不同氮磷比對北洛河中藻類生長的影響

楊震，張會(huì)強(qiáng)，陳靜，趙榮娜，張淳，張秦銘，殷憲強(qiáng)，范曉騰

（1.陜西省環(huán)境監(jiān)測中心站，西安 710054；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

河流水體污染和富營養(yǎng)化是世界性的環(huán)境問題，水體中氮、磷等營養(yǎng)鹽濃度過高會(huì)引起水生生物異常生長和繁殖，并在一定的溫度、光照、水流等條件下容易暴發(fā)水華等，危害水域生態(tài)系統(tǒng)與人類健康[1-3]。其中，形成水華的主要浮游藻類為藍(lán)藻門的微囊藻（Microcystis）、顫藻（Oscillatoria）、平裂藻（Merismopedia）以及綠藻門和裸藻門的部分藻類等，其暴發(fā)性繁殖可以引起水色變化和水體污染，并在水面形成藻類漂浮現(xiàn)象[4]。相關(guān)研究表明，營養(yǎng)鹽過量輸入是引起河流水體富營養(yǎng)化的根本原因，氮、磷等營養(yǎng)鹽是河流初級生產(chǎn)力的物質(zhì)基礎(chǔ)與驅(qū)動(dòng)力[5-6]，而氮磷的質(zhì)量比也是影響藻類生長和群落結(jié)構(gòu)組成的重要因素[7-8]。通常認(rèn)為藻類生長的最佳氮磷比為16∶1，即Redfield比值[9-10]，若水體中氮磷比大于16∶1，則磷被認(rèn)為是藻類生長的限制性因素，反之，則氮被認(rèn)為是限制性因素。同時(shí)，由于水體中浮游藻類組成差異性，其生長所需的營養(yǎng)鹽比例也不相同[11]。針對不同河流情況，明確其藻類群落結(jié)構(gòu)、生長限制性因素及氮磷比特征，對于水體富營養(yǎng)化防控與治理具有重要的指導(dǎo)意義。

北洛河作為黃河的二級支流，是陜西省最長的河流，對引水灌溉、水力發(fā)電和漁業(yè)發(fā)展等有重要作用。根據(jù)《陜西省水功能區(qū)劃》，北洛河水質(zhì)目標(biāo)為Ⅲ類。然而，由于北洛河上游流域地形破碎，水土流失嚴(yán)重，面源和點(diǎn)源氮磷污染量較大[12-13]，以及中下游流域內(nèi)梯級小水電站的開發(fā)改變了河流的天然屬性與水文情勢，水中營養(yǎng)鹽堆積后可能引起藻類季節(jié)性泛濫生長、誘發(fā)水華等水體富營養(yǎng)化問題，影響河流生態(tài)系統(tǒng)健康。通過前期調(diào)查發(fā)現(xiàn)，北洛河水質(zhì)指標(biāo)中總氮水平普遍大幅超標(biāo)、而總磷水平較低，歷年氮磷比的平均值均高于30，總體處于“磷限制”狀態(tài)，且水體中藻類以綠藻門、藍(lán)藻門和硅藻門等為主，推測總磷水平的波動(dòng)可能是影響北洛河中藻類暴發(fā)、群落結(jié)構(gòu)變化及水華分布范圍的限制性因素。

為進(jìn)一步明確外源磷輸入水平與氮磷比變化對北洛河水體富營養(yǎng)化的綜合影響，本研究使用北洛河代表性水體進(jìn)行藻類培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，通過添加不同濃度的磷酸鹽以調(diào)整總磷水平及氮磷比，分析藻類生長情況與物種多樣性變化，從而確定北洛河中藻類群落特征與營養(yǎng)鹽水平的相關(guān)性以及磷風(fēng)險(xiǎn)閾值范圍，以期為河流富營養(yǎng)化的成因分析與控制策略研究提供基礎(chǔ)資料與科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在北洛河的下桃水電站（35°27'17″N，109°27'47″E）壩上水庫采集水樣，分裝于500 mL 的錐形瓶中，通過添加磷酸二氫鉀提高水體中總磷濃度、調(diào)整氮磷比。實(shí)驗(yàn)設(shè)置的總磷濃度見表1，每個(gè)處理濃度分別設(shè)置3 個(gè)平行組，于藻類培養(yǎng)箱中進(jìn)行為期5 d的藻類培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，設(shè)定培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度為50 μmol·m-2·s-1，光暗比為12 h∶12 h。

表1 各培養(yǎng)體系中總磷濃度與氮磷比Table 1 Total phosphorus concentrations and N/P ratios in different groups

