高溫持續(xù)時(shí)間對(duì)雞糞堆肥中多重耐藥菌、接合型質(zhì)粒及耐藥基因消減特征的影響

尹天奇，孫興濱，高浩澤，申磊，姜欣然，郭雅杰，王旭明，仇天雷*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，哈爾濱 150040；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所，北京 100097；3.廊坊師范學(xué)院，河北 廊坊 065000）

21 世紀(jì)以來(lái)，抗生素耐藥性嚴(yán)重威脅著全球人類(lèi)的健康，美國(guó)每年約有2.3 萬(wàn)人因感染抗生素耐藥細(xì)菌而死亡[1]。據(jù)WHO 預(yù)測(cè)，到2050 年因抗生素耐藥性的全球死亡人數(shù)將達(dá)到1 000 萬(wàn)[2]。畜禽養(yǎng)殖業(yè)的抗生素使用量是人類(lèi)醫(yī)療使用量的兩倍[3]，多重耐藥菌在畜禽糞便中的檢出率越來(lái)越高[4]，因而畜禽糞便是環(huán)境中耐藥細(xì)菌和抗生素耐藥基因（Antibiotic resistance gene，ARGs）的重要來(lái)源[5]。耐藥細(xì)菌和ARGs會(huì)隨畜禽糞便排出后通過(guò)有機(jī)肥料或者土壤傳播到環(huán)境中，再通過(guò)食物鏈傳播到人體，對(duì)人類(lèi)健康造成潛在威脅[6]。

高溫堆肥是畜禽糞便無(wú)害化處理的有效途徑，堆肥過(guò)程中溫度、微生物群落組成、理化性質(zhì)等都能夠影響ARGs 的豐度[7]，尤其是堆肥的高溫對(duì)于畜禽糞便中ARGs 的消減十分重要。當(dāng)堆肥進(jìn)入高溫期后，ARGs 豐度會(huì)出現(xiàn)明顯下降，同時(shí)也能有效降低基因水平轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[8]，但Liao 等[7]，Sardar 等[9]發(fā)現(xiàn)部分基因的相對(duì)豐度在高溫期結(jié)束后出現(xiàn)了增長(zhǎng)趨勢(shì)，而該增長(zhǎng)與ARGs 的宿主菌在降溫期的增長(zhǎng)密切相關(guān)。近期有研究發(fā)現(xiàn)延長(zhǎng)堆肥高溫持續(xù)時(shí)間能夠提高抗生素的降解效率，且持續(xù)的高溫處理也能夠顯著降低堆肥產(chǎn)品中部分ARGs的相對(duì)豐度[10]。延長(zhǎng)堆肥高溫持續(xù)時(shí)間能否有效控制耐藥菌及其ARGs 在堆肥降溫期的反彈是改進(jìn)現(xiàn)有堆肥工藝和有效控制ARGs水平轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵問(wèn)題。因此，本研究設(shè)置延長(zhǎng)高溫時(shí)間（CT）和常規(guī)堆肥（NT）兩種雞糞堆肥處理，同時(shí)在堆肥原料中外源添加攜帶接合型耐藥質(zhì)粒的多重耐藥大腸桿菌，利用選擇性培養(yǎng)、數(shù)字PCR 以及16S rRNA 基因擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)，分析延長(zhǎng)高溫時(shí)間對(duì)多重耐藥大腸桿菌及其接合型質(zhì)粒與ARGs 的消減規(guī)律的影響，同時(shí)解析兩種堆肥方式對(duì)定量ARGs 相關(guān)宿主菌群演替規(guī)律的影響，以期為更好地利用堆肥技術(shù)控制畜禽養(yǎng)殖糞便中的ARGs 污染，阻控其在相關(guān)環(huán)境內(nèi)的傳播奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 堆肥系統(tǒng)和原料

堆肥試驗(yàn)在6 臺(tái)50 L 臺(tái)式圓柱形不銹鋼堆肥反應(yīng)器中進(jìn)行，反應(yīng)器底部連接氣泵，通過(guò)氣體流量計(jì)可控制通風(fēng)供氧速率。反應(yīng)器內(nèi)溫度主要采用外圍電阻控制加溫。同時(shí)，設(shè)有多個(gè)傳感器和智能監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)器內(nèi)部多點(diǎn)溫度、壓力、氣流等。

