復合微生物菌劑發(fā)酵制備生物腐植酸的條件優(yōu)化及其結構特性

師楊杰，靳紅梅，管益東，龍玉嬌，朱燕云，朱寧*

（1.江蘇省農業(yè)科學院農業(yè)資源與環(huán)境研究所，農業(yè)農村部長江下游平原農業(yè)環(huán)境重點實驗室，南京 210014；2.南京信息工程大學環(huán)境科學與工程學院，南京 210044；3.江蘇省有機固體廢棄物資源化協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210095）

近年來，我國化肥過量施用帶來了一系列環(huán)境污染、土壤質量退化和農產品品質下降等問題。隨著農業(yè)發(fā)展方式的轉變，開發(fā)綠色高效新型肥料是保障我國農田生態(tài)安全和農產品質量安全的重大需求。腐植酸是一類以芳香環(huán)和脂肪鏈為基本結構的非均相高分子聚合物[1]，具有酸性、親水性、界面活性、陽離子交換、絡合及吸附能力[2]。腐植酸含有大量有機質和多種活性官能團，可以改良土壤結構，提高土壤保水、保肥能力，促進植物生長發(fā)育，增強作物抗逆性[3]。腐植酸已成為農業(yè)中土壤調理劑、植物抗旱劑和復合肥料的主要有效成分，其開發(fā)利用受到肥料研究者和生產企業(yè)的重視。

目前，商品腐植酸的規(guī)?；a主要是利用化學降解或氧化的方法從泥炭、褐煤及風化煤中提取，在制備過程中需要消耗大量的酸、堿等化學物質，還需要高溫、高壓等劇烈條件及嚴格的工藝和特殊設備[4-5]。生物腐植酸是以有機廢棄物為原料，在人工控制條件下經微生物發(fā)酵制備獲得，因其生產成本低、處理條件溫和、無二次污染等優(yōu)點，受到研究者的廣泛關注[6]。與礦物腐植酸相比，生物腐植酸分子量小、含有活性基團多，易被植物吸收，具有抗二價離子、抗硬水、抗酸堿的特性，同時含有作物生長所需的氮磷鉀養(yǎng)分以及氨基酸、有機酸、糖類、生物酶等生物活性物質[7]。以木質纖維素類原料生產生物腐植酸是當前腐植酸研究領域的熱點。尚校蘭等[8]分別利用微生物發(fā)酵法和化學法以巨菌草為底物制備腐植酸，發(fā)現(xiàn)利用毛霉發(fā)酵制備的腐植酸含量是10%氨水提取的腐植酸含量的1.45 倍。王思同等[9]以枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸菌和酵母菌作為菌劑，采用堆肥的方式發(fā)酵菌糠制備生物腐植酸，36 d后生物腐植酸含量達23.3%。呂志偉等[10]利用微生物菌群發(fā)酵玉米秸稈生產生物黃腐酸，發(fā)酵7 d后，生物黃腐酸產量為15.70%。然而，利用木質纖維素類原料生產生物腐植酸仍存在以下問題：（1）有機廢棄物中各類組分的微生物降解轉化是影響其腐殖化進程的限制因素，目前發(fā)酵菌劑大多是單一或少數(shù)幾種菌種混合而成，沒有根據(jù)原料組成特點針對性設計，導致原料降解轉化速率慢，發(fā)酵生產周期長，腐植酸產率低；（2）固態(tài)發(fā)酵工藝尚不成熟，發(fā)酵條件和參數(shù)不明確，導致發(fā)酵過程的穩(wěn)定性差，生物腐植酸產品的質量難以保證。因此，極有必要開發(fā)高效復合微生物菌劑并進行發(fā)酵條件優(yōu)化，這對于縮短腐植酸發(fā)酵生產周期、提高腐植酸產量具有重要的現(xiàn)實意義。

