人干擾素ε的基因合成、原核表達(dá)及質(zhì)譜表征

楊銀河,狄 斌,楊大松

(1.大理大學(xué) 云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,大理 671000; 2.中國(guó)藥科大學(xué) 藥學(xué)院,南京 210009)

艾滋病(AIDS)是人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)感染所導(dǎo)致的一種病死率極高的慢性傳染病,艾滋病在全球范圍內(nèi)廣泛傳播,已成為嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì),中國(guó)共有艾滋病病毒感染者和艾滋病病人約85.0萬(wàn)例[1],目前尚無(wú)徹底治愈艾滋病的方法。

干擾素(IFN)是機(jī)體防御系統(tǒng)的重要組成部分,是一類(lèi)具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能和抗病毒、抗腫瘤等廣泛生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。基于基因序列、染色體定位和受體特異性的不同將干擾素分為3種類(lèi)型,I型干擾素包括α、β、ω、δ(豬)、κ、τ(羊和牛)、ε和ζ(Limitin,鼠) 8個(gè)亞型,具有顯著的抗病毒功能,又稱(chēng)抗病毒干擾素。干擾素ε(IFN-ε)是2001年被發(fā)現(xiàn)的[2],其氨基酸序列和其他Ⅰ型干擾素α/β的同源性較低(約30%)[3]。雖然干擾素ε也通過(guò)與Ⅰ型干擾素受體結(jié)合進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo),但與干擾素α不同,傳統(tǒng)PRR通路激動(dòng)劑(病毒、細(xì)菌)不能誘導(dǎo)IFN-ε的表達(dá)[4-6]。干擾素ε反而在多種黏膜組織如肺、小腸、生殖道、睪丸、包皮等細(xì)胞和組織中組成性表達(dá),即在這些組織中長(zhǎng)時(shí)間維持較高的表達(dá)水平[4,6]。生物體還進(jìn)化出了一套機(jī)制保證干擾素?只能在產(chǎn)生部位發(fā)揮作用,不能分泌到其他組織而實(shí)現(xiàn)選擇性。研究表明干擾素ε的表達(dá)由雌激素控制,其含量能隨著雌性生理周期的改變進(jìn)行調(diào)節(jié),從而起到保護(hù)生殖道、避免其被病毒和細(xì)菌感染的作用[4]。進(jìn)一步的研究表明干擾素ε還能被精液誘導(dǎo)表達(dá)[7]并阻斷HIV的復(fù)制,且其作用機(jī)制不同于已知的其他類(lèi)型干擾素[8]。

生物表達(dá)和化學(xué)合成是當(dāng)前獲取目標(biāo)蛋白的主要技術(shù)手段,干擾素ε氨基酸序列過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致化學(xué)合成[9]成本過(guò)高(約1萬(wàn)元/mg),本研究擬采用原核表達(dá)的方式獲取人干擾素ε蛋白,從而為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 基因、質(zhì)粒和菌株

表達(dá)載體Ifn-ε/pET-21a (+)和Ifn-ε/pET-22b (+)由上海捷瑞生物工程有限公司構(gòu)建,大腸桿菌BL21 (DE3)、Rosetta (DE3)和Origami B (DE3)由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑

胰蛋白胨、酵母提取物購(gòu)自O(shè)xoid公司;瓊脂購(gòu)自Generary公司;30% Acr-Bis (29∶1)、1.5 mol/L Tris-HCl (pH 8.8)、1.0 mol/L Tris-HCl (pH 6.8)購(gòu)自Beyotime公司;四甲基乙二胺購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;NaCl購(gòu)自江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司;NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·2H2O、乙二胺四乙酸二鈉、β-巰基乙醇、過(guò)硫酸銨、冰乙酸、異丙醇、仲丁醇購(gòu)自南京化學(xué)試劑有限公司;CaCl2購(gòu)自西隴化工股份有限公司;二硫代蘇糖醇購(gòu)自Aladdin公司;尿素、溴酚藍(lán)、鹽酸胍、考馬斯亮藍(lán)R-250購(gòu)自Sigma公司;氨芐青霉素鈉鹽、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、甘氨酸購(gòu)自Amresco公司;Tris購(gòu)自Mybioscience公司;十二烷基硫酸鈉購(gòu)自Biosharp公司;Prestained Protein Ladder購(gòu)自Thermo Scientific公司;無(wú)水乙醇購(gòu)自上海Titan科學(xué)有限公司;乙腈購(gòu)自TEDIA公司;三氟乙酸購(gòu)自ROE SCIENTIFIC公司;葡聚糖凝膠填料購(gòu)自GE公司。