堆肥原料由雞糞和玉米秸稈粉（粒徑為2～3 cm）組成，均取自北京市平谷區(qū)某蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)。將雞糞和玉米秸稈按5∶1 質(zhì)量比例混合，混合均勻后加水調(diào)節(jié)含水率至60%。用五點(diǎn)取樣法取出14 kg混合物加入大腸桿菌XT13A1 菌液攪拌均勻，XT13A1 菌株分離自養(yǎng)殖場(chǎng)雞糞，其攜帶接合型轉(zhuǎn)移質(zhì)粒攜帶有Ⅰ類(lèi)整合子-整合酶基因（intl1，簡(jiǎn)稱為Ⅰ類(lèi)整合酶基因）、代表接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移酶基因MOBP、氨基糖苷類(lèi)耐藥基因APH（3）-Ib及磺胺類(lèi)耐藥基因sul2[11]，使其終濃度達(dá)到4.77×107CFU·g-1，使用透水透氣的尼龍隔離網(wǎng)袋（長(zhǎng)40 cm，寬30 cm 米，孔徑2 mm）分裝成7 袋（2 kg·袋-1）。

1.2 堆肥試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本次堆肥歷時(shí)40 d，試驗(yàn)設(shè)置兩個(gè)處理組，分別為常規(guī)堆肥組（NT）和延長(zhǎng)高溫時(shí)間組（CT），每個(gè)處理組設(shè)3 個(gè)重復(fù)。NT 組0～27 d 進(jìn)行自然堆肥過(guò)程，CT 組0～11 d 自然堆肥，12～27 d 設(shè)置溫度55 ℃，延長(zhǎng)堆肥高溫期。堆肥過(guò)程中曝氣速率保持在0.05 L·（min·kg）-1。6 臺(tái)堆肥反應(yīng)器中分別加入27 kg 堆肥原料混合物，堆體內(nèi)部埋入尼龍隔離網(wǎng)袋樣品，保證其與反應(yīng)器內(nèi)未加菌堆體隔離。同時(shí)反應(yīng)器外放置一個(gè)網(wǎng)袋，不參與堆肥過(guò)程（CK 組）。分別在堆肥的第0、4、11、27、40 天進(jìn)行翻堆混勻并采集網(wǎng)袋內(nèi)樣品，樣品命名分別為：第0 天取樣（初始物料）、第4 天CT 取樣（CT-高溫期）、第4 天NT 取樣（NT-高溫期）、第4 天CK 取樣（CK-前期）、第11 天NT 取樣（NT-高溫期結(jié)束）、第27 天CT 取樣（CT-高溫期結(jié)束）、第27天NT取樣（NT-腐熟期結(jié)束）、第27天CK 取樣（CK 后期）、第40天CT取樣（CT-腐熟期結(jié)束）。采集樣品后在24 h內(nèi)進(jìn)行總菌和耐藥菌的計(jì)數(shù)，另一部分于-20 ℃保藏，用于樣品DNA提取和數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)。

1.3 總菌及多重耐藥菌計(jì)數(shù)

稱取10 g 堆肥樣品，倒入已滅菌的90 mL 生理鹽水三角瓶中，搖床振蕩15 min 使堆肥樣品均勻分散，吸取懸浮液進(jìn)行梯度稀釋。稀釋液涂布對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基：細(xì)菌總數(shù)采用普通LB 營(yíng)養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基，多重耐藥菌的計(jì)數(shù)采用添加抗生素的LB 固體培養(yǎng)基，每組3 個(gè)重復(fù)。添加的抗生素包括四環(huán)素（16 μg·mL-1）、恩諾沙星（1 μg·mL-1）、磺胺甲噁唑（76 μg·mL-1）、泰樂(lè)菌素（1μg·mL-1）、慶大霉素（20μg·mL-1）。抑菌濃度參考2011 年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）規(guī)定值[12]。涂布后平板倒置于28 ℃恒溫箱中，培養(yǎng)48 h，選取菌落數(shù)為30～300 的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，刮取菌體于保藏-80 ℃。

1.4 DNA提取及數(shù)字PCR定量檢測(cè)

1.4.1 多重耐藥細(xì)菌DNA提取及測(cè)序

使用TIANamp Bacteria DNA Kit 試劑盒，從多重耐藥菌混菌中提取細(xì)菌DNA，經(jīng)檢測(cè)后送往上海美吉生物科技有限公司進(jìn)行16S rRNA基因擴(kuò)增子測(cè)序。