本研究從腐殖化作用活躍的森林環(huán)境樣品中分離篩選高效腐殖化功能菌株，并進行發(fā)酵微生物菌劑復配，以常見農業(yè)廢棄物為底物，探究不同發(fā)酵條件對腐植酸產量的影響，明確生物腐植酸的最佳發(fā)酵條件，通過元素分析和紅外光譜研究生物腐植酸的結構特性，以期為生物腐植酸的產業(yè)化生產和應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 環(huán)境樣品

本研究分別從吉林松花江三湖國家級自然保護區(qū)（42°57'N，127°09'E）、內蒙古額爾古納濕地（50°19'N，120°14'E）和云南蒼山（25°48'N，100°05'E）采集枯木、森林凋落物和表層土樣品。

1.1.2 農業(yè)廢棄物

本研究所用農業(yè)廢棄物包括麥秸、麩皮、米糠、玉米芯、花生餅、豆粕，其中麥秸取自江蘇省農業(yè)科學院六合試驗基地，麩皮、米糠、玉米芯、花生餅、豆粕購自湖南省商大農貿有限公司，各原料基本性質見表1。

表1 原料基本性質（g·kg-1）Table 1 Basic properties of raw materials（g·kg-1）

1.1.3 培養(yǎng)基

真菌分離培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基PDA）：馬鈴薯6.00 g，葡萄糖20.00 g，瓊脂10.00 g，補加蒸餾水至1 L，121 ℃滅菌15 min。

腐殖化功能菌株篩選培養(yǎng)基：發(fā)酵體系為150 mL 三角瓶，含麥秸3.00 g、（NH4）2SO40.30 g、蛋白胨0.15 g、麩皮0.30 g、KH2PO40.45 g，調節(jié)pH 為6、含水率至80%，121 ℃滅菌30 min。

生物腐植酸發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵體系為150 mL 三角瓶，含麥秸3.00 g、麩皮0.45 g、KH2PO40.45 g，調節(jié)pH為6、含水率至80%，121 ℃滅菌30 min。

1.1.4 商品腐植酸

供試商品腐植酸為濟農牌液體腐植酸水溶肥，主要以堿溶液作為萃取劑從風化褐煤中提取。購于江蘇省農科院明天種業(yè)公司，相關技術指標為：腐植酸≥40 g·L-1，總養(yǎng)分（N+P2O5+K2O）≥800 g·L-1。

1.2 方法

1.2.1 真菌菌株分離

取1 g 環(huán)境樣品充分懸浮于10 mL 無菌水中，梯度稀釋至10-4、10-6、10-8，吸取200μL懸液均勻涂布于PDA 固體培養(yǎng)基，置于28 ℃培養(yǎng)3～5 d。待長出菌落后，挑取平板上生長良好且形態(tài)特征不同的單菌落，轉接至新的PDA 固體培養(yǎng)基進一步純化并傳代2～3次。將分離獲得的真菌菌株轉接于PDA 斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株鑒定

真菌菌株基因組DNA 提取采用Omega 公司的EZNA Fungal DNA Mini Kit 試劑盒進行提?。焕靡颕TS1（正向引物：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（反向引物：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）擴增ITS 區(qū)域[11]，純化后的擴增產物由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序；將獲得的測序結果提交NCBI 數(shù)據(jù)庫進行Blast 同源性分析，采用MEGA5.2軟件鄰位連接法構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 腐殖化功能菌株篩選

（1）種子液制備。28 ℃培養(yǎng)7～10 d，待菌絲長滿整個平板后，用滅菌竹簽刮取培養(yǎng)基表面孢子加入到適量無菌水中，充分振蕩制成孢子懸液，利用血球計數(shù)板法計算孢子濃度，然后用無菌水調整孢子濃度至107個·mL-1備用。

（2）腐殖化功能菌株的初篩。將種子液按照1×107個·g-1（以干質量計，下同）接種于滅過菌的篩選培養(yǎng)基，無菌條件下攪拌均勻，于28 ℃發(fā)酵15 d。發(fā)酵結束后，測定腐植酸產量、木質纖維素降解酶活力，并進行分子生物學鑒定。