1.2 方法

1.2.1 基因合成和表達(dá)載體構(gòu)建

從NCBI(NP_795372.1)上查找到hIFN-ε的氨基酸序列,共有208個(gè)氨基酸,去除前端21個(gè)氨基酸信號(hào)肽,得到由187個(gè)氨基酸構(gòu)成的成熟hIFN-ε,對(duì)應(yīng)堿基全長(zhǎng)561 bp。5′端加上起始密碼ATG和限制性?xún)?nèi)切酶NdeI的位點(diǎn)序列CA↓T;3′端插入終止密碼TAA和限制性?xún)?nèi)切酶XhoI的位點(diǎn)序列C↓TCGAG;合成長(zhǎng)度為576 bp的基因Ifn-ε載體序列,將其插入pET-21a (+)的NdeI (730)和XhoI (159)之間從而構(gòu)建Ifn-ε/pET-21a (+) 質(zhì)粒,委托Generay公司測(cè)序驗(yàn)證正確性。

考慮到不同細(xì)胞內(nèi)可用tRNAs量的差異,可能會(huì)導(dǎo)致人源干擾素ε(hIFN-ε)密碼子在外緣宿主大腸桿菌體內(nèi)的利用率較低而出現(xiàn)表達(dá)量低,甚至抑制表達(dá)的現(xiàn)象。本研究同時(shí)合成了經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的人源干擾素ε基因,即在不改變氨基酸序列的前提下將低利用率的密碼子替換為大腸桿菌常用密碼子從而達(dá)到提高功能蛋白表達(dá)水平的目的,具體見(jiàn)圖1(5′→3′)。再將優(yōu)化后的基因同上方法構(gòu)建Ifn-ε/pET-22b (+) 質(zhì)粒,并做測(cè)序驗(yàn)證。

圖1 人源干擾素ε密碼子優(yōu)化前后的基因

1.2.2 表達(dá)菌的構(gòu)建和培養(yǎng)條件優(yōu)化

將上述2個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)、Rosetta (DE3)和Origami B (DE3),涂布含有氨芐青霉素的LB平板。挑取單克隆轉(zhuǎn)化子于5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中,按照1∶1 000的比例加入氨芐青霉素(終濃度為100 μg/mL),37 ℃振蕩培養(yǎng)。擴(kuò)增3 h后按照1∶100的比例加IPTG(終濃度為1.0 mmol/L)誘導(dǎo),37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h后收集菌體,進(jìn)行SDS-PAGE電泳,比較蛋白表達(dá)情況,選取表達(dá)量較高的作為優(yōu)勢(shì)菌。

IPTG濃度優(yōu)化:設(shè)置5個(gè)IPTG濃度(0、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L),37 ℃擴(kuò)增培養(yǎng)3 h后收菌,制樣電泳。誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化:設(shè)置5個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間(2、3、4、5、6 h),即從誘導(dǎo)培養(yǎng)的第2小時(shí),每間隔1 h取菌液,進(jìn)行電泳分析。擴(kuò)增溫度、誘導(dǎo)溫度優(yōu)化:將優(yōu)勢(shì)表達(dá)菌接種至4個(gè)LB液體培養(yǎng)基(編號(hào)為①～④),培養(yǎng)3 h至菌液渾濁,按最適IPTG濃度誘導(dǎo)培養(yǎng)。Ifn-ε/pET-21a (+)為質(zhì)粒表達(dá)菌:①～④三角瓶擴(kuò)增溫度分別為37、37、42和42 ℃;誘導(dǎo)溫度分別為37、42、37和42 ℃。Ifn-ε/pET-22b (+)為質(zhì)粒的表達(dá)菌:①～④三角瓶擴(kuò)增溫度分別為30、37、30和37 ℃;誘導(dǎo)溫度分別為30、37、37 和30 ℃。

1.2.3 表達(dá)形式的確定

各表達(dá)菌按優(yōu)化所得培養(yǎng)條件,擴(kuò)增培養(yǎng)3 h后加IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h,離心棄上清液得菌體沉淀部分。菌體沉淀用20～30 mL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 溶液吹散,超聲破菌,12 000 r/min離心10 min。(1)上清液部分:取50 μL上清液,加入50 μL 2 × loading buffer,100 ℃煮5 min。(2)沉淀部分:沉淀用50 μL 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0) 溶液吹散,加入50 μL 2 × loading buffer,100 ℃煮5 min。上清液、沉淀的樣品都離心10 min,12 000 r/min,30 ℃,離心后取上清液上樣,進(jìn)行電泳。若大腸桿菌以可溶性形式表達(dá)蛋白,則在上清液中可以檢測(cè)到目的蛋白;若是以包涵體形式表達(dá)蛋白,則會(huì)在菌體沉淀中檢測(cè)到目的蛋白。

