí)表示難吸附[22],由表1可知,兩種吸附劑對(duì)剛果紅都較易吸附。

2.9 吸附動(dòng)力學(xué)

為了研究SA-EBY及SA-EBY-MnP對(duì)甲基橙的吸附機(jī)理,分別利用準(zhǔn)一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程(圖12)對(duì)載體吸附甲基橙的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行了回歸擬合[23]。準(zhǔn)一級(jí)方程:lg(Qe-Qt)=lgQe-k1t;準(zhǔn)二級(jí)方程:t/Qt=1/k2Qe2+t/Qe。比較兩個(gè)方程擬合的相關(guān)系數(shù)(R2)可知(表2),準(zhǔn)二級(jí)方程對(duì)溶液中甲基橙的吸附行為均有很好的描述(R2>0.99),準(zhǔn)一級(jí)方程的擬合程度較差[19]。盡管準(zhǔn)一級(jí)方程已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種吸附過程,但由于在一級(jí)模型作圖之前需要通過實(shí)驗(yàn)確定平衡吸附容量Qe,而實(shí)際吸附過程中,準(zhǔn)確測(cè)得其平衡吸附量的可能性較小[22]。而準(zhǔn)二級(jí)方程恰好能真實(shí)全面地反映甲基橙在載體上的吸附機(jī)理,包含了吸附過程,如外部液膜擴(kuò)散、表面吸附和顆粒內(nèi)擴(kuò)散等[24]。

表2 SA-EBY及SA-EBY-MnP對(duì)甲基橙的吸附動(dòng)力學(xué)參數(shù)

(a)EBY-MnP對(duì)甲基橙的吸附動(dòng)力學(xué);(b) EBY對(duì)甲基橙的吸附動(dòng)力學(xué)。

SA-EBY及SA-EBY-MnP對(duì)甲基橙的吸附速率相似,SA-EBY-MnP的吸附率比SA-EBY高2.58%,吸附3 h后達(dá)到吸附平衡。

3 討論

目前,國內(nèi)外有關(guān)生物法在偶氮染料廢水處理方面的應(yīng)用較多,利用生物降解法有效緩解了偶氮染料降解過程中的二次污染問題,但生物材料的吸附效率及重復(fù)利用率,以及自身的穩(wěn)定性也成為制約該技術(shù)應(yīng)用的瓶頸,因此,研究生物吸附材料特性的重要性尤為突出。

以海藻酸鈉固定化釀酒酵母EBY100和EBY100-MnP,形成生物吸附劑型復(fù)合載體對(duì)甲基橙進(jìn)行吸附效果的測(cè)定,并分析各條件下吸附效果的最佳比例,為其作為生物吸附劑的開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。固定化酵母在酸性條件下的吸附效果明顯優(yōu)于在堿性條件下的吸附效果,在30 ℃的條件下,復(fù)合載體對(duì)溶液中甲基橙的吸附行為合乎Freundlich模型吸附等溫式,不是一個(gè)單分子層均勻吸附過程[25],因此,酵母細(xì)胞和海藻酸鈉均在吸附過程中發(fā)揮作用,復(fù)合載體SA-EBY100-MnP對(duì)甲基橙的吸附比復(fù)合載體SA-EBY100對(duì)甲基橙的吸附更容易。動(dòng)力學(xué)研究表明,復(fù)合載體對(duì)溶液中甲基橙的吸附過程符合準(zhǔn)二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程,說明復(fù)合載體對(duì)甲基橙的吸附動(dòng)力學(xué)主要是受化學(xué)作用所控制,而不是受物質(zhì)傳輸步驟所控制[25]。

細(xì)胞表面展示酶制備的全細(xì)胞催化劑已有很多成功的實(shí)例,Katahira等[26]將兩種木聚糖水解酶展示于釀酒酵母細(xì)胞表面獲得了能將木聚糖轉(zhuǎn)化為木糖全細(xì)胞催化劑;Shibasaki等[27]將纖維素水解酶展示于釀酒酵母細(xì)胞表面,構(gòu)建成直接利用纖維素的細(xì)胞株,如將羧甲基纖維素酶和β-葡糖苷酶共展示于酵母細(xì)胞表面,重組菌株能以纖維寡糖作為單一碳源的培養(yǎng)基中生長;Fujita等[28]將內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ和β-葡糖苷酶共展示于酵母細(xì)胞表面,重組菌株能直接利用β-葡聚糖的培養(yǎng)基生成乙醇;Wang等[29]將有機(jī)磷降解酶和纖維素結(jié)合域(CBD)同時(shí)展示于E.coliXL-1-Blue細(xì)胞表面,構(gòu)建了既能特異、牢固地吸附在纖維素上又能同步降解有機(jī)磷農(nóng)藥的工程菌株。

野生菌種對(duì)有機(jī)物染料的處理能力大多較弱,只能吸附分解掉少量的染料,而用固定化方式將微生物材料做成凝膠球,用來處理污染物則有著成本低廉、制備簡(jiǎn)單、效果顯著、材料性質(zhì)穩(wěn)定、回收方便等優(yōu)勢(shì)。且該復(fù)合載體可多次使用,可持續(xù)性強(qiáng),因此,利用海藻酸鈉負(fù)載釀酒酵母制備的微球吸附甲基橙,探討復(fù)合載體吸附甲基橙的最佳吸附條件,并將其應(yīng)用到偶氮染料的生物吸附過程中具有一定的研究價(jià)值。