（3）菌株產腐植酸能力測定。發(fā)酵結束后的樣品參照國際腐殖質協(xié)會規(guī)定的方法提取腐植酸[12]，即在1 g 樣品中加入10 mL 提取液（0.1 mol·L-1NaOH+0.1 mol·L-1Na4P2O7，體積比為1∶1），室溫下振蕩2 h，4 000 r·min-1離心10 min，提取上清液，去掉濾渣，濾渣按照上述操作重復3次提取過程。濾液為總腐植酸，取1/3測定腐植酸，剩下2/3 用6 mol·L-1的鹽酸酸化至pH 1.0～2.0，充分攪拌，室溫下靜置過夜，4 000 r·min-1條件下離心10 min，沉淀物為胡敏酸，沉淀用0.1 mol·L-1KOH溶解，采用重鉻酸鉀氧化法（《水溶肥料腐植酸含量的測定》NY/T 1971—2010）測定腐植酸碳含量。

（4）菌株產木質纖維素降解酶能力測定。分別以Whatman No.1濾紙、羧甲基纖維素和山毛櫸木聚糖為底物，采用DNS 法測定濾紙酶、內切葡聚糖酶和木聚糖酶活力[13]，分別以2，6-DMP、藜蘆醇和2，2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ATBS）測定錳過氧化物酶、木質素過氧化物酶和漆酶酶活力[14]。

1.2.4 菌株復配

采用對峙培養(yǎng)法考察腐殖化功能菌株之間的相容性。用滅過菌的打孔器（直徑5 mm）分別取活化的直徑相同的功能菌株菌餅接于平板（直徑9 cm）直徑線上一側、距平板邊緣3 cm 處，將不同的功能菌株菌餅接于直徑線另一側對稱處，即兩株菌餅在平板同一直徑線上相距3 cm、各距平板邊緣3 cm，將篩選出來的功能菌株按照上述方法兩兩組合，28 ℃培養(yǎng)7 d，每日觀察菌落的形態(tài)和生長情況，選擇相容性良好的功能菌株進行復配。按照1.2.3 中種子液制備方法制備功能菌株種子液，將相同孢子濃度等量混合均勻，獲得復配后的液體菌劑。

1.2.5 優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵產腐植酸條件

采用單因素試驗優(yōu)化發(fā)酵條件。在1.1.3 生物腐植酸發(fā)酵培養(yǎng)基的條件下，種子液接種量為1×107個·g-1，將碳源分別設為麥秸、麩皮、玉米芯、米糠，將氮源分別設為尿素、硫酸銨、蛋白胨、豆粕、花生餅，以考察碳源和氮源對生物腐植酸產量的影響。接著在最優(yōu)碳源和氮源的基礎上，將碳氮源質量比分別設為1∶1、1∶0.8、1∶0.5、1∶0.2，將初始含水率分別設為50%、60%、70%、80%，將接種量分別設為105、106、107、108個·g-1，于28 ℃發(fā)酵7 d 后測定生物腐植酸產量，分別考察相應因素對生物腐植酸產量的影響。最后，在最佳培養(yǎng)基組成和最佳培養(yǎng)條件下分別發(fā)酵5、10、15、20 d，測定生物腐植酸產量，考察發(fā)酵時間對生物腐植酸產量的影響。每個處理3 個平行。

1.2.6 生物腐植酸性質分析

將生物腐植酸與市售標準腐植酸凍干得到固體粉末樣品，比較二者的元素組成和表面官能團種類。

（1）元素組成分析。用德國VARIO IP20 型元素分析儀測定兩種腐植酸組分的C、N、H、S 元素含量[15]，通過操作軟件自動計算出待測樣品中元素的百分比含量。用灼燒法測定腐植酸灰分，利用差減法計算得到腐植酸中O元素含量。

（2）紅外光譜。采用傅里葉紅外光譜（FTIR）對生物腐植酸、市售腐植酸進行特征官能團分析。取1～2 mg 凍干固體，利用傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet Is50，賽默飛世爾科技公司，美國）進行紅外光譜分析，波數(shù)采集范圍為4 000～400 cm-1。紅外譜圖數(shù)據(jù)處理[16]：將樣品透射率轉換為吸光度之后，進行基線自動矯正，利用OMNIC9 軟件對樣品圖譜進行峰面積計算。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2019 進行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS Statistics 26.0v.進行不同樣本數(shù)據(jù)之間的差異顯著性分析，多重比較采用Duncan 法（α=0.05），采用Origin 2019b制圖。

