微藻餌料添加光合細菌對安氏偽鏢水蚤發(fā)育和繁殖的影響

潘 姚,李 峰,高夢晗,彭 珂,芮祥雨,李長玲,黃翔鵠

(廣東海洋大學 水產(chǎn)學院,湛江 524025)

海水魚類養(yǎng)殖業(yè)是中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要組成部分[1]。苗種培育是海水魚類養(yǎng)殖的關(guān)鍵環(huán)節(jié),在海水魚類苗種培育過程中,營養(yǎng)全面的適口生物餌料是育苗成功的關(guān)鍵。目前市場上生物餌料主要以輪蟲、鹵蟲(豐年蟲)以及單細胞藻類等為主,這些餌料營養(yǎng)不足且成分不穩(wěn)定,缺乏魚類生長發(fā)育的必需脂肪酸。相比輪蟲和鹵蟲,海洋橈足類在成長過程中需要經(jīng)過11～12個階段的變態(tài),才能發(fā)育為成體,其大小通常在100～1 000 μm,可為水生動物幼體提供不同口徑的開口餌料[2]。此外,橈足類富含EPA、DHA、游離氨基酸和一些其他必需微量營養(yǎng)素以及消化酶,更有利于魚類幼體生長發(fā)育。研究表明,海洋橈足類是人工育苗魚蝦的理想活餌料,投喂橈足類培苗的成活率可高達85%以上[3]。然而,橈足類人工繁殖速率低,目前仍未能實現(xiàn)大規(guī)模培養(yǎng)[4],市場一直處于供不應(yīng)求狀態(tài)。

在實際培養(yǎng)過程中,單胞微藻具有營養(yǎng)豐富、生長繁殖迅速和易培養(yǎng)等特點,常作為橈足類餌料[5]。由于細胞大小和營養(yǎng)成分存在較大差異,喂食不同的單胞微藻會顯著影響橈足類的生長和繁殖[6-7]。因此,篩選合適的餌料微藻對提高橈足類的生長和繁殖至關(guān)重要。除了餌料微藻,光合細菌也在動物性生物餌料培養(yǎng)方面發(fā)揮著重要作用[8-9]。光合細菌含有豐富的蛋白質(zhì)、B族維生素、促生長因子、輔酶Q、抗病毒因子和色素等生理活性物質(zhì),是一種營養(yǎng)豐富的飼料添加劑[10]。以一定濃度光合細菌與單胞藻混合投喂,可以顯著提高輪蟲的產(chǎn)量[8,11]。但目前,關(guān)于光合細菌作為餌料添加劑對橈足類發(fā)育、生殖的影響的報道甚少。本文以安氏偽鏢水蚤(Pseudodiaptomusannandalei)為試驗對象,首先研究不同微藻餌料對安氏偽鏢水蚤生長和生殖的影響,然后以光合細菌作為餌料添加劑,比較分析在餌料微藻中添加光合細菌對安氏偽鏢水蚤發(fā)育和繁殖的影響,研究結(jié)果將為建立橈足類規(guī)模化養(yǎng)殖用餌料體系提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 安氏偽鏢水蚤的采集與培養(yǎng)

安氏偽鏢水蚤用13 #浮游生物網(wǎng)采集自湛江廢棄池塘(20°56′10.48″N,110°31′46.46″E)[12],實驗室鏡檢,在解剖鏡下挑出行動能力強的帶卵安氏偽鏢水蚤,置于滅菌后的海水中培養(yǎng),培養(yǎng)餌料為湛江等鞭金藻。培養(yǎng)條件:溫度28 ℃,鹽度27,光照1 200 lx,連續(xù)培養(yǎng)多代后取其子代作為實驗對象[13]。

1.2 微藻培養(yǎng)

實驗用微藻共4種,分別為湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)、牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)、威氏海鏈藻(Conticribraweissflogii)、小球藻(Chlorellavulgaris)。藻種由廣東海洋大學藻類資源與養(yǎng)殖環(huán)境修護團隊提供。培養(yǎng)基為海 f/2培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為室溫25 ℃,光照3 000 lx,24 h全光照,使用過濾空氣通氣培養(yǎng)。培養(yǎng)至指數(shù)生長期進行實驗。

