9-羥基雄烯二酮藥物菌渣好氧堆肥無害化及安全利用

胡夢(mèng)娜，惠雪松，王港，劉惠玲*，戴曉虎

（1.同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092；2.煙臺(tái)大學(xué)環(huán)境與材料工程學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005）

作為內(nèi)分泌干擾物（EDCs）的大類強(qiáng)效物質(zhì)，甾體化合物能通過阻斷或模擬生物體本身的激素作用，在較低濃度下即可對(duì)生物體的內(nèi)分泌系統(tǒng)造成干擾，從而引發(fā)環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[1]。甾體類藥物更是被廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖、醫(yī)療保健等領(lǐng)域，在改善生物機(jī)體代謝、恢復(fù)和增強(qiáng)體力、調(diào)節(jié)免疫及性功能等方面可以起到重要作用[2]，是目前世界上僅次于抗生素的第二大類重要藥物，產(chǎn)量巨大且呈現(xiàn)逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，近年來逐漸在全球范圍引起人們的關(guān)注和重視[3]，我國(guó)也將甾體類藥物及其中間體的開發(fā)作為近期醫(yī)藥行業(yè)的重點(diǎn)發(fā)展方向之一[4-5]。9-羥基雄烯二酮（9α-OH-AD）是合成多種甾體類藥物的關(guān)鍵中間體[6]，采用微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)9α-OH-AD 時(shí)會(huì)伴隨產(chǎn)生大量固態(tài)發(fā)酵殘?jiān)?α-OH-AD菌渣。由于含有一定的甾體殘留，菌渣直接排放并累積后會(huì)引起環(huán)境濃度異常，進(jìn)而危害生物健康和生態(tài)安全[7]。同時(shí)，藥物菌渣一般具有營(yíng)養(yǎng)成分豐富的特點(diǎn)，這又使其在資源化利用上有較高的可行性和開發(fā)前景。因此，研究9α-OH-AD菌渣的無害化與資源化，對(duì)解決甾體生產(chǎn)所帶來的固廢管理和環(huán)境污染問題至關(guān)重要。

在不同固廢處理方法中，好氧堆肥可以在微生物作用下將有機(jī)固廢轉(zhuǎn)化為相對(duì)穩(wěn)定的腐殖質(zhì)，同時(shí)有效去除有害成分[8-10]，其堆肥產(chǎn)物經(jīng)過一定的處理后可用作土壤改良劑或有機(jī)肥以促進(jìn)作物生長(zhǎng)，被認(rèn)為是目前最有前景的藥物菌渣處理方法之一[11]。利用好氧堆肥技術(shù)對(duì)9α-OH-AD 菌渣進(jìn)行可持續(xù)、環(huán)境友好的無害化處理和資源化利用具有重要意義，但目前相關(guān)報(bào)道極少。

本文通過控制9α-OH-AD 菌渣好氧堆肥參數(shù)，討論不同初始條件的堆體在堆肥過程中的特征變化，從理化性質(zhì)、有機(jī)物特征、甾體殘留、微生物響應(yīng)等多方面分析菌渣的無害化和穩(wěn)定化情況及腐熟降解規(guī)律，以確定最佳的9α-OH-AD菌渣好氧堆肥工藝。此外，在土壤模擬實(shí)驗(yàn)中對(duì)比研究菌渣肥對(duì)土壤理化性質(zhì)、甾體殘留、土壤酶活及群落豐富度等方面的影響，分析9α-OH-AD 在土壤中的可能降解產(chǎn)物及降解機(jī)制，同時(shí)探討其對(duì)蚯蚓雌雄生殖系統(tǒng)的影響，以期為9α-OH-AD菌渣的肥料化和安全利用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用的9α-OH-AD 菌渣取自某生物制藥公司。使用直徑0.5～1.0 cm 秸稈作為調(diào)理劑，以提高堆體碳氮比和孔隙率。添加由功能各異的多種微生物組成的活菌制劑——EM菌（有效微生物菌群）以增加微生物多樣性，提高無害化效果。實(shí)驗(yàn)土壤取自江蘇郊區(qū)農(nóng)田，土樣陰干14 d 后過2 mm 篩去除石子和植物根系。蚯蚓選用正常發(fā)育的成年赤子愛勝蚓。實(shí)驗(yàn)所需其他化學(xué)品均購(gòu)自阿拉丁化工有限公司。各物料參數(shù)如表1所示。