2 結果與分析

2.1 真菌菌株分離及鑒定

本研究從吉林、內蒙古和云南的枯木、森林凋落物和表層土樣品中篩選得到14 株真菌，并對其進行編號。分別提取這14 株菌總DNA 擴增ITS 序列并測序，提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫獲得登錄號，并在NCBI 數(shù)據(jù)庫比對選取與每個真菌菌株序列同源性最高的前10個菌株ITS序列，使用MEGA5.2軟件通過鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。通過與已知菌株序列進行比對，獲得其分類學地位信息，包括5 株深綠木霉（OR041595、OR041596、OR041593、OR041594、OR041605）、1株雜色曲霉（OR041599）、1 株裂褶菌（OR041598）、1 株擬康氏木霉（OR041601）、1 株哈茨木霉DLT21（OR041602）、1 株康氏木霉（OR041603）、1 株絨毛木霉（OR041604）、1 株硫色木霉（OR041606）、1 株雅致小克銀漢霉（OR041607）、1 株托姆青霉（OR041604），其中木霉屬真菌數(shù)量最多，且在3 個采樣地均有分布，表明木霉菌對不同環(huán)境均有較強適應性。

2.2 腐殖化功能菌株篩選和復配

以小麥秸稈為原料，分別利用14 株真菌進行固態(tài)發(fā)酵，腐植酸產量如圖1 所示。由圖1a 可看出，哈茨木霉DLT21 總腐植酸產量最多，為299 mg·g-1，其次是絨毛木霉DLS32 和裂褶菌JLD3，其總腐植酸產量分別為281、281 mg·g-1。總腐植酸產量最少的是雅致小克銀漢霉DLS21，為125 mg·g-1。不同屬菌株的腐殖化能力差異明顯，這歸因于菌株的產酶能力不同，對底物的降解轉化能力不同。由圖1b 可看出，哈茨木霉DLT21 胡敏酸產量最高，為96 mg·g-1，其次是雜色曲霉JLS2，為83 mg·g-1，這兩株菌胡敏酸產量顯著高于其他菌株。

圖1 功能菌株的生物腐植酸產量Figure 1 BHS production of functional strains

微生物在降解木質纖維素過程中會產生腐植酸的重要前體酚類物質[17]，因此木質纖維素降解酶活力是篩選腐殖化功能菌株的重要指標。各功能菌株酶活力如圖2 所示。對于纖維素酶，裂褶菌JLD3、硫色木霉DLL42 和雜色曲霉JLS2 濾紙酶活力顯著高于其他菌株酶活（圖2a）。裂褶菌JLD3、雜色曲霉JLS2 和絨毛木霉DLS32 內切葡聚糖酶活力明顯高于其他菌株酶活（圖2b）。對于半纖維素酶，在14 株菌中托姆青霉DLL22 木聚糖酶活力最高，其次是裂褶菌JLD3和哈茨木霉DLT21（圖2c）。對于木質素降解酶，擬康氏木霉DLS12高產錳過氧化物酶，其余菌株產錳過氧化物酶能力無顯著差異（圖2d）。所有菌株均未檢測到木質素過氧化物酶和漆酶活力。

圖2 功能菌株的木質纖維素降解酶活性Figure 2 Lignocellulose-degrading enzyme activities of functional strains

以菌株產腐植酸和產酶能力為衡量指標選擇腐殖化功能菌株，14 株菌中哈茨木霉DLT21、絨毛木霉DLS32、裂褶菌JLD3 和擬康氏木霉DLS12 腐植酸產量最高，裂褶菌JLD3 產纖維素酶和半纖維素酶能力強于其他菌株，擬康氏木霉DLS12的木質素降解酶活力較高，因此選擇這4 株功能菌株進行菌劑復配。雖然托姆青霉DLL22、硫色木霉DLL42和雜色曲霉JLS2也表現(xiàn)出較高的產腐植酸或產酶水平，但由于這些真菌在發(fā)酵過程中可能產生真菌毒素，所以在菌劑復配中予以排除。