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 微藻餌料對安氏偽鏢水蚤發(fā)育和繁殖的影響

(1)發(fā)育實驗。在解剖鏡下挑選出健康活潑剛孵出的NⅡ期無節(jié)幼體10只,放入15 mL試管中每根試管中加入新鮮海水10 mL,并標記[14]。培養(yǎng)條件:溫度28 ℃,鹽度27,光照1 200 lx。每日投喂新鮮的餌料微藻,使水體中餌料濃度為1 mgC/L(按含碳量計),每日投喂1次,投喂前完全換水。實驗設(shè)置4個實驗組,分別投喂湛江等鞭金藻、牟氏角毛藻、威氏海鏈藻以及小球藻,每個實驗組設(shè)置A和B兩組,A組用于無節(jié)幼體發(fā)育的觀察,B組用于橈足幼體發(fā)育的觀察,每組3個平行。開始時,每6 h觀察幼體發(fā)育情況,等幼體發(fā)育到NⅤ期無節(jié)幼體和CⅣ橈足幼體時,改為每2 h觀察一次。每次隨機抽取3～4個幼體進行觀察,觀察完立即把幼體放回原試管中,分別記錄無節(jié)幼體和橈足幼體的發(fā)育時間和存活率。

(2)繁殖實驗。在解剖鏡下挑選成熟雄性和掛卵的雌性安氏偽鏢水蚤各1只放入15 mL試管中,每根試管中加入新鮮海水10 mL[15]。實驗設(shè)置4個實驗組,分別投喂湛江等鞭金藻、牟氏角毛藻、威氏海鏈藻以及小球藻,每個實驗組設(shè)3個平行,每日投喂一次,餌料微藻的濃度(按含碳量計)控制為1.0 mgC/L。每日觀察安氏偽鏢水蚤的產(chǎn)幼情況,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)幼及時對其進行計數(shù),并挑出親體置于新鮮的藻液中繼續(xù)培養(yǎng)。實驗連續(xù)進行10 d,記錄產(chǎn)幼次數(shù)和產(chǎn)幼數(shù)量。

1.3.2 餌料微藻添加光合細菌對安氏偽鏢水蚤發(fā)育和繁殖的影響

(1)發(fā)育實驗。在解剖鏡下挑選健康活潑剛孵出的NⅡ期無節(jié)幼體10只,放入15 mL試管中,每根試管中加入新鮮海水10 mL,并標記。微藻餌料為1.3.1節(jié)實驗中效果最佳的藻類。光合細菌購自廣東綠百多生物開發(fā)有限公司,其活菌數(shù)量>0.5×108cfu/mL。實驗共設(shè)置5個實驗組,每組每次除了使水體中微藻濃度為1 mgC/L外,還分別投喂不同比例光合細菌。光合細菌的投喂方法:將光合細菌用8 000 r/min的速度離心后加蒸餾水稀釋后投喂橈足,使水體中光合細菌濃度分別為0、0.25、0.5、1以及2 mgC/L。每個實驗組設(shè)置A和B兩組,A組用于無節(jié)幼體發(fā)育的觀察,B組用于橈足幼體發(fā)育的觀察,每組3個平行。培養(yǎng)條件和觀察方法同1.3.1。

(2)繁殖實驗。在解剖鏡下挑選成熟雄性和掛卵的雌性安氏偽鏢水蚤各1只放入15 mL試管中,每根試管中加入新鮮海水10 mL。實驗共設(shè)置5個實驗組,每組除使水體中微藻為1 mgC/L外,還分別投喂不同比例的光合細菌,投喂方法同1.3.2節(jié)中的發(fā)育實驗。每組設(shè)置3個平行。每天觀察安氏偽鏢水蚤的產(chǎn)幼情況,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)幼及時對其進行計數(shù),并挑出親體置于新鮮的藻液中繼續(xù)培養(yǎng)。實驗連續(xù)進行10 d,記錄產(chǎn)幼次數(shù)和產(chǎn)幼數(shù)量。

1.4 含碳量的測定

藻液和菌液的含碳量用德國耶拿Multi N/C 2100型總有機碳分析儀檢測。

1.5 發(fā)育時間的確定

發(fā)育時間通過計算半數(shù)發(fā)育時間來確認[16]。

1.6 存活率的確定

存活率(Survival rate,SR)按公式計算:

SR =n/10×100%

式中n代表存活的幼體數(shù)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel做初步處理,采用SPSS軟件,對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-Way ANOVE)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同微藻餌料對安氏偽鏢水蚤發(fā)育和生殖的影響

不同微藻餌料對安氏偽鏢水蚤的發(fā)育時間有顯著影響(P<0.05)。在無節(jié)幼體到橈足幼體期,如圖1(a)所示,飼喂湛江等鞭金藻的安氏偽鏢水蚤,其無節(jié)幼體到橈足幼體發(fā)育時間最短,為70 h。其次是角毛藻組,其發(fā)育時間為74 h。然后是海鏈藻組,其發(fā)育時間為84 h。飼喂小球藻的安氏偽鏢水蚤無節(jié)幼體到橈足幼體的發(fā)育時間最長,需要93 h。從整個發(fā)育階段看,飼喂湛江等鞭金藻的幼體的發(fā)育時間同樣最短,為193 h。其次是角毛藻組和海鏈藻組,其發(fā)育時間分別為212 h和239 h。飼喂小球藻的安氏偽鏢水蚤,其幼體發(fā)育到成體的時間在4組中最長,需要258 h。

(a)喂食不同微藻餌料安氏偽鏢水蚤幼體在發(fā)育時間上的差異;(b)喂食不同微藻餌料安氏偽鏢水蚤幼體在存活率上的差異。不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。

從個體存活率數(shù)據(jù)來看,如圖1(b)所示,在無節(jié)幼體到橈足幼體階段,飼喂湛江等鞭金藻的安氏偽鏢水蚤幼體的存活率最高,為90%,其次是角毛藻組和海鏈藻組,其幼體存活率分別為83%和80%。飼喂小球藻的安氏偽鏢水蚤的幼體存活率最低,為67%。從整個發(fā)育階段來看,飼喂湛江等鞭金藻的安氏偽鏢水蚤,其幼體存活率顯著高于其他3組,達到60%。飼喂海鏈藻、角毛藻和小球藻的安氏偽鏢水蚤,其橈足幼體的存活率均低于50%,分別為47%、43%和40%。以上結(jié)果表明,飼喂湛江等鞭金藻有利于安氏偽鏢水蚤無節(jié)幼體到橈足幼體和橈足幼體到成體的生長、存活。

飼喂不同微藻餌料安氏偽鏢水蚤,在總產(chǎn)幼體數(shù)、每次產(chǎn)卵量和生殖次數(shù)方面存在明顯差異。由表1可知,在10 d的實驗周期內(nèi),喂食湛江等鞭金藻安氏偽鏢水蚤總產(chǎn)幼體數(shù)最多,達到(54.33±14.66)個。其次是角毛藻組和海鏈藻組,總產(chǎn)幼體數(shù)分別達到(50.66±7.40)個和(50.33±7.41)個。喂食小球藻的安氏偽鏢水蚤的總產(chǎn)幼體數(shù)最少,為(47.33±15.20)個。在生殖次數(shù)和生殖量方面,喂食海鏈藻的安氏偽鏢水蚤的生殖次數(shù)最多,達到(4.3±1.2)次/10 d,每次產(chǎn)卵量為(11.62±4.57)個,在所有組中最低。湛江等鞭金藻組生殖次數(shù)為(3.3±0.9)次/10 d,每次產(chǎn)卵量達到(16.30±3.63)個,在所有組中最高。在角毛藻組中,安氏偽鏢水蚤的生殖次數(shù)達到(3.3±0.5)次/10 d,每次產(chǎn)卵量為(13.82±3.61)個。飼喂小球藻的安氏偽鏢水蚤的生殖次數(shù)最低,為(3.0±0.8)次/10 d,但每次產(chǎn)卵量達到(15.78±4.29)個,僅次于湛江等鞭金藻組。

