GS抑制劑調(diào)節(jié)自噬影響肝癌細(xì)胞放療敏感性

何 媛,錢(qián)俊超,3

(1.中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院,合肥 230031; 2.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)研究生院科學(xué)島分院,合肥 230026; 3.中國(guó)科學(xué)院合肥腫瘤醫(yī)院,合肥 230031)

原發(fā)性肝癌是全球第六大最常見(jiàn)的癌癥,也是2020年全球癌癥死亡的第三大原因[1]。肝細(xì)胞癌(HCC)是一種由肝細(xì)胞癌變引起的原發(fā)性肝癌,約占原發(fā)性肝癌組織學(xué)類(lèi)型的90%以上,是世界上發(fā)病率最高的癌癥之一[2]。HCC的推薦治療方案包括腫瘤切除或肝移植、腫瘤放療、化療、消融和栓塞等[3]。其中,放療在肝癌治療中的應(yīng)用越來(lái)越多,因?yàn)殡婋x輻射(IR)具有安全無(wú)創(chuàng)的特性[4-5]。放射治療的新方式,如立體定向放療(SBRT),可以在有效遞送消融劑量的同時(shí)保留正常肝細(xì)胞,因此,接受放射治療的HCC患者數(shù)量正在逐步增加[6]。雖然通過(guò)先進(jìn)的照射技術(shù),如借助呼吸門(mén)控強(qiáng)度調(diào)制和圖像引導(dǎo)的放射治療,可以在不損傷正常組織的情況下對(duì)腫瘤給予更適形的治療和更高的輻射劑量[7],但由于腫瘤固有的放射抵抗性和周?chē)８闻K的低輻射耐受性,放療對(duì)HCC的治療效率較低[8]。因此,迫切需要能增加腫瘤的放射敏感性和減少正常組織并發(fā)癥的策略。

放射治療中存活下來(lái)的癌細(xì)胞表現(xiàn)出放射抗性,能夠促進(jìn)腫瘤再生長(zhǎng)和腫瘤復(fù)發(fā)。放療抗性的原因主要是癌細(xì)胞激活補(bǔ)償性存活信號(hào),包括損傷修復(fù)信號(hào)、DNA 修復(fù)和自噬的誘導(dǎo)等[9]。自噬是一個(gè)分解代謝過(guò)程,在各種應(yīng)激刺激下被證明可以促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和進(jìn)展,包括饑餓、缺氧、氧化還原應(yīng)激、化療藥物和輻射等[10]。自噬還可以作為細(xì)胞重要的修復(fù)途徑之一,通過(guò)這種途徑細(xì)胞可以降解蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器來(lái)回收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)從而繼續(xù)生存[11]。此外,自噬抑制劑可通過(guò)誘導(dǎo)更明顯和更長(zhǎng)時(shí)間的DNA雙鏈斷裂(DSB)對(duì)某些腫瘤細(xì)胞起到放射增敏的作用[12]。

谷氨酰胺代謝增加是癌癥的標(biāo)志,許多研究強(qiáng)調(diào)了谷氨酰胺合成酶(GS)和谷氨酰胺在HCC發(fā)展中的關(guān)鍵作用[13]。GS是一種代謝酶,通過(guò)谷氨酸和氨合成谷氨酰胺,參與肝臟中氨的解毒作用,相關(guān)研究表明,抑制 GS 會(huì)降低細(xì)胞存活、增殖和腫瘤發(fā)生[14]。以往的研究表明,GS在部分HCC中過(guò)度表達(dá)且與HCC患者的轉(zhuǎn)移預(yù)后密切相關(guān)[15],因此,靶向GS和相關(guān)通路可能為具有固有和獲得性輻射抵抗的患者提供治療益處。然而,GS在HCC的腫瘤發(fā)生和治療反應(yīng)中的作用仍不清晰,目前還沒(méi)有批準(zhǔn)用于臨床試驗(yàn)的安全且特異性靶向 GS 的藥物[16-17]。L-蛋氨酸亞砜亞胺(MSO)是一種特殊氨基酸,可作為谷氨酸類(lèi)似物抑制多種谷氨酸代謝酶。在哺乳動(dòng)物中,MSO是GS和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的抑制劑,對(duì)GS有良好的且不可逆的抑制作用[16-18]。盡管在一些與HCC相關(guān)的研究中,MSO已被用作GS的抑制劑[19-21],但少有關(guān)于MSO或GS對(duì)HCC放療敏感性影響的報(bào)道。因此,本研究探討了GS活力對(duì)HCC細(xì)胞系HepG2體外放療敏感性的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞系HepG2購(gòu)自Procell生命科學(xué)與技術(shù)公司(CL-0103);MSO(Sigma-Aldrich,M5379);基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM;Procell,PM150410);胎牛血清(Clark,FB25015);青霉素-鏈霉素溶液(Procell,PB180120);抗體(GS:Abcam;LC3:武漢賽維爾,GB11124) ;X射線輻照儀(PXI,Connecticut,USA;源-面距:40 cm);MDC染液(Solarbio,G0170);GS活力檢測(cè)試劑盒(上海生工,D799578);TransZol Up Plus RNA 分離試劑(Transgen Biotech,ER501-01);HiScript?II Q Select RT SuperMix(+gDNA wiper)(Vazyme,R233); ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme,Q711);細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(CCK-8,上海生工,E606335),Bafilomycin A1(思科捷,SJ-MA0035)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞系HepG2用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM)輔以10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液,并在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2空氣中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí),GS抑制劑MSO以0.001 mol/L的濃度溶于培養(yǎng)基中使用。