為了考察四株功能菌株的相容性，采用對峙培養(yǎng)法將功能菌株兩兩組合接于平板，觀察菌株生長情況，各功能菌株相容性結果如圖3 所示，各平板兩菌株之間未出現(xiàn)抑菌圈且交叉點生長良好，表明這四株真菌均不產生拮抗作用。將這四株真菌按照相同孢子濃度等量混合均勻，獲得復配后的液體菌劑，用于后續(xù)發(fā)酵條件優(yōu)化。

圖3 功能菌株的相容性Figure 3 Compatibility of functional strains

2.3 復合菌劑發(fā)酵條件優(yōu)化

2.3.1 碳源對腐植酸產量的影響

不同碳源含類腐殖質的結構復雜程度不同，對真菌轉化碳源底物形成腐植酸具有重要影響[18]。如圖4a 所示，當以麩皮、玉米芯為碳源時，總腐植酸、胡敏酸產量最高，且無顯著差異性。但以麩皮為碳源時，總腐植酸產量最高，為178 mg·g-1，這可能是由于麩皮的TOC、TN、TP和TK含量高于其他碳源（見表1）。另外，麩皮中含有的礦物質、維生素等營養(yǎng)物質，能夠促進菌體代謝，所以選擇麩皮作為最佳碳源。

圖4 不同發(fā)酵條件對生物腐植酸產量的影響Figure 4 Effects of different fermentation conditions on the yield of humic substrance

2.3.2 氮源對腐植酸產量的影響

不同氮源可以為腐殖化過程提供不同的前體物質[19]。氮源對腐植酸產量影響如圖4b 所示，當豆粕作為氮源時，腐植酸產量顯著高于其他氮源，其總腐植酸、胡敏酸產量分別為180、69 mg·g-1，這可能是因為豆粕中TOC 和TN 含量較高，并且豆粕中豐富的蛋白質提供了更多氨基酸等腐植酸前體物質，經微生物轉化作用產生了更多的腐植酸。

2.3.3 碳氮源質量比對腐植酸產量的影響

碳氮源形成的C/N 影響著有機質的分解速率和降解程度，進而影響腐植酸的形成[20]。由圖4c 可知：當碳氮源質量比較小時，總腐植酸產量顯著高于碳氮源質量比較大時的總腐植酸產量。當調節(jié)碳氮源質量比為1∶0.8 時，總腐植酸產量達到最高，為275 mg·g-1，此時胡敏酸的產量也是最高的，為96 mg·g-1。

2.3.4 初始含水率對腐植酸產量的影響

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始含水率通過影響通氧量從而影響微生物發(fā)酵的腐植酸產量[21]。圖4d 表明調節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)基含水率對總腐植酸產量無顯著差異性，但培養(yǎng)基含水率為70%時，總腐植酸產量最高，為316 mg·g-1，此時對應的胡敏酸產量也較高，為90 mg·g-1。

2.3.5 菌劑接種量對腐植酸產量的影響

接種量會直接影響菌株在培養(yǎng)基質中的發(fā)酵速度和生產效率。功能菌株菌劑接種量對腐植酸產量的影響如圖4e 所示，總腐植酸產量隨菌劑接種量改變而改變，而胡敏酸產量隨著菌劑接種量的改變無顯著性差異。當孢子接種量為107個·g-1時，總腐植酸產量最高，為279 mg·g-1，此時胡敏酸產量為88 mg·g-1。