表1 堆肥及土壤實(shí)驗(yàn)物料參數(shù)Table 1 Parameters of compost and soil experimental materials

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

1.2.1 好氧堆肥實(shí)驗(yàn)

控制初始堆體含水率為60%，堆肥裝置通風(fēng)速率為0.3 L·min-1·kg-1，維持氧氣濃度15%左右。堆體采用間歇式曝氣（堆肥初期2 h 開，1 h 關(guān)；堆肥后期1 h開，2 h關(guān)），以確保足夠的氧氣供應(yīng)，同時(shí)盡量減少熱量損失，實(shí)驗(yàn)裝置如圖1 所示。堆肥期間于發(fā)酵罐的上、中、下位置均勻取樣兩份，一份鮮樣保存于超低溫冰箱，另一份凍干后保存。研究表明，堆肥系統(tǒng)的初始碳氮比（C/N）應(yīng)盡量滿足微生物生長(zhǎng)代謝所需的元素及能量（C/N=10～30）[12]。考慮不同初始C/N 對(duì)堆肥結(jié)果的影響，共設(shè)置3組9α-OH-AD 菌渣好氧堆肥實(shí)驗(yàn)堆體（A、B、C），其初始C/N 分別為15（低）、20（中）、25（高），單堆質(zhì)量為3 050 g，將各堆肥物料混勻放入反應(yīng)器，具體如表2所示。

圖1 好氧堆肥實(shí)驗(yàn)裝置圖Figure 1 Aerobic composting experimental setup diagram

表2 堆肥實(shí)驗(yàn)物料投加情況Table 2 Application of composting test materials

1.2.2 土壤模擬實(shí)驗(yàn)

參照典型農(nóng)業(yè)施肥政策（30 t·hm-2）進(jìn)行施肥量設(shè)定[13-15]，共設(shè)置3個(gè)處理組（空白組、1%菌渣肥組、1%菌渣組），每組含3個(gè)平行裝置，每個(gè)裝置放置1 kg樣品，在25 ℃和60%相對(duì)濕度條件下培養(yǎng)，每2 d澆灌1次超純水以保持土壤含水率在10%左右。實(shí)驗(yàn)期間所取的每個(gè)樣品均分為兩份，一份鮮樣保存于超低溫冰箱，另一份凍干后保存。在相同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，每個(gè)土壤培養(yǎng)裝置中至少加入10條蚯蚓，容器表面用紗布覆蓋。蚯蚓于濕濾紙上靜置24 h排空內(nèi)臟后，取2條冷凍保存于超低溫冰箱，另取2條用10%福爾馬林溶液固定。

1.3 分析方法

取堆體上、中、下部位的溫度平均值為實(shí)際溫度，使用pH-EC 計(jì)測(cè)量pH 和電導(dǎo)率（EC）。含水率（MC，ωMC）、揮發(fā)性固體（VS，ωVS）和種子發(fā)芽指數(shù)（GI，I）分別用公式（1）、公式（2）和公式（3）計(jì)算。

式中：m1為空坩堝的質(zhì)量，g；m2為坩堝和樣品的總質(zhì)量，g；m3為坩堝和樣品在105 ℃下干燥后的總質(zhì)量，g；m4為坩堝和樣品在600 ℃下燒結(jié)后的總質(zhì)量，g；A1為浸出液中種子的發(fā)芽率，%；l1為浸出液中所有種子的平均根長(zhǎng)，cm；A2為水分中種子的發(fā)芽率，%；l2為水分中所有種子的平均根長(zhǎng)，cm。

使用三維熒光分析儀檢測(cè)樣品中水溶性有機(jī)物，高效液相色譜檢測(cè)菌渣中的甾體殘留，液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測(cè)土壤和蚯蚓中的甾體殘留，高分辨率質(zhì)譜分析9α-OH-AD 在土壤中的降解機(jī)制，通過16S基因測(cè)序檢測(cè)微生物群落。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

本研究使用Excel 2021 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，Origin 2023 繪制圖表。