1.2.2 蛋白免疫印跡

不同組別的細(xì)胞被清洗、收集和裂解。提取到的蛋白質(zhì)用10%～12%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離,然后轉(zhuǎn)移到處理好的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂奶阻斷1 h后,用GS抗體在4 ℃孵育過(guò)夜,以小鼠抗GAPDH蛋白作為內(nèi)參蛋白。接下來(lái),對(duì)膜進(jìn)行清洗,在室溫下孵育1 h。使用儀器顯影得到的印跡,并通過(guò)Image J軟件進(jìn)行蛋白定量。

1.2.3 MDC染色

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞在12孔板(1×105個(gè)/孔)中培養(yǎng)至約60%融合,然后使用10 Gy的X射線照射,24 h后使用單丹磺酰(MDC)檢測(cè)自噬小體的形成。即先吸走培養(yǎng)基,用PBS洗兩次,然后在37 ℃的無(wú)血清條件下,用MDC染色40 min,用PBS沖洗掉多余的MDC,并立即在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞自噬情況。

1.2.4 細(xì)胞活力測(cè)試

HepG2細(xì)胞被清洗、胰蛋白酶消化、計(jì)數(shù)并接種到96孔板中,密度為每孔3×103,設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔。細(xì)胞貼壁后,在含有或不含MSO的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h以上,使用X射線輻照儀以4.987 Gy/min的劑量率照射10 Gy的X射線。輻照后,細(xì)胞在37 ℃下培養(yǎng)72 h,用細(xì)胞活力檢測(cè)試劑盒(CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞增殖。測(cè)量前2 h,在培養(yǎng)皿的每個(gè)孔中加入10 μL的CCK-8試劑。使用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)量細(xì)胞樣品的光密度(OD),然后計(jì)算相對(duì)增殖率。

1.2.5 集落形成實(shí)驗(yàn)

參考文獻(xiàn)[22]所述方法進(jìn)行集落形成實(shí)驗(yàn),即將細(xì)胞計(jì)數(shù)后,鋪板到6孔板(1×103/孔),根據(jù)是否添加MSO、是否進(jìn)行IR分成4組。菌落成長(zhǎng)10～14 d,更換培養(yǎng)基的頻率為每周2次,直到顯微鏡可以明顯觀察到菌落。菌落形成后吸走培養(yǎng)基用PBS洗滌2次,4%多聚甲醛固定30 min,再用PBS洗2次,使用1%結(jié)晶紫溶液染色15 min,用純水洗凈晾干。結(jié)果使用Image J軟件對(duì)菌落的數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)、量化。

1.2.6 GS活力測(cè)試

根據(jù)GS檢測(cè)試劑盒的步驟,檢測(cè)不同條件下細(xì)胞的GS活力。谷氨酰胺合成酶在ATP和Mg2+的存在下,催化銨離子和谷氨酸合成谷氨酰胺;谷氨酰胺進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為γ-谷氨?；愲克?在酸性條件下其與鐵形成紅色的絡(luò)合物,該絡(luò)合物在540 nm處有最大吸收峰,可在酶標(biāo)儀下被檢測(cè)到。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用TransZol Up Plus RNA Kit從5×106個(gè)不同組處理的HepG2細(xì)胞中提取總RNA,并根據(jù)試劑制造商的說(shuō)明轉(zhuǎn)錄成cDNA。Q-PCR使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix在Roche LightCycler 96 Real-Time PCR系統(tǒng)上進(jìn)行。在結(jié)果中,GS的相對(duì)mRNA表達(dá)水平通過(guò)GAPDH的表達(dá)水平來(lái)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。設(shè)計(jì)并使用GAPDH(F:5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′; R:5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′)和GS(F:5′-ATTTCAGATTGGACCTTGTG-3′; R:5′-GTGCCGCTTGCTTAGTT-3′)兩種引物通過(guò)以下步驟用于PCR擴(kuò)增:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火和延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法用于目標(biāo)基因的相對(duì)定量。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)分析使用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行。采用非配對(duì)t檢驗(yàn)比較兩組之間的差異,多組之間的差異用單因素或雙因素方差分析。每個(gè)數(shù)值以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 GS抑制劑對(duì)HepG2細(xì)胞的影響