2.3.6 發(fā)酵時間對腐植酸產量的影響

由圖4f可知，腐植酸產量隨著發(fā)酵時間的延長呈增加趨勢，總腐植酸產量隨著發(fā)酵時間延長逐漸增加，當發(fā)酵20 d 時，總腐植酸產量均最高，分別為338 mg·g-1；胡敏酸產量隨著發(fā)酵時間延長呈略微增加趨勢，但并不顯著，其產量在82～105 mg·g-1之間。當發(fā)酵時間分別為15 d和20 d時，總腐植酸產量無顯著差異，考慮到實際生產成本，因此選擇發(fā)酵15 d 作為最優(yōu)發(fā)酵時間，此時總腐植酸產量為311 mg·g-1。

2.4 生物腐植酸結構特性分析

2.4.1 生物腐植酸元素含量分析

腐植酸主要由碳（C）、氫（H）、氧（O）三種元素組成，其次含有少量氮（N）和硫（S）元素[22]。由表2 可知，生物腐植酸中C 元素含量最多，為41.03%，O 元素次之，為26.09%，均低于商品腐植酸C、O 元素含量，而生物腐植酸中N、H 元素含量分別是商品腐植酸的4.63 倍和2.48 倍，這進一步影響了兩種腐植酸的C/H、O/C、C/N。C/H 被認為是腐植酸分子縮合度的評價指標，C/H 值越小，表明腐植酸縮合度越低[23]，生物腐植酸的C/H 小于商品腐植酸，表明生物腐植酸縮合度低于商品腐植酸。O/C 表征腐植酸的氧化程度，反映了腐植酸中含氧官能團含量，O/C 值越大，說明腐植酸中含氧官能團越多[24]，生物腐植酸O/C 值小于商品腐植酸，表明生物腐植酸含氧官能團含量低于商品腐植酸。另外，生物腐植酸的C/N 值小于商品腐植酸，表明生物腐植酸含氮基團較多。

表2 腐植酸元素分析Table 2 Element analysis of humic substrance

2.4.2 生物腐植酸紅外光譜分析

FTIR 是研究腐植酸官能團種類的重要方法之一。圖5 中峰1（3 500～3 200 cm-1）是的伸縮振動，化合物來源主要為多糖、纖維素[25]；峰2、峰3（3 000～2 800 cm-1）是指表征脂肪和脂質類化合物的亞甲基CH2的伸縮振動[26]；峰4（1 630 cm-1）是表征羧酸根的伸縮振動[27]；峰5（1 590～1 540 cm-1）表征酰胺類化合物的伸縮振動；峰6（1 480～1 340 cm-1）代表羧酸根離子的非對稱伸縮振動；峰7（1 320～1 240 cm-1）代表羧基上的伸縮振動；峰8（1 120～990 cm-1）代表酚類或醇類上的不對稱伸縮振動；峰9（920～800 cm-1）代表伸縮振動。生物腐植酸的官能團種類與商品腐植酸類似，但兩種腐植酸的官能團含量存在較大差異，生物腐植酸中峰1、峰2、峰3、峰5、峰8代表的基團伸縮振動較強烈，表明生物腐植酸中含有較多的羥基、亞甲基和酰胺基官能團。

圖5 腐植酸的FTIR圖譜Figure 5 FTIR spectra of humic substrance

3 討論

不同微生物的木質纖維素降解酶系組成不同，導致其對木質纖維素的降解轉化能力也存在差異，進而影響菌株的腐殖化能力。本研究篩選得到的裂褶菌JLD3、絨毛木霉DLS2、哈茨木霉DLT21和擬康氏木霉DLS12四株功能菌株可以分別產生纖維素降解酶、半纖維素降解酶和木質素降解酶，能夠降解發(fā)酵原料中的大分子有機物，生成腐植酸前體物質，復配后菌劑的腐植酸產量較單一菌株均有所提高。本試驗中對復合菌劑發(fā)酵條件優(yōu)化后腐植酸產量達到338 mg·g-1，較優(yōu)化前腐植酸產量提高了32%～128%，而冀頤之等[28]利用解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和長枝木霉組成復配菌劑，以果渣為底物發(fā)酵產生的黃腐酸僅為103 mg·g-1。陳勇強[29]以玉米秸稈和麩皮作為底物，利用枯草芽孢桿菌進行發(fā)酵條件優(yōu)化，其腐植酸產量為196 mg·g-1。本研究結果較二者分別提高了202%和59%。此外，本研究經過發(fā)酵條件優(yōu)化，接種復合菌劑制備腐植酸顯著縮短發(fā)酵周期，15 d腐植酸產量達34%，而王思同等[9]利用細菌菌劑進行36 d 的菌糠發(fā)酵，腐植酸產量為23%。本文結果表明，根據(jù)原料組成特點進行功能菌株的合理復配，可以顯著提高農業(yè)廢棄物發(fā)酵制備生物腐植酸的產量。