2 結(jié)果與討論

2.1 9α-OH-AD菌渣好氧堆肥工藝參數(shù)的優(yōu)化

2.1.1 理化參數(shù)變化

溫度是反映好氧堆肥效率和有機(jī)物降解速度的關(guān)鍵因素[16]。如圖2（a）所示，3 組堆體的溫度變化顯示出了典型的堆肥階段，即升溫階段（0～2 d）、高溫階段（3～9 d）和降溫及腐熟階段（10～40 d）。較其他兩組而言，B 組堆體的升溫速度和高溫維持時(shí)間更佳，初始C/N 偏高或偏低的A、C 兩組的微生物活動(dòng)能力弱于B組，說明堆體碳源和氮源構(gòu)成的不合理會(huì)導(dǎo)致有機(jī)物分解不完全，削弱堆肥腐殖化效果。高溫階段3 組堆體的最高溫均在60 ℃以上，且堆體在50～65 ℃的高溫環(huán)境維持了7～8 d，符合堆肥標(biāo)準(zhǔn)（HJ 1266—2022）及前人經(jīng)驗(yàn)[17]。

圖2 好氧堆肥過程中各堆體理化參數(shù)變化Figure 2 Variation of physicochemical parameters during aerobic composting

過高的EC 會(huì)抑制種子發(fā)芽，通常認(rèn)為堆肥穩(wěn)定的EC為不超過3 mS·cm-1[18]。圖2（b）顯示了堆肥過程中EC 值的變化，EC 總體呈現(xiàn)先增后降最終趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。A、B、C 3 組堆體的初始EC 值分別為1.99、2.38 mS·cm-1和2.35 mS·cm-1。在堆肥前期，微生物對(duì)可溶性有機(jī)質(zhì)的消耗導(dǎo)致EC值略有下降。隨后，有機(jī)物被迅速降解為小分子有機(jī)酸和各種礦物鹽（、、）[12]，EC值增加并在高溫階段達(dá)到峰值。在降溫及腐熟階段，由于氨態(tài)氮的持續(xù)揮發(fā)，溶解性礦物鹽沉積，小分子有機(jī)酸和鹽離子轉(zhuǎn)化為腐植酸，EC 值有不同程度的下降[12]。堆肥40 d 時(shí)，A、B、C 3 組的EC值分別為3.17、2.69 mS·cm-1和2.97 mS·cm-1，后兩組符合堆肥標(biāo)準(zhǔn)。

好氧堆肥本質(zhì)上是有機(jī)物的降解和腐殖質(zhì)的合成，VS 是衡量成熟度的重要指標(biāo)[19]。如果忽略少量的可生物降解的有機(jī)物，VS 含量的變化一般可以反映出堆肥過程中有機(jī)質(zhì)的降解情況。如圖2（c）所示，在堆肥過程中，整體的VS含量逐漸減少。在升溫和高溫階段，大量易降解有機(jī)物被迅速降解。堆肥40 d 時(shí)，A、B 和C 3 組的VS 含量分別為70.8%、69.1%和70.7%，且B 組的VS 減少率相對(duì)較快，說明偏高或偏低的C/N 都不利于微生物的生長(zhǎng)和繁殖，會(huì)導(dǎo)致有機(jī)物的不完全分解。

堆肥樣品的植物毒性變化可以通過GI 直接觀察[12]。當(dāng)堆肥的GI 值大于80%時(shí)可認(rèn)為該有機(jī)肥完全腐熟且對(duì)植物無毒[20]。3組堆肥樣品種子培養(yǎng)所得GI 值變化情況如圖2（d）所示，總體表現(xiàn)為最初略有降低，然后逐漸增加并趨于平穩(wěn)。GI 值初期降低可能是由于氨的形成和揮發(fā)性脂肪酸的釋放在升溫階段抑制了種子發(fā)芽。到高溫階段，由于氨的固定揮發(fā)、有機(jī)物的降解和有毒化合物的消除，GI 值逐漸升至穩(wěn)定水平[18]。堆肥前樣品的GI 值在10%左右，堆肥后A、B、C 3 組的GI 值分別為80.8%、93.6% 和86.8%，表明適當(dāng)?shù)亩逊时壤瓤梢钥s短堆肥處理周期，也能加速消除植物毒性[21]。同時(shí)，比照EC 變化情況發(fā)現(xiàn)GI 值和EC 值之間呈反比關(guān)系。高EC 值會(huì)阻礙種子吸收水分，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和酶的分解和運(yùn)輸，抑制種子的活力[22]。