1.4.2 耐藥基因引物設(shè)計(jì)與數(shù)字PCR定量檢測(cè)

根據(jù)多重耐藥大腸桿菌XT13A1 的基因設(shè)計(jì)腸桿菌16S rRNA 基因特異性引物；同時(shí)，根據(jù)耐藥菌攜帶的質(zhì)粒序列，設(shè)計(jì)Ⅰ類(lèi)整合子-整合酶基因（intl1，簡(jiǎn)稱為Ⅰ類(lèi)整合酶基因）、大腸桿菌16S rRNA基因、代表接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移酶基因的MOBP基因、氨基糖苷類(lèi)耐藥基因APH（3）-Ib及磺胺類(lèi)耐藥基因sul2對(duì)應(yīng)的Taqman探針引物。intl1和細(xì)菌16S rRNA基因引物參照文獻(xiàn)[13]。數(shù)字微滴式PCR 反應(yīng)在QX200 Droplet Digital PCR Systems 中完成，選用Trans PCR SuperMix，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。引物名稱及引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物名稱及引物序列Table 1 Primer and primer sequences

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用軟件Origin（v9.6.5）進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的整理和作圖。根據(jù)時(shí)間與定量基因相對(duì)豐度變化，進(jìn)行非線性回歸分析，使用一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)方程對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，方程如下：式中：C為t時(shí)基因的相對(duì)豐度，copies·16S rDNA copies-1；C0為堆肥開(kāi)始時(shí)基因的相對(duì)豐度，copies·16S DNA copies-1；k為耐藥基因消減速率常數(shù)，d-1。

對(duì)于不符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)方程的基因運(yùn)用R語(yǔ)言ggmisc包進(jìn)行分段線性回歸分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 高溫堆肥過(guò)程中溫度變化

溫度是判斷堆肥過(guò)程的重要參數(shù)[14]。根據(jù)溫度變化曲線圖（圖1）可以看出，CK處理組始終保持室溫28～29 ℃左右，NT和CT處理組都經(jīng)歷了升溫期、高溫期和腐熟期3 個(gè)典型階段。堆肥初期升溫較快，約1 d 的時(shí)間升至50 ℃以上。NT 處理組的高溫階段持續(xù)到第11天，最高溫度為59.7 ℃，從第12天開(kāi)始逐步下降至室溫，第27 天完成堆肥發(fā)酵過(guò)程。CT 處理組通過(guò)額外的加熱控制系統(tǒng)延長(zhǎng)高溫期，12～27 d 溫度始終保持55 ℃左右。27 d 后溫度開(kāi)始逐步下降至室溫，第40天完成發(fā)酵過(guò)程。

圖1 不同處理組溫度變化趨勢(shì)Figure 1 Temperature variation trend of different treatment groups

2.2 高溫堆肥過(guò)程中細(xì)菌總數(shù)及多重耐藥菌數(shù)的變化

如表2所示，在整個(gè)堆肥過(guò)程中，NT和CT組的總菌數(shù)變化趨勢(shì)相同，CT 組總菌數(shù)從初始的（4.0±0.30）×108CFU·g-1降低到（3.2±0.35）×106CFU·g-1，降低了2 個(gè)數(shù)量級(jí)，消減率為99.2%；NT 組總菌數(shù)從初始的（4.0±0.30）×108CFU·g-1降低到（1.1±0.41）×108CFU·g-1，消減率為72.5%。CK 組總菌數(shù)從前期（7.7±0.25）×108CFU·g-1增長(zhǎng)到后期的（9.2±0.46）×108CFU·g-1，增長(zhǎng)率為16.3%。由此可見(jiàn)，對(duì)比不參與堆肥的CK 組，堆肥可以有效降低總菌數(shù)，這與姜欣然等[11]的堆肥模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果相類(lèi)似。

表2 總菌數(shù)和多重耐藥菌數(shù)量變化Table 2 Changes in the number of multidrug-resistant bacteria and total bacterial count