本研究利用復配的微生物菌劑對常見的農業(yè)廢棄物進行固態(tài)發(fā)酵，對發(fā)酵條件優(yōu)化后提高了生物腐植酸產量。本研究表明，固態(tài)發(fā)酵中碳源、氮源以及碳氮源質量比對腐植酸產量的影響較其他發(fā)酵條件的影響更大。以麩皮為碳源時，復合菌劑產腐植酸量明顯高于其他碳源，這可能是因為麩皮中富含的具有生理活性的酚類物質是腐植酸形成的重要前體物質[30-31]。以豆粕為氮源時復合菌劑產腐植酸量顯著高于其他氮源，這可能是因為豆粕中含有的蛋白質及少量可溶性多糖有助于微生物的生物量積累[32]。有研究指出，腐植酸的酚型化合物和醌型化合物等前體物質在微生物作用下與蛋白質、氨基酸等氨基化合物經過復雜作用形成腐植酸[33]，因此通過調節(jié)麩皮和豆粕的質量比，使發(fā)酵體系中酚類物質與氨基化合物達到適宜比例，從而顯著提高了復合微生物菌劑發(fā)酵的腐植酸產量。本研究制備生物腐植酸用的麥麩、豆粕等原料都屬于農副產品、價格低廉，按照腐植酸產率為原料30%計算，生產每千克腐植酸成本為63元，而市場現(xiàn)有腐植酸價格普遍較高，成本為每千克75～140 元，因此本研究技術在實現(xiàn)農業(yè)廢棄物原料高效轉化的同時，極大地降低了生物腐植酸的生產成本，具有較強的市場競爭力。

兩種不同來源的腐植酸在元素組成及FTIR 圖譜具有相似特征，兩種腐植酸中C、O 元素含量均最高，腐植酸結構中都存在等官能團，這與前人研究結果一致[34]。本研究中生物腐植酸的C、O 元素含量都略低于商品腐植酸，這可能是因為商品腐植酸的提取方式改變了其組成，使得商品腐植酸C、O 含量較高。生物腐植酸的N、H 元素含量均高于商品腐植酸，這可能是制備生物腐植酸的原料中蛋白質含量較高所致。另外，兩種腐植酸官能團種類相似，但官能團含量存在較大差異性，生物腐植酸中、CH2和的伸縮振動較強烈，表明生物腐植酸中此類官能團含量較高，與生物腐植酸中N、H元素含量高相一致，這主要是由于生物腐植酸中含有較多糖類、脂質類物質。

4 結論

（1）本研究從森林環(huán)境樣品中篩選獲得4 株具有高效木質纖維素腐殖化能力的真菌菌株，包括哈茨木霉DLT21、絨毛木霉DLS32、裂褶菌JLD3 和擬康氏木霉DLS12，各菌株之間具有良好的相容性和互補的降解酶系，通過4株真菌組配構建了復合微生物菌劑。

（2）利用復合微生物菌劑進行產腐植酸固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化，明確最佳發(fā)酵條件為：麩皮為碳源、豆粕為氮源、碳源與氮源質量比為1∶0.8、培養(yǎng)基含水率為70%、孢子接種量為107個·g-1（以干質量計），發(fā)酵20 d 時，總腐植酸產量達338 mg·g-1。

（3）與商品腐植酸相比，本研究制備獲得的生物腐植酸具有更高的N、H 元素含量以及更多的羥基、亞甲基和酰胺基官能團。