1.2.4 目標(biāo)蛋白的分離純化

(1)葡聚糖Sephadex G100凝膠過(guò)濾色譜。將從表達(dá)菌中獲得的包涵體沉淀洗滌純化后用包涵體溶解液(10% SDS,0.1 mol/L PBS,10 mmol/L DTT,1 mmol/L EDTA)溶解后,離心取上清液進(jìn)行葡聚糖Sephadex G100凝膠柱層析純化。用0.1 mol/L PBS緩沖液洗脫,分段收集、凍干、電泳驗(yàn)證。(2)高效液相色譜法。流動(dòng)相:H2O (0.1% TFA),乙腈(0.1% TFA);制備色譜柱:Waters Symmetry300TMC4,5 μm,OBDTM19 mm×250 mm; 分析色譜柱:Waters Xbridge BEH C4,3.5 μm,4.6 mm×150 mm,300 ?;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm。分段收集,質(zhì)譜分析。(3)質(zhì)譜測(cè)試:采用ESI+-TOF-MS對(duì)目標(biāo)蛋白的分子量進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒驗(yàn)證

按照表達(dá)質(zhì)粒Ifn-ε/pET-21a (+)和密碼子優(yōu)化后的質(zhì)粒Ifn-ε/pET-22b (+)設(shè)計(jì)要求人工合成目的基因。根據(jù)Generay公司提供的質(zhì)粒綜合序列測(cè)序圖,顯示表達(dá)質(zhì)粒的序列正確。用NdeI/XhoI對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切,凝膠電泳圖顯示條帶在500～750 bp,與目標(biāo)條帶569 bp相一致。結(jié)果表明目的基因Ifn-ε已成功連接到pET-21a (+)和pET-22b (+)載體中。

2.2 抗生素篩選

結(jié)果表明,含有Ifn-ε基因的pET-21a (+) 和pET-22b (+) 質(zhì)粒均已成功轉(zhuǎn)入相應(yīng)的大腸桿菌,見(jiàn)圖2。

(a)～(f)為Ifn-ε/pET-21a (+)和Ifn-ε/pET-22b (+)分別轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)、Rosetta (DE3)、Origami B (DE3)后的轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)示意圖。

2.3 優(yōu)勢(shì)表達(dá)菌的篩選和培養(yǎng)條件優(yōu)化

表達(dá)質(zhì)粒Ifn-ε/pET-21a (+)和Ifn-ε/pET-22b (+)分別轉(zhuǎn)化3株大腸桿菌BL21 (DE3)、Rosetta (DE3)、Origami B (DE3)獲得表達(dá)菌后,電泳分析結(jié)果表明BL21 (DE3)菌的表達(dá)量相對(duì)較高,因此,選其作為兩個(gè)載體的優(yōu)勢(shì)菌。

重組菌Ifn-ε/pET-21a/BL21以37 ℃擴(kuò)增培養(yǎng)3 h后測(cè)試5個(gè)IPTG濃度和5個(gè)誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目標(biāo)蛋白表達(dá)量的影響。電泳結(jié)果表明干擾素ε蛋白條帶隨著IPTG濃度和時(shí)間的增加而增加,直至5、6 h時(shí)變化不大。綜合考慮確定Ifn-ε/pET-21a/BL21的最佳IPTG濃度為1 mmol/L,擴(kuò)增3 h后誘導(dǎo)6 h。隨后對(duì)擴(kuò)增溫度和誘導(dǎo)溫度(37 ℃,42 ℃)進(jìn)行組合優(yōu)化,結(jié)果表明42 ℃時(shí)表達(dá)菌擴(kuò)增速度快,菌體數(shù)目多,目標(biāo)蛋白較早表達(dá),且量也較高,但隨著誘導(dǎo)時(shí)間延遲,蛋白有所減少,推測(cè)可能是因?yàn)闇囟冗^(guò)高時(shí)表達(dá)的蛋白不穩(wěn)定被降解。而在37 ℃條件下,蛋白量不斷增加,且沒(méi)有降低的趨勢(shì),因此,選擇37 ℃擴(kuò)增再以37 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)條件作為表達(dá)菌培養(yǎng)條件,該培養(yǎng)條件下兩株菌的電泳結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 培養(yǎng)條件優(yōu)化后電泳圖

2.4 表達(dá)形式的確定

在最佳條件下小批量發(fā)酵兩株優(yōu)勢(shì)表達(dá)菌Ifn-ε/pET-21a/BL21和Ifn-ε/pET-22b/BL21,超聲裂解處理菌體,電泳檢測(cè)裂解后的上清液和沉淀部分。結(jié)果表明,兩株菌的干擾素ε目標(biāo)蛋白都在沉淀樣品里,而上清液部分均未觀察到目標(biāo)蛋白條帶,即兩株表達(dá)菌都以包涵體形式表達(dá)目的蛋白。