1.2 藻類計(jì)數(shù)與多樣性分析

根據(jù)《內(nèi)陸水域浮游植物監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》（SL 733—2016）的規(guī)定，采用顯微計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)藻類豐度變化。使用移液器將混勻液體注入0.1 mL 的細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)框中，在光學(xué)顯微鏡下觀察浮游藻類的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，并鑒定種類、數(shù)量，計(jì)算藻類細(xì)胞密度，確定優(yōu)勢種。每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3 次，每次計(jì)數(shù)結(jié)果與平均值的誤差應(yīng)小于15%，否則進(jìn)行第4次計(jì)數(shù)。

采用物種豐富度指數(shù)（Margalef richness index，D'）、香農(nóng)-威納多樣性指數(shù)（Shannon-Wiener diversity index，H）、辛普森優(yōu)勢度指數(shù)（Simpson dominance index，D）和均勻度指數(shù)（Pielou evenness's index，J），分析藻類種類與數(shù)量的多樣性。計(jì)算公式如下：

式中：Pi=Ni/N，Ni表示第i種物種的個(gè)體數(shù)，N表示樣品的總個(gè)體數(shù)；S表示樣品的種類總數(shù)。

1.3 水體中總氮和總磷的測定

將各培養(yǎng)體系的水樣經(jīng)0.45μm 濾膜過濾后，加入硫酸酸化處理，總氮的測定依據(jù)《水質(zhì)總氮的測定堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法》（HJ 636—2012），總磷的測定依據(jù)《水質(zhì)總磷的測定鉬酸銨分光光度法》（GB 11893—1989），使用紫外分光光度計(jì)測定OD 值，通過制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總氮和總磷的濃度。根據(jù)初始水樣和結(jié)束水樣中氮磷濃度，計(jì)算得到藻類所吸收的氮磷的量與氮磷質(zhì)量比。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2016進(jìn)行整理，采用SPSS Statistics 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），確定各組間統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)的顯著性差異（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮磷比對藻類豐度的影響

不同氮磷比條件下水中藻類的生長情況如表2所示，實(shí)驗(yàn)共檢出浮游藻類4門31屬。根據(jù)藻類密度的相對豐度，依次為：藍(lán)藻門8 屬（顫藻、節(jié)旋藻、螺旋藻、尖頭藻、平裂藻、鞘絲藻、偽魚腥藻、微囊藻），綠藻門15 屬（多芒藻、弓形藻、惠氏藻、集星藻、空星藻、卵囊藻、盤星藻、十字藻、柵藻、四角藻、新月藻、纖維藻、小球藻、四星藻、蹄形藻），硅藻門7 屬（繭形藻、脆桿藻、小環(huán)藻、星桿藻、針桿藻、直鏈藻、舟形藻）和裸藻門1 屬（裸藻）。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，藻類細(xì)胞密度先隨著磷濃度升高而逐漸上升，在0.40 mg·L-1磷濃度（即總氮磷比=7.4）組中藻類細(xì)胞豐度最高，隨后在更高磷濃度（0.45、0.50 mg·L-1）組中細(xì)胞密度又有所下降。

表2 各培養(yǎng)體系中藻類細(xì)胞數(shù)量（萬個(gè)·L-1）Table 2 Count of algae in different groups（×104·L-1）

通過對不同類型的藻類細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，隨著外源磷輸入量的增加（即氮磷比的下降），中營養(yǎng)型水體的代表藻類——硅藻門比例逐漸降低，富營養(yǎng)型水體的代表藻類——藍(lán)藻門和綠藻門逐漸成為優(yōu)勢類群（圖1）。其中，藍(lán)藻門的微囊藻屬、平裂藻屬和綠藻門的柵藻屬、十字藻屬、惠氏藻屬的占比相對較高，并隨著總磷濃度的升高而加快繁殖，藻類細(xì)胞豐度與各培養(yǎng)體系中總磷濃度呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)性（圖2）。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)在初始磷濃度的培養(yǎng)體系中，藍(lán)藻門的微囊藻屬和平裂藻屬占比達(dá)到23.8%和15.2%，并且最高占比分別達(dá)到了32.0%和37.2%，說明其為北洛河水體中的優(yōu)勢藻類。

圖1 各培養(yǎng)體系中藻類的相對比例Figure 1 Relative ratio of algae in different groups

圖2 各培養(yǎng)體系中藻類的相對密度（lg值）Figure 2 Relative density of algae in different groups（lg）