2.1.2 有機(jī)物變化

為研究好氧堆肥過程中溶解性有機(jī)物的蛋白質(zhì)和類腐殖質(zhì)含量、結(jié)構(gòu)和組成變化，對(duì)樣品進(jìn)行了三維熒光光譜特征檢測(cè)[23]。根據(jù)代表物質(zhì)種類的不同，將三維熒光光譜劃分為5 個(gè)區(qū)域（Ⅰ～Ⅴ），如表3 所示。根據(jù)圖3 結(jié)果可知，在堆肥過程中，Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)的熒光強(qiáng)度總體呈下降趨勢(shì)，說明酪氨酸類及色氨酸類的類蛋白物質(zhì)隨著時(shí)間的推移被逐漸降解，在堆肥腐熟階段幾乎消失；Ⅳ區(qū)的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，這是因?yàn)樵诙逊是捌冢ㄉ郎睾透邷仉A段）大量易降解有機(jī)質(zhì)被微生物降解為溶解性代謝物，之后（降溫及腐熟階段）有機(jī)質(zhì)降解速率減緩而溶解性代謝物逐漸被消耗；Ⅲ區(qū)和Ⅴ區(qū)的熒光強(qiáng)度整體上呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，代表用于表征腐殖質(zhì)含量的腐植酸（HAs）、富里酸（FAs）隨堆肥進(jìn)程逐漸增加，堆體有機(jī)質(zhì)逐漸腐熟穩(wěn)定。

圖3 好氧堆肥過程中各堆體水溶性有機(jī)物三維熒光光譜的變化Figure 3 Changes of 3D-EEM fluorescence spectra during aerobic composting

表3 三維熒光光譜分區(qū)Table 3 3D-EEM fluorescence integration zoning

2.1.3 堆體中9α-OH-AD的降解情況

堆內(nèi)甾體的殘留情況決定了好氧堆肥是否成功實(shí)現(xiàn)9α-OH-AD 菌渣的無害化，同時(shí)也是其堆肥產(chǎn)品能否被資源利用的關(guān)鍵指標(biāo)。堆肥前A、B、C 3組堆體的9α-OH-AD殘留水平分別為4 197.36、3 222.18 mg·kg-1和2 278.83 mg·kg-1（圖4），經(jīng)過80 d 的好氧堆肥，堆內(nèi)99.61%、99.94%、99.72%的甾體殘留被成功降解去除，其中B 組的降解率最高，堆內(nèi)最終的甾體殘留量最低（1.36 mg·kg-1）。通過9α-OH-AD 的降解趨勢(shì)可以發(fā)現(xiàn)，在堆肥0～2 d，甾體降解水平較為平緩，這可能是因?yàn)椴糠昼摅w在高含水率條件下被微生物轉(zhuǎn)化為游離態(tài)甾體。隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的推進(jìn)，堆肥進(jìn)入升溫和高溫階段，堆體內(nèi)的微生物活性得到較大的提升，大部分的9α-OH-AD 在這段時(shí)間被降解轉(zhuǎn)化，堆內(nèi)的甾體殘留量迅速下降，此階段的甾體降解速率達(dá)到較快水平。到了降溫及腐熟階段，堆體的溫度逐漸下降，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗殆盡，微生物活性也逐漸變低，此時(shí)的甾體降解速率趨于平緩，整個(gè)堆體物料水平也趨于穩(wěn)定。堆肥中9α-OH-AD 殘留的對(duì)數(shù)值與時(shí)間呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系（R2＞0.97），其降解過程遵循準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，A、B、C 3 組的半衰期（t1/2）分別為5.33、5.42 d 和4.50 d。結(jié)果表明，9α-OH-AD 菌渣中的甾體化合物可以通過好氧堆肥實(shí)現(xiàn)較好的降解。

圖4 好氧堆肥過程中各堆體9α-OH-AD降解情況Figure 4 Degradation of 9α-OH-AD during aerobic composting