初始物料中多重耐藥菌數(shù)量為（9.2±0.35）×107CFU·g-1，在第4天CK組多重耐藥菌數(shù)量減少到（2.9±0.12）×106CFU·g-1；而處于堆肥高溫期的NT 組和CT組都未檢出，說(shuō)明堆肥高溫可以有效滅活原料中的多重耐藥菌，可以降低耐藥致病菌隨有機(jī)肥進(jìn)入土壤的風(fēng)險(xiǎn)[15]。然而，王瑤等[16]發(fā)現(xiàn)堆肥后豬糞中紅霉素、金霉素等抗生素耐藥菌均能夠在堆肥后繼續(xù)存活，說(shuō)明多重耐藥菌比單一耐藥菌更易被堆肥高溫滅活。然而在第27天NT組（NT-腐熟期結(jié)束）又有多重耐藥菌的出現(xiàn)，而延長(zhǎng)高溫的CT 組即使在腐熟期結(jié)束后都始終沒(méi)有多重耐藥菌被檢出，這說(shuō)明了延長(zhǎng)高溫后能夠明顯抑制多重耐藥菌的反彈。

2.3 多重耐藥菌群落組成變化分析

收集初始物料、NT-腐熟期結(jié)束、CK 的前期和后期樣品中的多重耐藥菌并進(jìn)行16S rRNA 擴(kuò)增子測(cè)序，共獲得有效序列168 327 條，平均序列長(zhǎng)度424 bp，共有239 個(gè)OTU。從圖2 可以看出，由于在第0 天初始樣品中添加大腸桿菌XT13A1，所以初期Escherichia占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度達(dá)到99.9%。從圖中可以看出，CK 前期樣品中可能由于多重耐藥質(zhì)粒向其他細(xì)菌進(jìn)行了轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致物種多樣性相比原始物料明顯增多，從組成分析可以看出主要有norank_f__Sphingobacteriaceae（8.99%）、Halomonas（8.89%）、Ulvibacter（6.81%）和norank_f__Xanthomonadaceae（5.62%）。然而在CK 后期樣品中多重耐藥菌種類(lèi)明顯減少，主要以Glutamicibacter（51.9%）為優(yōu)勢(shì)屬，其次為Pseudomonas（23.3%）、Paenalcaligenes（16.39%）。該結(jié)果可以說(shuō)明即使未進(jìn)行堆肥，該耐藥質(zhì)粒也會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)而在缺少抗生素環(huán)境壓力的情況下被淘汰，導(dǎo)致整體菌群的多重耐藥性下降。堆肥腐熟期結(jié)束后的NT 樣品中Paenalcaligenes占明顯優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度為96.87%，其次是Pusillimonas占3.70%。但這兩種菌屬在第0 天的檢測(cè)中幾乎沒(méi)有。出現(xiàn)這種結(jié)果可能與ARGs 的轉(zhuǎn)移作用有關(guān)。一種可能是水平轉(zhuǎn)移作用由于人為添加的多耐藥菌株XT13A1所攜帶的多耐藥質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移到了其他耐熱菌屬，從而導(dǎo)致多重耐藥菌在堆肥結(jié)束后有所增長(zhǎng)[17]。另一種可能為堆肥高溫會(huì)阻斷多重耐藥菌的水平轉(zhuǎn)移作用，但Paenalcaligenes和Pusillimonas多重耐藥菌屬本身就有這類(lèi)多重耐藥ARGs，由于耐受高溫而在堆肥過(guò)程出現(xiàn)了富集，即垂直傳播。因此，我們進(jìn)一步對(duì)多重耐藥菌及其質(zhì)粒上攜帶的ARGs 進(jìn)行了定量分析，解析不同傳播特征的ARGs 在堆肥過(guò)程中的消減規(guī)律。

圖2 多重耐藥菌菌群在屬水平上的分布Figure 2 Distribution of multidrug-resistant bacterial flora at the genus level