表1 飼喂不同微藻餌料安氏偽鏢水蚤在總產(chǎn)幼體數(shù)、每次產(chǎn)卵量和生殖次數(shù)上的差異

2.2 微藻餌料中添加光合細菌對安氏偽鏢水蚤發(fā)育和生殖的影響

根據(jù)第1個實驗結(jié)果,選取湛江等鞭金藻作為安氏偽鏢水蚤的餌料微藻,通過添加不同比例光合細菌,探究微藻餌料添加光合細菌對安氏偽鏢水蚤發(fā)育和繁殖的影響。從圖2(a)可以觀察到,光合細菌的添加對安氏偽鏢水蚤幼體發(fā)育時間有顯著影響(P<0.05),在無節(jié)幼體到橈足幼體發(fā)育階段,在投喂等量微藻餌料的條件下,添加的光合細菌可以縮短幼體的發(fā)育時間。其中,當添加光合細菌濃度達到1 mgC/L時,無節(jié)幼體所需時間最短,為(56±0)h,與對照組相比,發(fā)育時間縮短了20%。當添加光合細菌濃度為0.25、0.5和2 mgC/L時,幼體發(fā)育時間均比對照組有小幅度縮短,分別為(67.33±0.47)、(67.33±0.47)和(66±0)h。在整個發(fā)育階段,投喂等量微藻餌料的條件下,添加光合細菌可以顯著影響幼體的發(fā)育時間。光合細菌濃度為0.25 mgC/L和0.5 mgC/L的兩個實驗組幼體發(fā)育時間分別達到(184±3.30)h和(183±4.24)h,與對照組相比均有小幅度縮短。當添加光合細菌濃度為1 mgC/L時,幼體發(fā)育到成體所需的時間最短,為(165±3.56)h,與對照組(0 mgC/L)相比,發(fā)育時間縮短了約14.5%。當添加光合細菌濃度為2 mgC/L時,幼體發(fā)育到成體所需的時間最長,為(210±0)h。

在個體存活率方面,如圖2(b)所示,除1 mgC/L實驗組達到了對照組的水平(90%)以外,其余實驗組的存活率均顯著低于對照組。當光合細菌濃度為0.5 mgC/L時,無節(jié)幼體存活率最低,為63%±4.71%。在整個發(fā)育階段,添加光合細菌濃度為0.5 mgC/L和1 mgC/L的兩組橈足幼體存活率分別達到67%±4.16%和73%±1.57%,與對照組相比,分別提高了約12%和22%。而光合細菌濃度為0.25 mgC/L和2 mgC/L的兩個實驗組橈足幼體存活率顯著低于對照組,其中,當添加光合細菌濃度為2 mgC/L時,橈足幼體的存活率最低,為47%±3.14%。

在投喂等量微藻餌料的條件下,添加不同濃度光合細菌對安氏偽鏢水蚤的總產(chǎn)幼體數(shù)、每次產(chǎn)卵量和生殖次數(shù)方面有顯著影響。由表2可知,在10 d的實驗周期內(nèi),添加光合細菌濃度1 mgC/L組,其安氏偽鏢水蚤的總體產(chǎn)幼數(shù)達到(65.0±10.03)個,比對照組增產(chǎn)約20%。其次是光合細菌濃度為0和0.25 mg/L時,總產(chǎn)幼體數(shù)分別為(54.33±14.66)個和(54.67±15.0)個。當添加光合細菌濃度達到2 mgC/L時,安氏偽鏢水蚤的總產(chǎn)幼體數(shù)最少,為(45.0±7.48)個,比對照組少約17%。在生殖次數(shù)方面,添加光合細菌濃度為1 mgC/L的實驗組生殖次數(shù)最多,達到(3.47±0.47)次/10 d,略高于對照組。其他3組的生殖次數(shù)均低于對照組。在生殖量方面,添加光合細菌濃度為0.5 mgC/L的實驗組每次產(chǎn)卵量最高,與對照組相比,每次多產(chǎn)約14.5%。其次是0.25 mgC/L實驗組,其每次產(chǎn)卵量達到(18.22±1.75)個。而光合細菌濃度為1 mgC/L的實驗組每次產(chǎn)卵量為(17.73±4.61)個,與對照組相比,每次多產(chǎn)約9%。當光合細菌濃度為2 mgC/L時,其每次產(chǎn)卵量在所有組中最低,為(13.50±2.54)個,每次比對照組減產(chǎn)約17%。