我們探索了GS抑制劑MSO這種藥物對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞系的作用,與以往的研究結(jié)果一致[23],MSO會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)的負(fù)反饋調(diào)節(jié),如圖1(b)～(d)所示,輻照后72 h,GS-mRNA水平以及蛋白表達(dá)均顯著上升。但是,GS活力被MSO大幅抑制,具體如圖1(a)所示。

(a)MSO顯著降低細(xì)胞內(nèi)GS活力;(b)MSO對(duì)GS-mRNA表達(dá)的影響;(c)MSO對(duì)GS蛋白表達(dá)的影響;(d)LC3-II/GAPDH灰度值分析。MSO以0.001 mol/L 的濃度溶于培養(yǎng)基中,處理時(shí)間均為72 h。* 為P<0.05;** 為P<0.01。Con:對(duì)照組;MSO:MSO處理組。

2.2 GS抑制劑提高HepG2細(xì)胞放療敏感性

對(duì)輻照后72 h的HepG2細(xì)胞進(jìn)行了CCK-8活力檢測(cè),結(jié)果如圖2(a)所示,MSO單獨(dú)作用不會(huì)影響細(xì)胞活力,但是會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)IR引起的活力下降。此外,使用集落形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定MSO長(zhǎng)期作用下對(duì)細(xì)胞增殖的影響,與CCK-8的結(jié)果一致,MSO可以在放療后抑制HepG2細(xì)胞的增殖,但是在未輻照情況下對(duì)細(xì)胞增殖并未產(chǎn)生顯著影響。

2.3 IR誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬

如圖3所示,通過(guò)MDC自噬體染料的染色結(jié)果觀察到,細(xì)胞內(nèi)自噬體會(huì)在IR后明顯增加,提示自噬的激活,而MSO的參與進(jìn)一步增加了自噬的數(shù)量,表明自噬流受到MSO的影響。

10 Gy劑量單次輻照后24 h,使用MDC染料觀察HepG2細(xì)胞在不同處理?xiàng)l件下的自噬形成情況,MSO的濃度為0.001 mol/L。(a)對(duì)照組;(b)MSO處理組;(c)輻照組;(d)輻照與MSO共同處理組;倍數(shù):200×;標(biāo)尺:100 μm。

2.4 GS抑制劑調(diào)節(jié)IR誘導(dǎo)的自噬

為確定MSO對(duì)自噬流的具體影響,對(duì)自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)行了測(cè)定。如圖4所示,研究結(jié)果表明,MSO的參與會(huì)引起放射治療后LC3蛋白含量的變化,尤其是與自噬流密切相關(guān)的LC3-II蛋白。IR后72 h,細(xì)胞內(nèi)LC3-II的水平大幅下降,這可能與IR誘導(dǎo)的自噬流水平的上升以及后續(xù)自噬體的順利降解有關(guān)。然而,MSO抑制GS活力之后,LC3-II蛋白大量堆積,提示自噬流可能被抑制。在輻照后48 h使用Bafilomycin A1 (Baf-A1)阻斷自噬降解以確定輻照和MSO對(duì)自噬的影響,結(jié)果表明,Baf-A1使得IR后的LC3-II蛋白堆積而對(duì)IR+MSO共同作用組無(wú)明顯影響,表明IR激活了自噬,而MSO抑制了IR誘導(dǎo)的自噬。

(a)10 Gy劑量單次輻照后72 h,Western Blot檢測(cè)不同條件下自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況;(b)LC3-II/GAPDH的灰度值分析。MSO濃度:0.001 mol/L;Baf-A1濃度:0.000 000 05 mol/L。ns為無(wú)顯著差異;* 為P<0.05;** 為P<0.01。Con:對(duì)照組;MSO:MSO處理組;IR:輻照組;IR+MSO:輻照與MSO共同處理組。