2.4 堆肥過(guò)程中耐藥基因相對(duì)豐度的變化

ARGs的相對(duì)豐度通常表征菌群中相應(yīng)耐藥水平的高低[18]。堆肥過(guò)程中，耐藥基因、Ⅰ類(lèi)整合子和代表型接合質(zhì)粒的相對(duì)豐度和削減率的關(guān)系如圖3 所示，從圖3 可以看出，在堆肥過(guò)程中，腸桿菌特異的16S rRNA基因和代表多重耐藥質(zhì)粒的（MOBP基因）消減良好。腸桿菌16S rRNA基因在CT 組的相對(duì)豐度從初始原料中的8.61×10-3copies·16S rDNA copies-1降低到堆肥腐熟期結(jié)束時(shí)的1.53×10-5copies·16S rDNA copies-1，消減率為99.80%。在NT 組相對(duì)豐度從初始原料中的7.06×10-3copies·16S rDNA copies-1降低到1.47×10-5copies·16S rDNA copies-1，消減率為99.79%。MOBP基因CT 組中相對(duì)豐度從初始原料中的6.04×10-4copies·16S rDNA copies-1降低到腐熟期結(jié)束時(shí)的4.66×10-7copies·16S rDNA copies-1，消減率為99.92%；NT 組中相對(duì)豐度從初始原料中的5.16×10-4copies·16S rDNA copies-1降低到9.78×10-7copies·16S rDNA copies-1，消減率為99.81%，說(shuō)明堆肥對(duì)于添加的多重耐藥菌及質(zhì)粒均有良好的消減效果。

圖3 堆肥不同時(shí)期耐藥基因、Ⅰ類(lèi)整合子和代表型接合質(zhì)粒的相對(duì)豐度和消減率Figure 3 Relative abundance and reduction rate of drug resistance genes，and I integron-integratase gene representative conjugation plasmids in compost at different periods

雖然大腸桿菌及耐藥質(zhì)粒的代表基因均出現(xiàn)明顯下降，但同為多重耐藥菌攜帶的APH（3）-Ib、sul2和intl1三種耐藥基因的相對(duì)豐度卻未出現(xiàn)持續(xù)下降，尤其在NT 組，反而隨著堆肥高溫期結(jié)束而逐漸升高。從圖3 可以看出在CT 組中，APH（3）-Ib、sul2和intl1在高溫期結(jié)束時(shí)相對(duì)豐度明顯降低，經(jīng)歷腐熟期后，相對(duì)豐度幾乎不變。由于代表接合型耐藥質(zhì)粒的基因有明顯下降，說(shuō)明這三種基因傳播的增長(zhǎng)不會(huì)來(lái)自于接合轉(zhuǎn)移的水平轉(zhuǎn)移作用，而可能通過(guò)耐藥基因隨宿主增長(zhǎng)的垂直傳播作用，因此延長(zhǎng)高溫的堆肥時(shí)間是能夠有效抑制耐藥基因的垂直傳播作用。具體來(lái)說(shuō)，在CT 組中，APH（3）-Ib基因的相對(duì)豐度從初始物料1.55×10-3copies·16S rDNA copies-1下降到1.53×10-4copies·16S rDNA copies-1，消減率為90.18%；sul2基因的相對(duì)豐度從初始物料1.09×10-2copies·16S rDNA copies-1下降到0.14×10-2copies·16S rDNA copies-1，消減率為87.19%。Qian 等[19]也發(fā)現(xiàn)延長(zhǎng)高溫持續(xù)時(shí)間可以使sul2基因的相對(duì)豐度較常規(guī)堆肥大幅下降。intl1從初始物料1.28×10-2copies·16S rDNA copies-1下降到0.26×10-2copies·16S rDNA copies-1，消減率為79.7%。但是在NT 組中，三種基因在高溫期結(jié)束時(shí)的相對(duì)豐度與和CT 組相比都存在顯著差異，APH（3）-Ib基因和sul2高溫期結(jié)束時(shí)相對(duì)豐度分別為9.01×10-1copies·16S rDNA copies-1和1.25×10-2copies·16S rDNA copies-1，相比初始物料都有所上升。Sardar 等[9]的牛糞玉米秸稈的堆肥實(shí)驗(yàn)后期sul1基因相對(duì)豐度也出現(xiàn)了升高的現(xiàn)象。初始物料中intl1相對(duì)豐度為2.05×10-2copies·16S rDNA copies-1，在高溫期結(jié)束后相對(duì)豐度較初始物料變化較小，但是在腐熟期結(jié)束后增長(zhǎng)到4.21×10-2copies·16S rDNA copies-1。綜合可培養(yǎng)耐藥菌及ARGs 的結(jié)果表明，由于延長(zhǎng)高溫持續(xù)時(shí)間，CT 組中耐藥基因在消減后沒(méi)有出現(xiàn)明顯上升；但是NT 組在高溫期結(jié)束后，攜帶ARGs 的細(xì)菌獲得恢復(fù)生長(zhǎng)，導(dǎo)致相應(yīng)ARGs相對(duì)豐度增加。