2.1.4 微生物群落變化

使用α 多樣性表征堆肥過程中微生物群落豐度和多樣性變化情況（圖5），其統(tǒng)計(jì)分析指標(biāo)包括Chao、Shannoneven、Shannon 和Simpson[24-25]。Chao 可以用于描述微生物群落分布豐度，Chao 值越大，樣品微生物OTUs數(shù)目越多。3組堆體的Chao值整體呈先減后增的趨勢(shì)，堆肥前期A組微生物群落分布豐度波動(dòng)較大，C 組變化較小，而B 組在堆肥高溫階段微生物OTUs 數(shù)得到較大增長(zhǎng)，且在堆肥后期處于較高水平，考慮是較低或較高的C/N 對(duì)微生物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了抑制作用。群落分布多樣性通常使用Shannon 和Simpson衡量，群落分布多樣性越高，Shannon值越高，Simpson 值越低[24]。在高溫和腐熟階段，根據(jù)Shannon和Simpson 指數(shù)，B 組的群落多樣性高于其余兩組。且到堆肥末期B 組的群落均勻度（Shannoneven）也相應(yīng)最高。結(jié)果表明，初始C/N 為20 的好氧堆肥更適于微生物發(fā)育繁殖。

圖5 好氧堆肥過程中各堆體微生物的α多樣性Figure 5 Variation of α diversity of bacterial community index during aerobic composting

2.2 9α-OH-AD菌渣肥對(duì)土壤性質(zhì)的影響

2.2.1 9α-OH-AD菌渣肥的理化性質(zhì)

對(duì)比分析3 組堆肥產(chǎn)品（9α-OH-AD 菌渣肥）與有機(jī)肥標(biāo)準(zhǔn)品（NY/T 525—2021）和商業(yè)有機(jī)肥的技術(shù)指標(biāo)與限量指標(biāo)（表4）可以看出，3 組菌渣肥的各理化性質(zhì)均滿足有機(jī)肥的技術(shù)指標(biāo)要求，且部分指標(biāo)優(yōu)于商品肥，同時(shí)其甾體殘留量和常見重金屬含量均低于有機(jī)肥限量指標(biāo)要求，無重金屬污染風(fēng)險(xiǎn)。本結(jié)果一定程度上印證了菌渣的好氧堆肥產(chǎn)品有機(jī)肥料利用的潛力。

表4 有機(jī)肥技術(shù)和限量指標(biāo)分析Table 4 Analysis of organic fertilizer technical and limited indicator

2.2.2 土壤中9α-OH-AD的降解情況

選取堆肥效果最佳的B 組所得肥料進(jìn)行土壤模擬實(shí)驗(yàn)，研究施肥土壤中9α-OH-AD 的殘留情況，結(jié)果如表5 所示。隨著土壤模擬實(shí)驗(yàn)的推進(jìn)，不同處理組土壤中的9α-OH-AD 殘留量均呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)橥寥辣旧韺?duì)甾體化合物有一定的吸附及降解作用[26]。其中，菌渣組直到培養(yǎng)的第42 天仍檢出較多甾體殘留，這可能是過高的9α-OH-AD 初始含量破壞了原始土壤的內(nèi)環(huán)境，導(dǎo)致土壤本身的吸附及降解作用減弱，而菌渣肥組經(jīng)過7 d 的培養(yǎng)后，在第12 天已未檢出9α-OH-AD 殘留，說明未經(jīng)處理的菌渣直接施入土壤會(huì)對(duì)環(huán)境造成不利影響，合適比例（1%）的菌渣肥施入土壤后，土壤中的甾體殘留量會(huì)降至較低水平，對(duì)土壤環(huán)境的不利影響可控。

表5 不同處理組土壤中9α-OH-AD殘留量（μg·kg-1）Table 5 9α-OH-AD residues in the soil of the different treatment groups（μg·kg-1）

根據(jù)報(bào)道[27]和高分辨率質(zhì)譜分析結(jié)果，圖6 展示了9α-OH-AD 在施肥土壤中的降解機(jī)制及產(chǎn)物。9α-OH-AD 在微生物的作用下，遵循C9、C10 位閉環(huán)途徑進(jìn)行好氧降解，生成相關(guān)的不飽和中間體。通過質(zhì)譜分析確定出6 種9α-OH-AD 可能的降解產(chǎn)物。最初，9α-OH-AD（P1）脫氫形成雙鍵，轉(zhuǎn)化為9α-OH-ADD（P2）。然后，9α-OH-ADD 好氧發(fā)酵導(dǎo)致甾體母環(huán)中的b 環(huán)打開，甾體核發(fā)生自發(fā)的反醛醇型轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生酚類化合物HSA（P3）[27]。HSA 的轉(zhuǎn)化始于甾體母環(huán)上的C4原子的羥基化，隨后是甾體母環(huán)中的a環(huán)打開，羥基被氧化為羧基，酮基被取代。最后，由a環(huán)打開形成的長(zhǎng)鏈水解生成P6和P7。