3 討論與結(jié)論

本研究使用MSO來(lái)抑制GS的活性,通過(guò)CCK-8和集落形成實(shí)驗(yàn)分別測(cè)試了HepG2細(xì)胞在放療后短期和長(zhǎng)期的增殖效率,分別使用MDC、Western Blot檢測(cè)輻照后細(xì)胞內(nèi)自噬水平。結(jié)果表明,放療誘導(dǎo)自噬產(chǎn)生,并且GS活力抑制能夠有效影響自噬調(diào)節(jié)從而提高HepG2細(xì)胞的放療敏感性。這是首次對(duì)肝癌細(xì)胞放療敏感性與其GS活性相關(guān)性的研究。

自噬起著多種病理生理作用,它有助于癌癥細(xì)胞的生存和死亡,其在癌癥中具有雙重作用[24-25]。據(jù)報(bào)道,缺乏自噬相關(guān)蛋白Atg5或Atg7的小鼠會(huì)發(fā)展為肝癌[26]。然而,越來(lái)越多的證據(jù)表明,自噬對(duì)正常細(xì)胞中的早期致癌過(guò)程具有抑制作用,但在癌癥細(xì)胞中,它有助于腫瘤生長(zhǎng)、惡性轉(zhuǎn)化和治療抵抗[27]。在HCC相關(guān)研究中,FOXO3表達(dá)的抑制被證明可以通過(guò)加速自噬賦予HCC細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的抵抗性[28],而自噬的抑制則會(huì)增強(qiáng)索拉非尼的敏感性[29]。

此外,自噬是具有放射抗性的癌細(xì)胞中一種保守的細(xì)胞生存策略,因?yàn)樗谇宄軗p的細(xì)胞器和蛋白質(zhì)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用,這對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞健康至關(guān)重要[30]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明,自噬的抑制可以進(jìn)一步降低輻照后腫瘤的發(fā)生,例如膀胱癌[31]、結(jié)直腸癌[32]和前列腺癌[33]等。在食管癌癥中,肝激酶B1通過(guò)AMP激活的蛋白激酶途徑誘導(dǎo)的自噬亦被證明可以增強(qiáng)放射抗性[34]。此外,ATG5或Beclin 1 敲除的癌癥細(xì)胞由于自噬抑制而表現(xiàn)出更強(qiáng)的放射敏感性[35]。并且最近研究表明,肝癌細(xì)胞放療后的自噬通量會(huì)影響細(xì)胞的輻射抗性,GABARAP蛋白表達(dá)減少抑制了HCC細(xì)胞的自噬,并增強(qiáng)了其放射敏感性[36]。我們的結(jié)果也表明,放療后HepG2細(xì)胞內(nèi)的自噬水平會(huì)明顯增加,這也與其放療抗性密切相關(guān)。

谷氨酰胺合成酶 (GS) 是谷氨酰胺代謝中的一種關(guān)鍵酶,參與多種原核生物和真核生物的氮代謝、酸堿平衡和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[37]。谷氨酰胺合成酶在放射治療中也發(fā)揮重要作用,有研究發(fā)現(xiàn)GS可以在輻照后促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的核苷酸代謝和隨后的 DNA 損傷修復(fù)[38]。此外,GS在調(diào)節(jié)自噬方面也發(fā)揮重要作用,FOXO3介導(dǎo)的GS表達(dá)誘導(dǎo)自噬對(duì)細(xì)胞存活十分重要[39],且在肝癌細(xì)胞中β-catenin也可以調(diào)節(jié)GS的表達(dá)并引發(fā)一系列的代謝變化從而誘導(dǎo)自噬[40]。我們的研究結(jié)果也證實(shí)了放療后GS對(duì)自噬的調(diào)節(jié)作用,GS活力的下降會(huì)抑制放療誘導(dǎo)的自噬,也暗示MSO可以通過(guò)抑制放療后肝癌細(xì)胞內(nèi)GS介導(dǎo)的自噬水平升高來(lái)降低細(xì)胞的自我修復(fù)能力,從而降低細(xì)胞增殖能力。

總之,實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí),HepG2細(xì)胞放療后增殖能力與其自噬的誘導(dǎo)以及GS活力密切相關(guān)。由于細(xì)胞內(nèi)負(fù)反饋調(diào)節(jié),MSO雖然引起了GS-mRNA和蛋白表達(dá)的增加,但是其對(duì)GS活力的抑制能夠有效抑制放療后細(xì)胞自噬流的進(jìn)行,從而提高HepG2細(xì)胞的放療敏感性。