2.5 堆肥過(guò)程中耐藥菌及耐藥基因的消減動(dòng)力學(xué)分析

為研究堆肥過(guò)程中耐藥菌及其ARGs 消減速率特征，按堆肥時(shí)間對(duì)堆肥過(guò)程中ARGs 相對(duì)豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。首先對(duì)堆肥中的5種ARGs相對(duì)豐度進(jìn)行非線性數(shù)據(jù)擬合，對(duì)比擬合曲線的決定系數(shù)（R2，表3）發(fā)現(xiàn)，腸桿菌特異的16S rRNA基因和質(zhì)粒MOBP基因消減規(guī)律符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程（R2值均大于0.99），而sul2、intl1和APH（3）-Ib消減規(guī)律并不符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。腸桿菌特異的16S rRNA基因的CT 組擬合曲線，消減速率常數(shù)為0.192，半消減期3.61 d。NT組消減速率常數(shù)為0.237，半消減期2.92 d，兩者在15 d 內(nèi)相對(duì)豐度分別降低到3.931×10-5copies·16S rDNA copies-1和4.860×10-5copies·16S rDNA copies-1。說(shuō)明常規(guī)堆肥能夠在15 d內(nèi)對(duì)腸桿菌產(chǎn)生有效消減，這與前期堆肥的模擬研究結(jié)果一致[20]。MOBP在CT組中消減速率常數(shù)為0.277，半消減期2.50 d；NT 組中消減速率常數(shù)為0.241，半消減期為2.87 d。兩個(gè)處理中半消減期均小于3 d，且消減速率都快于腸桿菌，說(shuō)明在堆肥高溫環(huán)境下，多耐藥質(zhì)粒的穩(wěn)定性差于腸桿菌，更容易丟失[21]。消減規(guī)律符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程說(shuō)明，堆肥使得多重耐藥菌以及質(zhì)粒的比例以穩(wěn)定速率減少，即達(dá)到一定高溫時(shí)間后污染物可被消除。然而，另一方面為質(zhì)粒攜帶的APH（3）-Ib、sul2和intl1基因的消減規(guī)律并不符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，主要原因是三者在高溫期結(jié)束后（尤其是NT組）會(huì)出現(xiàn)明顯的相對(duì)豐度反彈，由于質(zhì)粒代表序列未出現(xiàn)同步反彈，此時(shí)增長(zhǎng)的部分是與添加質(zhì)粒無(wú)關(guān)的堆肥原料糞污所貢獻(xiàn)，說(shuō)明能夠耐受高溫的堆肥土著菌的垂直傳播作用更為占優(yōu)勢(shì)，使得相關(guān)ARGs出現(xiàn)反彈[22]。

表3 堆肥中基因相對(duì)豐度的消減速率和半消減期Table 3 Dissipation rate and elimination half-life of ARGs in compost based on relative abuandance

采用分段法對(duì)APH（3）-Ib、sul2和intl1等三種不符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)的ARGs 相對(duì)豐度進(jìn)行線性直線回歸分析（圖4）?？梢钥闯鰺o(wú)論CT還是NT組高溫期對(duì)三者均有一定消減效果，另外是否有額外的高溫期，對(duì)三種基因的相對(duì)豐度是否反彈影響很大。從擬合結(jié)果可以看出，第15 天后的曲線擬合結(jié)果NT 與CT組相差較大。CT 組中3 種ARGs 相對(duì)豐度在堆肥后期過(guò)程中仍以一定的速率下降，消減速率從快到慢分別為intl1（6.94×10-5）＞sul2（3.7×10-5）＞APH（3）-Ib（3.42×10-6）。在腐熟期結(jié)束后對(duì)比第0 天都有明顯的去除效果。但NT 組中APH（3）-Ib、sul2和intl1在第15 天后相對(duì)豐度都以一定的速率上升，增長(zhǎng)速率分別為9.09×10-5、1.74×10-3、3.37×10-3，在腐熟期結(jié)束后對(duì)比原料并沒(méi)有明顯的去除效果。綜上，相關(guān)ARGs 的宿主菌并未經(jīng)過(guò)堆肥高溫獲得有效去除，而是隨著高溫結(jié)束后出現(xiàn)了明顯富集，延長(zhǎng)高溫持續(xù)時(shí)間對(duì)控制ARGs在腐熟期的反彈具有良好效果。