圖6 9α-OH-AD在土壤中的降解機(jī)制及產(chǎn)物Figure 6 Degradation products and hypothetical mechanisms of 9α-OH-AD in the fertilized soil

2.2.3 菌渣肥對(duì)土壤性質(zhì)的影響

土壤pH 值和EC 值是土壤微生物群落豐度和多樣性的重要影響因素。如圖7（a）所示，在整個(gè)培養(yǎng)過程中，菌渣組和菌渣肥組的pH值低于空白組，呈現(xiàn)出先降后升的趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)初期，菌渣和菌渣肥中的有機(jī)物水解產(chǎn)生有機(jī)酸，之后在有機(jī)酸降解和土壤緩沖的作用下，pH 值回升并達(dá)到穩(wěn)定。3 組土壤最終pH值均大于5.5，對(duì)微生物種群沒有抑制作用[28]。如圖7（b）所示，空白組初始土壤EC值為0.17 mS·cm-1，在整個(gè)土壤培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中無較大變化。菌渣組和菌渣肥組的EC 值均呈微增-減-穩(wěn)態(tài)趨勢(shì)，但整體變化較小。實(shí)驗(yàn)?zāi)┢趯?shí)驗(yàn)組的土壤EC 值低于4 mS·cm-1，屬于非鹽堿地，土壤系統(tǒng)穩(wěn)定[29]。有機(jī)物是土壤養(yǎng)分的主要來源，且可以改善土壤的結(jié)構(gòu)特性[30-31]，氮是植物需求和固定最多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，可以提高土壤肥力[32]。如圖7（c）所示，菌渣肥組的有機(jī)質(zhì)含量顯著高于空白組，3 組土壤的有機(jī)質(zhì)含量隨著時(shí)間推移整體呈下降趨勢(shì)，大部分易降解有機(jī)物被微生物消耗利用[33]。如圖7（d）所示，含氮量在土壤微生物活動(dòng)和氮素?fù)]發(fā)的共同作用下于初期迅速下降后上升，然后逐漸降低并趨于穩(wěn)定。上述情況表明，9α-OH-AD 菌渣肥的添加對(duì)土壤肥效和微生物活性有積極影響。

圖7 9α-OH-AD菌渣肥對(duì)土壤性能的影響Figure 7 Effects of 9α-OH-AD fermentation residue fertilizer on soil properties

2.2.4 菌渣肥對(duì)土壤生物的影響

土壤酶活性可以較為準(zhǔn)確地反映土壤肥效及微生物代謝能力[34]。脲酶與蛋白酶在土壤環(huán)境碳氮組分的調(diào)理轉(zhuǎn)化中有重要作用，其活性越強(qiáng)，土壤含氮有機(jī)化合物的生物轉(zhuǎn)化率和有效氮含量越高，反映了土壤對(duì)氮源的轉(zhuǎn)化供應(yīng)能力和含氮物質(zhì)可能的礦化程度[35]。過氧化氫酶可以催化過氧化氫分解為氧和水，防止生物毒害[36-37]。磷酸酶可以將基質(zhì)去磷酸化，將有機(jī)磷水解為無機(jī)磷，可用于反映土壤的供磷能力[38-39]。如圖8所示，與空白組相比，菌渣組和菌渣肥組土壤的脲酶和蛋白酶活性先增后減，過氧化氫酶整體變化幅度較小，菌渣肥組的磷酸酶活性先增后減，而菌渣組先減后穩(wěn)，且菌渣肥組的酶活性高于空白組。本研究結(jié)果說明9α-OH-AD 菌渣肥可以在一定程度上提高土壤酶活性，進(jìn)而提升土壤的抗干擾能力和肥效。

圖8 土壤模擬實(shí)驗(yàn)中各組土壤酶活性的變化Figure 8 Changes in soil enzyme activity in the soil incubation experiment