2.2 藻類生物多樣性的變化

通過對藻類群落組成進(jìn)行多樣性分析發(fā)現(xiàn)（圖3），外源磷輸入后，藻類豐富度指數(shù)顯著升高，而Shannon 多樣性指數(shù)、Simpson 優(yōu)勢度指數(shù)、Pielou 均勻度指數(shù)均發(fā)生不同程度的下降。整體而言，在總磷濃度≥0.10 mg·L-1時(shí)，北洛河水體中優(yōu)勢藻類暴發(fā)性生長，導(dǎo)致藻類的物種多樣性、優(yōu)勢度、均勻度等顯著下降（P＜0.05）。

圖3 各培養(yǎng)體系中藻類的多樣性Figure 3 Species diversity analyses of algae in different groups

2.3 水體中氮磷的消耗情況

在藻類培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對水樣中氮磷的殘留濃度進(jìn)行測定，各培養(yǎng)體系中氮磷的吸收與剩余情況見表3 和圖4、圖5。通過計(jì)算得出藻類所吸收的氮磷比，隨著外源磷輸入量的增加，水體中總氮的消耗量逐漸增加，反映出藻類對氮素的利用率增強(qiáng)。磷濃度≥0.10 mg·L-1時(shí)（即吸收氮磷比≤24.81）明顯促進(jìn)了藻類對水體中氮的吸收；而總磷濃度≥0.20 mg·L-1時(shí)（即吸收氮磷比≤12.80），各個(gè)培養(yǎng)體系中總氮的吸收量基本持平，說明磷對藻類生長的限制作用開始減弱。通常認(rèn)為藻類細(xì)胞按一定比例吸收氮磷營養(yǎng)鹽，本研究中藻類吸收的氮磷比隨著磷輸入量的增加而逐漸平穩(wěn)，進(jìn)一步反映出培養(yǎng)體系中藻類群落結(jié)構(gòu)多樣性下降，優(yōu)勢藻種占據(jù)主導(dǎo)地位。

圖4 各培養(yǎng)體系中總氮的吸收情況Figure 4 Uptake of total nitrogen in different groups

表3 各培養(yǎng)體系中氮磷的吸收與剩余情況Table 3 Uptake and residual concentrations of total nitrogen and total phosphorus in different groups

3 討論

浮游植物（藻類）作為河流水質(zhì)狀態(tài)與生態(tài)健康的重要指示生物，其種類、數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)受環(huán)境因子如溫度、光照、營養(yǎng)鹽水平等影響。其中，氮、磷等營養(yǎng)元素是浮游藻類生長的必需營養(yǎng)物質(zhì)，其濃度的升高常會(huì)導(dǎo)致藻類的暴發(fā)性生長，是水體富營養(yǎng)化的主要因素。一般認(rèn)為，當(dāng)水體中總氮濃度大于0.2 mg·L-1、總磷濃度大于0.02 mg·L-1時(shí)，水體就處于富營養(yǎng)化狀態(tài)[14]。除了氮磷的絕對濃度外，氮磷比的變化也會(huì)明顯改變水體中營養(yǎng)鹽的限制狀態(tài)，對藻類生長及群落結(jié)構(gòu)演替具有重要影響。本研究中各培養(yǎng)體系的藻類豐度與總磷濃度具有一定的正相關(guān)關(guān)系，并表現(xiàn)出低濃度磷與中濃度磷促進(jìn)、高濃度磷抑制的特性，這與銅綠微囊藻的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[15-16]。當(dāng)?shù)妆刃∮?0 時(shí)，普遍認(rèn)為水體中藻類生長處于氮限制狀態(tài)；當(dāng)?shù)妆却笥?2.6 時(shí)，認(rèn)為其處于磷限制狀態(tài)；當(dāng)?shù)妆冉橛?0～22.6 時(shí)，為藻類的最適生長區(qū)間[8]。對北洛河初始水樣進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，總氮背景值為2.94 mg·L-1，氮磷比達(dá)到147.0，藻類生長處于明顯的磷缺乏狀態(tài)。由于磷也是浮游藻類生長的首要限制性元素[17]，外源磷的補(bǔ)充大幅提升了培養(yǎng)體系中藻類的生長速度；當(dāng)總磷濃度為0.10～0.40 mg·L-1時(shí)，氮磷比介于7.4～29.4 之間，藻類處于最適生長區(qū)間，開始暴發(fā)性生長，其細(xì)胞豐度顯著升高；而隨著總磷濃度升至0.45、0.50 mg·L-1（氮磷比小于7.0），即轉(zhuǎn)換為氮限制狀態(tài)，藻類的進(jìn)一步生長受到了抑制，可能是由于培養(yǎng)體系中藻類可有效利用的無機(jī)氮含量不足，導(dǎo)致細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成過程受到了影響。相關(guān)研究同樣指出，水體中無機(jī)磷濃度超過藻類實(shí)際需求量時(shí)，藻類的物質(zhì)成分如葉綠素a 含量會(huì)發(fā)生變化，進(jìn)而生長受到限制[18-19]。此外，不同氮磷濃度的水體中有機(jī)態(tài)和無機(jī)態(tài)氮磷會(huì)發(fā)生賦存形態(tài)變化與生物或非生物轉(zhuǎn)化過程，其水平波動(dòng)對藻類生長的影響機(jī)制仍有待深入研究。