3 討論

橈足類規(guī)?；B(yǎng)殖離不開優(yōu)質(zhì)餌料的供應(yīng),合適的餌料供應(yīng)是決定橈足類生長、繁殖和自身生理狀態(tài)的關(guān)鍵因素[17]。微藻餌料具有生長速度快、繁殖周期短、營養(yǎng)豐富、易培養(yǎng)等諸多優(yōu)點,是橈足類規(guī)?；B(yǎng)殖最有潛力的餌料來源。然而,微藻餌料的種類、營養(yǎng)、大小等直接影響橈足類的生殖、發(fā)育及存活[18-20]。因此,篩選合適的微藻餌料是橈足類培養(yǎng)的一項重要工作。Cahoon[21]研究表明飼喂不同微藻的橈足類,在生殖力、發(fā)育率和存活率方面呈現(xiàn)顯著差異,他認為這種差異與微藻餌料體內(nèi)營養(yǎng)成分及其含量的不同密切相關(guān)。Jonasdottir[20]也觀察到,微藻餌料中DHA與EPA的比率越高,其喂養(yǎng)的橈足類產(chǎn)卵量也越高。有研究顯示[22],微藻飲食中DHA含量越高,其橈足類的種群數(shù)越大。本研究中的4種微藻餌料體內(nèi)DHA和EPA含量差異很大。湛江等鞭金藻富含DHA,其含量可達總脂的15.75%,DHA與EPA比高達10.5∶1[23]。海鏈藻和角毛藻則富含EPA[24],其DHA與EPA比分別約為1∶5.8和1∶4.96。小球藻則被報道含有極少或不含有DHA和EPA[23]。根據(jù)結(jié)果,喂食湛江等鞭金藻的安氏偽鏢水蚤具有最短的發(fā)育時間、最高的存活率和產(chǎn)卵量,這也可能與湛江等鞭金藻含有高DHA與EPA比例有關(guān)。

光合細菌是在自然界普遍存在,具有原始光能合成體系的原核生物,含蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì),常應(yīng)用于水質(zhì)凈化[9]和飼料添加劑中[25]。有報道顯示,光合細菌所含的生物素為具有生理活性的D-異構(gòu)體,可明顯促進養(yǎng)殖生物的生長發(fā)育,縮短養(yǎng)殖周期[26]。本研究中以湛江等鞭金藻為餌料時,無論是在安氏偽鏢水蚤無節(jié)幼體發(fā)育階段,還是橈足幼體發(fā)育階段,當添加光合細菌的含碳量與湛江等鞭金藻的含碳量之比達到1∶1時,安氏偽鏢水蚤幼體發(fā)育時間最短,存活率最高,產(chǎn)幼數(shù)也達到最大,表明在微藻餌料中添加一定量的光合細菌可以促進安氏偽鏢水蚤的發(fā)育和繁殖。這可能與光合細菌調(diào)節(jié)水質(zhì)、降低氨氮、穩(wěn)定pH等功能有關(guān)。光合細菌在餌料和調(diào)節(jié)水質(zhì)方面起到一定作用,在長期喂養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn),橈足類無節(jié)幼體腸道有較多光合細菌,此階段主要是起到濾食的作用。隨著個體長大,在橈足幼體至成體階段,腸道中細菌很少,主要是藻類,此時主要是調(diào)節(jié)水質(zhì)的作用。此外,當光合細菌的含碳量與湛江等鞭金藻的含碳量之比達到2∶1時,會在一定程度上抑制安氏偽鏢水蚤的發(fā)育和繁殖。這種抑制作用可能是過多光合細菌引起水質(zhì)變化和生物之間的競爭等因素所導致。

4 結(jié)論

本文以安氏偽鏢水蚤為對象,首先研究不同微藻餌料對安氏偽鏢水蚤發(fā)育和繁殖的影響,篩選并確定湛江等鞭金藻為安氏偽鏢水蚤的最適微藻餌料。然后在飼喂等量的湛江等鞭金藻餌料的基礎(chǔ)上,開展添加不同濃度的光合細菌對安氏偽鏢水蚤發(fā)育和繁殖的影響研究。結(jié)果顯示:當添加的光合細菌濃度達到1 mgC/L時,安氏偽鏢水蚤無節(jié)幼體和橈足幼體的發(fā)育時間分別縮短了20%和14.5%,個體存活率提高了21.7%,總產(chǎn)幼體提高了20.4%。故藻菌比例1∶1作為安氏偽鏢水蚤的餌料效果最佳。當添加光合細菌濃度為2 mgC/L時,會顯著抑制安氏偽鏢水蚤幼體的發(fā)育和繁殖。然而,我們目前對光合細菌影響橈足類發(fā)育和繁殖的機制還不清楚,還需要進一步研究。