圖4 堆肥過(guò)程中不同處理組中Ⅰ類(lèi)整合子和耐藥基因相對(duì)豐度消減曲線Figure 4 Relative abundance reduction curves of I integron-integratase gene and drug resistance genes in different composting groups

2.6 延長(zhǎng)高溫持續(xù)時(shí)間對(duì)堆肥細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

微生物是影響堆肥腐熟進(jìn)程的主要驅(qū)動(dòng)力[23]，堆肥的高溫期能更有效地殺死細(xì)菌宿主并破壞質(zhì)粒[24]。堆肥不同時(shí)期菌群在屬水平上的分布如圖5 所示，在初始物料中優(yōu)勢(shì)菌屬主要是厚壁菌門(mén)中的Pseudogracilibacillus、Lactobacillus、Oceanobacillus等以及放線菌門(mén)的Corynebacterium等。在堆肥高溫期，Bacillus、Sinibacillus等耐熱或者嗜熱細(xì)菌逐漸成為優(yōu)勢(shì)。Bacillus屬于厚壁菌門(mén)，厚壁菌在高溫期可以形成耐熱孢子以抵抗高溫，還可以促進(jìn)堆體中有機(jī)類(lèi)物質(zhì)的降解[25]。但是由于CT 和NT 高溫持續(xù)時(shí)間的不同，兩組在高溫期結(jié)束時(shí)優(yōu)勢(shì)菌屬也有著顯著區(qū)別，Oceanobacillus、Sinibacillus、Thermobifida、unclassified_f_Bacillaceae和Gracilibacillus等在CT 中的相對(duì)豐度都高于NT 組。其中Thermobifida的相對(duì)豐度差別最大，在CT 組中為23.91%，遠(yuǎn)高于NT 組的0.98%，說(shuō)明延長(zhǎng)高溫時(shí)間有利于耐高溫的Thermobifida的明顯富集。Zhang 等[26]的堆肥研究中發(fā)現(xiàn)Thermobifida在高溫期中豐度增加了1.8倍。Halocella在兩組中的相對(duì)豐度也存在明顯差異，分別為0.67%和4.45%。Thermobacillus在NT 組中相對(duì)豐度為2.48%，但是在CT 組中只有0.29%，說(shuō)明延長(zhǎng)堆肥高溫期更有利于Halocella和Thermobacillus相對(duì)豐度的下降。在堆肥腐熟期結(jié)束時(shí)，CT 處理組中norank_f__Limnochordaceae和Thermobifida兩菌屬占比最大，分別為23.24%和21.14%。而NT 組中腐熟期結(jié)束時(shí)Moheibacter、Halomonas豐度出現(xiàn)明顯增長(zhǎng)，相對(duì)豐度占比分別為10.54%和5.31%，可以看出這兩種菌群在NT-腐熟期間再次出現(xiàn)了富集，說(shuō)明了延長(zhǎng)高溫持續(xù)時(shí)間的CT組對(duì)Moheibacter、Halomonas等常溫菌有較好的抑制效果。

圖5 兩處理組堆肥不同時(shí)期菌群在屬水平上的分布Figure 5 Genus-level community composition heatmap of two treatment groups at different periods