2.5 目標(biāo)蛋白的分離純化

兩株優(yōu)勢(shì)表達(dá)菌在最優(yōu)條件下放大發(fā)酵,PBS裂解液超聲破碎后,離心后沉淀得包涵體部分各約500 mg。經(jīng)純化收集后凍干,電泳檢測(cè)。結(jié)果表明:Ifn-ε/pET-21a/BL21的包涵體用Sephadex G100純化后,與雜蛋白一起被洗脫,分離效果較差且目的條帶很弱。相比之下Ifn-ε/pET-22b/BL21的包涵體經(jīng)凝膠純化后主要部位中只有兩個(gè)主要的雜蛋白,且目的條帶較明顯。因此,取從Ifn-ε/pET-22b/BL21凝膠純化得來(lái)的目標(biāo)蛋白部位進(jìn)一步使用制備型HPLC純化(流動(dòng)相A:含0.1% TFA的水;流動(dòng)相B:含0.1% TFA的乙腈;檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm;梯度:0～60 min內(nèi)B相比例10%增加到50%),然后分段接收流出液,進(jìn)質(zhì)譜掃描確認(rèn)樣品峰的位置,隨后再進(jìn)液相檢查各份樣品峰純度,進(jìn)行合并冷凍干燥。最終分離純化得到的干擾素ε蛋白的電泳圖和色譜圖見(jiàn)圖4。

圖4 干擾素ε的電泳圖和色譜圖

2.6 目標(biāo)蛋白的質(zhì)譜分析

用ESI質(zhì)譜測(cè)定目標(biāo)蛋白分子量,正離子掃描范圍600～1 500,質(zhì)譜圖見(jiàn)圖5。干擾素ε蛋白由187個(gè)氨基酸構(gòu)成[10],加上起始氨基酸(甲硫氨酸),共188個(gè)氨基酸,理論分子量為22 224.68,實(shí)測(cè)分子量為22 224.89,對(duì)應(yīng)的多電荷峰:[M+17H]17+=1 308.365 3,[M+18H]18+=1 235.697 8,[M+19H]19+=1 170.735 0,[M+20H]20+=1 112.251 6,[M+21H]21+=1 059.330 1,[M+22H]22+=1 011.233 5,[M+23H]23+=967.307 4,[M+24H]24+=927.046 1,[M+25H]25+=889.990 7,[M+26H]26+=855.816 3,[M+27H]27+=824.115 5,[M+28H]28+=794.763 1,[M+29H]29+=767.348 0,與理論預(yù)測(cè)值完全相符。

3 結(jié)論

(1)將表達(dá)質(zhì)粒Ifn-ε/pET-21a (+)、Ifn-ε/pET-22b (+) 轉(zhuǎn)化入BL21 (DE3)、Rosetta (DE3)和Origami B (DE3)等3類(lèi)大腸桿菌,結(jié)果表明BL21 (DE3)表達(dá)菌產(chǎn)生的目的蛋白量最高。(2)通過(guò)對(duì)擴(kuò)增溫度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度進(jìn)行優(yōu)化,篩選出兩株優(yōu)勢(shì)表達(dá)菌Ifn-ε/pET-21a/BL21和Ifn-ε/pET-22b/BL21。優(yōu)化后確定的表達(dá)條件:IPTG 終濃度為1.0 mmol/L,擴(kuò)增溫度和誘導(dǎo)溫度均為37 ℃,誘導(dǎo)6 h。(3)兩株表達(dá)菌均以包涵體形式表達(dá)目標(biāo)蛋白,包涵體難溶于8 mol/L尿素和6 mol/L鹽酸胍,但易溶于SDS;通過(guò)制備液相對(duì)包涵體進(jìn)行純化,成功地從Ifn-ε/pET-22b/BL21表達(dá)菌中得到了高純度的IFN-ε。(4)表達(dá)菌Ifn-ε/pET-22b/BL21比Ifn-ε/pET-21a/BL21的蛋白表達(dá)產(chǎn)量高,可能是連接在表達(dá)載體pET-22b (+)的目的基因Ifn-ε經(jīng)過(guò)密碼子的優(yōu)化,便于大腸桿菌識(shí)別和利用,使蛋白表達(dá)有所提高。(5)IFN-ε蛋白在飛行時(shí)間質(zhì)譜ESI正離子模式下實(shí)測(cè)帶電荷數(shù)為17～29,其理論分子量和質(zhì)譜測(cè)試結(jié)果完全吻合。

綜上,本研究采用基因合成、密碼子優(yōu)化、表達(dá)菌篩選、培養(yǎng)和純化條件摸索、電泳和質(zhì)譜驗(yàn)證,成功構(gòu)建干擾素ε的表達(dá)體系。該工作的完成為后期以表達(dá)的方式對(duì)蛋白氨基酸序列進(jìn)行突變進(jìn)而研究構(gòu)效關(guān)系奠定基礎(chǔ)。