不同藻類細(xì)胞的元素組成與營養(yǎng)需求存在差異，環(huán)境也會(huì)優(yōu)先選擇相適應(yīng)的藻類而形成適者生存的特征藻類結(jié)構(gòu)[7，20]。通過對藻類群落進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，受總磷水平的影響，北洛河的藻類特征表現(xiàn)為藍(lán)藻門的微囊藻、平裂藻和綠藻門的十字藻、柵藻、惠氏藻為優(yōu)勢種屬，且其豐度與總磷水平呈正相關(guān)，外源磷的輸入逐漸降低了藻類群落的物種多樣性、優(yōu)勢度和均勻度。而藻類的種類組成、豐度與群落結(jié)構(gòu)直接關(guān)系水體水質(zhì)、生物能量與物質(zhì)交換，對水域生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性具有重要作用[21]。由此說明，外源磷輸入可引起北洛河中藍(lán)藻門和綠藻門等耐污型藻類占據(jù)優(yōu)勢，破壞藻類的多樣性，進(jìn)而降低水體自凈能力、加劇水質(zhì)惡化。另外，水體富營養(yǎng)化引起的藍(lán)藻和綠藻暴發(fā)極易導(dǎo)致水華的產(chǎn)生，特別是藍(lán)藻水華往往發(fā)生范圍最廣、危害最大[22-23]。如藍(lán)藻門中的微囊藻屬產(chǎn)生的微囊藻毒素已被證明具有強(qiáng)烈的生物毒性，可通過吸收、遷移、轉(zhuǎn)化等多種途徑危害水生生物及人類健康[24-26]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，隨著總磷輸入量的增加，微囊藻的豐度迅速增加，在0.40 mg·L-1磷濃度組中占比最高，達(dá)到了32.0%，從而指出北洛河水體富營養(yǎng)化存在藍(lán)藻水華泛濫的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

根據(jù)資源競爭模型，限制性營養(yǎng)元素的比例是藻類組成的主要決定因素，不同的營養(yǎng)限制有利于形成不同的優(yōu)勢藻種[27-28]。本研究結(jié)果顯示，藍(lán)藻門的平裂藻在較高磷濃度（低氮磷比）組中豐度最高，通常是因?yàn)榇蟛糠址N類藍(lán)藻對氮的競爭能力較強(qiáng)，而容易在低氮磷比引起的氮缺乏條件下形成優(yōu)勢[29]。而對于缺乏固氮能力的藍(lán)藻門中的微囊藻而言，氮磷的絕對濃度對其生長影響更大，其易在較高氮磷比條件下發(fā)展為優(yōu)勢藻種。另外，由于藍(lán)藻生長所需氮磷濃度常低于綠藻，在較低氮磷濃度條件下易形成優(yōu)勢；而在營養(yǎng)鹽相對充足的情況下，綠藻門的十字藻和柵藻等生長速率開始高于藍(lán)藻[30-31]，逐漸成為另一優(yōu)勢種屬。本研究指出，對于河流富營養(yǎng)化情況分析，應(yīng)結(jié)合浮游藻類的群落特征與優(yōu)勢藻種的營養(yǎng)需求動(dòng)態(tài)，綜合考慮氮磷營養(yǎng)鹽的絕對濃度與氮磷比來判別不同類型水華暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而在水體富營養(yǎng)化防控與治理過程中采取有效措施。

4 結(jié)論

（1）北洛河藻類培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)共檢出浮游藻類4門31屬，其中藍(lán)藻門的微囊藻、平裂藻和綠藻門的十字藻、柵藻、惠氏藻為北洛河中優(yōu)勢種屬。

（2）藻類的生長與總磷水平呈現(xiàn)出一定的正相關(guān)關(guān)系，低濃度磷與中濃度磷促進(jìn)藻類生長，高濃度磷抑制藻類生長，在0.40 mg·L-1磷濃度下藻類細(xì)胞豐度最高。

（3）當(dāng)水體中總磷濃度≥0.10 mg·L-1時(shí)，外源磷輸入顯著促進(jìn)了藻類對總氮的吸收利用，進(jìn)而降低了藻類群落的多樣性指數(shù)、優(yōu)勢度指數(shù)以及均勻度指數(shù)。