圖9 顯示了3組土壤在門水平上的微生物群落共線性關(guān)系。結(jié)果表明，樣品的微生物群落主要組成包括變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria_Chloroplast）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、異常球菌-棲熱菌門（Deinococcus_Thermus）及其他未分類菌門（unclassified Bacteria），其中變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門為相對(duì)優(yōu)勢(shì)菌群。實(shí)驗(yàn)前后空白組的微生物群落組成及豐度變化較小，菌渣組的優(yōu)勢(shì)菌群變?yōu)榉啪€菌門、厚壁菌門、變形菌門，菌渣肥組的優(yōu)勢(shì)菌群則為變形菌門、放線菌門、厚壁菌門。兩實(shí)驗(yàn)組樣品中檢出的放線菌門和厚壁菌門相對(duì)豐度隨時(shí)間逐漸增加，有利于土壤甾體殘留的進(jìn)一步降解。

圖9 微生物群落結(jié)構(gòu)共線性關(guān)系圖Figure 9 Collinearity diagram of microbial community structure

由于日常生命活動(dòng)直接與土壤表面接觸，蚯蚓被視為識(shí)別污染的首選生物[40]。通過蚯蚓生物組織中甾體污染物水平檢測(cè)，可以確定菌渣肥實(shí)際可轉(zhuǎn)移到土壤生物體內(nèi)的甾體量，從而判斷其的土壤生物潛在毒性。在土培過程中，菌渣肥組的蚯蚓生長(zhǎng)和存活狀況良好，而菌渣組的蚯蚓有部分死亡。如表6 所示，菌渣組蚯蚓體內(nèi)的初始9α-OH-AD 殘留量是菌渣肥組的幾十倍，證明未經(jīng)處理的9α-OH-AD 菌渣直接排入環(huán)境會(huì)對(duì)蚯蚓等土壤生物造成負(fù)面影響。菌渣肥組蚯蚓在土培3 d 后未檢出甾體殘留，表明經(jīng)過土壤環(huán)境和生物降解吸收，菌渣肥轉(zhuǎn)入生物體的甾體量極少，其對(duì)土壤生物的影響可近似忽略。

表6 不同處理組蚯蚓體內(nèi)9α-OH-AD殘留量（μg·kg-1）Table 6 9α-OH-AD residues in the earthworm of the different treatment groups（μg·kg-1）

蚯蚓同時(shí)具有雄性和雌性生殖系統(tǒng)，這使其常被用于指示土壤環(huán)境安全和評(píng)價(jià)污染物對(duì)單一生物雌雄雙生殖系統(tǒng)的影響[41]。如圖10 所示，菌渣組培養(yǎng)的蚯蚓，成熟精子束減少、精子細(xì)胞分布紊亂，雌性生殖器官變形較為嚴(yán)重，成熟卵母細(xì)胞數(shù)量減少，說明9α-OH-AD 菌渣直接施于土壤中會(huì)損傷蚯蚓生殖器官。而菌渣肥組的蚯蚓生存良好，且精子形態(tài)和卵母細(xì)胞數(shù)量基本沒有變化，說明9α-OH-AD 菌渣肥基本不會(huì)對(duì)蚯蚓的生殖器官產(chǎn)生負(fù)面影響。研究結(jié)果表明，9α-OH-AD 菌渣堆肥產(chǎn)品（菌渣肥）的土壤施入行為對(duì)土生動(dòng)物內(nèi)分泌系統(tǒng)具有安全性。

圖10 菌渣肥對(duì)蚯蚓生殖系統(tǒng)的影響Figure 10 Effects of fertilizer on earthworm reproductive system

3 結(jié)論

初始碳氮比為20的9α-OH-AD 菌渣好氧堆肥的無害化及穩(wěn)定化效果最佳。在堆肥過程中，堆體微生物群落豐度增加，9α-OH-AD 得到有效降解，最高降解率為99.94%，其堆肥所得菌渣肥符合有機(jī)肥標(biāo)準(zhǔn)的基本要求。實(shí)驗(yàn)后期，在施入菌渣肥比例1%的處理組的土壤和蚯蚓中均未檢出甾體殘留。施肥后土壤的理化性質(zhì)、酶活性和微生物豐度得到改善，一定程度上提高了土壤肥效，且蚯蚓的雌雄生殖系統(tǒng)未受到明顯影響。9α-OH-AD 菌渣可以通過好氧堆肥實(shí)現(xiàn)無害化與資源化，其堆肥產(chǎn)品的土壤安全利用具有發(fā)展前景。