2.7 細(xì)菌群落與抗性基因的相關(guān)性分析

ARGs的變化更多地取決于潛在宿主細(xì)菌的動(dòng)態(tài)變化，確定堆肥過(guò)程中與ARGs 相關(guān)的潛在人類(lèi)致病菌變化也具有重要意義[27]。選擇豐度前三十的菌屬與大腸桿菌16S rRNA基因、MOBP，APH（3）-Ib、sul2以及intl1基因進(jìn)行相關(guān)性分析見(jiàn)圖6。氨基糖苷類(lèi)和磺胺類(lèi)抗生素是預(yù)防細(xì)菌感染和臨床中常用的抗生素類(lèi)型[28]，與磺胺類(lèi)耐藥基因sul2相關(guān)的菌屬有Pseudogracilibacillus、Aerosphaera、Sporosarcina等菌屬，該類(lèi)微生物隨著高溫持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)而得到了有效控制，CT 組四種菌屬的相對(duì)豐度均低于NT 組，分別相差0.36%、0.34%、0.041%，說(shuō)明sul2基因在NT 中的增長(zhǎng)與這些潛在宿主是直接相關(guān)的。氨基糖苷類(lèi)耐藥基因APH（3）-Ib也觀察到類(lèi)似的規(guī)律，與APH（3）-Ib基因相對(duì)豐度相關(guān)的菌屬有Lacobacillus、Corynebacterium、Thermobacillus，這些潛在宿主在CT 組中同樣得到顯著抑制，高溫期結(jié)束后這些菌屬的相對(duì)豐度NT 較CT 分別高出0.783%、0.749%、1.96%。與以上兩種垂直傳播的抗性基因不同，CT 組中與intl1顯著相關(guān)的Oceanbacillus、Gracebacillus、Saccharomonospora等3 個(gè)菌屬，在CT 和NT 最終堆肥產(chǎn)物中相對(duì)豐度組成特點(diǎn)各不相同，Oceanbacillus在NT中更多，Gracebacillus在兩個(gè)處理中基本沒(méi)有差異，而Saccaromonaspora在CT 組中更為豐富，可能原因是intl1為典型的基因水平轉(zhuǎn)移元件，分布更為廣泛，很難用單一或少數(shù)菌體的豐度增加或減少來(lái)關(guān)聯(lián)其潛在宿主。葡萄球菌是一種常見(jiàn)的病原菌，能夠引起各種類(lèi)型的炎癥[29]。Duan 等[30]發(fā)現(xiàn)葡萄球菌與tetX、ermX等ARGs和MGEs（intl1、ISCR1）顯著相關(guān)，可能是這些ARGs和MGEs 的宿主，控制這種細(xì)菌屬可能有助于抑制ARGs 的傳播。本次實(shí)驗(yàn)在CT 組中APH（3）-Ib和sul2相對(duì)豐度都與葡萄球菌屬（Staphylococcus）有關(guān)，且經(jīng)過(guò)延長(zhǎng)高溫后，葡萄球菌屬相對(duì)豐度明顯低于NT 組，說(shuō)明延長(zhǎng)高溫有利于減少APH（3）-Ib和sul2等ARGs 潛在病原菌宿主-葡萄球菌屬的相對(duì)豐度，有類(lèi)似規(guī)律的還有Pseudogracilibacillus、Corynebacterium、Atopostipes等，我們?cè)贑T 組腐熟過(guò)程中并未觀察到APH（3）-Ib和sul2等基因相對(duì)豐度的明顯反彈。因此，常規(guī)堆肥不足以完全消除通過(guò)雞糞中耐藥細(xì)菌和所攜帶的ARGs，適當(dāng)延長(zhǎng)高溫持續(xù)時(shí)間可以抑制堆肥高溫期后ARGs 相關(guān)細(xì)菌的生長(zhǎng)，這為有效抑制ARGs的腐熟期反彈提供了新思路。

3 結(jié)論

（1）延長(zhǎng)堆肥高溫時(shí)間（15 d）能夠減少堆肥產(chǎn)品中細(xì)菌總數(shù)兩個(gè)數(shù)量級(jí)以上，同時(shí)也可以抑制常規(guī)堆肥高溫結(jié)束后多重耐藥菌的反彈。

（2）堆肥對(duì)于多重耐藥大腸桿菌及其接合型耐藥質(zhì)粒有良好的消減效果，相對(duì)豐度消減率均達(dá)到99%以上；雖然能夠垂直傳播的APH（3）-Ib、sul2和intl1等ARGs 相對(duì)豐度會(huì)隨高溫期結(jié)束而出現(xiàn)增長(zhǎng)，但延長(zhǎng)高溫時(shí)間能夠提高堆肥過(guò)程中ARGs的消減率。

（3）堆肥中腸桿菌16S rRNA基因及其接合型質(zhì)粒代表基因MOBP消減規(guī)律符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程；但APH（3）-Ib、sul2和intl1等基因相對(duì)豐度的消減動(dòng)力學(xué)呈現(xiàn)高溫期下降、二次腐熟期上升的特點(diǎn)，延長(zhǎng)高溫時(shí)間能夠顯著抑制第二階段出現(xiàn)的反彈。

（4）延長(zhǎng)15 d 的高溫時(shí)間，可降低堆體中APH（3）-Ib、sul2基因的潛在宿主菌的豐度從而阻斷ARGs 垂直傳播作用，有利于減少最終堆肥產(chǎn)品中ARGs相對(duì)豐度。