銻污染土壤中添加蚯蚓對油菜生長及土壤特性的影響

白婧，劉宏輝，盧丹，農(nóng)州，馬江濤，陳琳玉，鄭玉，向國紅，段仁燕*

（1.湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南 婁底 417000；2.湘中特色農(nóng)業(yè)資源開發(fā)利用與質(zhì)量安全控制湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 婁底 417000）

銻（Sb）是一種稀有且不可再生的有色金屬元素，具有冷脹熱縮的獨(dú)特屬性，位列我國四大戰(zhàn)略資源之首[1]。我國銻儲量和產(chǎn)量均位居世界第一，銻礦主要分布在湖南、廣西、西藏、貴州、云南等地區(qū)。長期以來銻礦開采、冶煉和廢棄礦渣的無序堆置，導(dǎo)致我國土壤、水體和大氣中的銻濃度持續(xù)升高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，“世界銻都”錫礦山地區(qū)受重金屬污染耕地面積共有2 054.9 hm2，其中已不再適合作為耕地利用的重度污染土壤面積達(dá)1 112.3 hm2，銻污染成為備受人們關(guān)注的環(huán)境問題[2-3]。銻作為一種具有長距離傳輸特點(diǎn)的全球性污染物，可在陸地生態(tài)系統(tǒng)中富集和傳遞，并通過食物鏈在人體內(nèi)積累，最終影響蛋白質(zhì)及糖的代謝，損害肝臟、心臟、呼吸和神經(jīng)系統(tǒng)[4]。本課題組調(diào)查發(fā)現(xiàn)錫礦山礦區(qū)72.64%的土壤樣點(diǎn)具有極高生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，農(nóng)田土壤樣點(diǎn)銻含量高達(dá)2 124.00 mg·kg-1，遠(yuǎn)超世界衛(wèi)生組織建議接受土壤中銻的最大允許污染物含量（36 mg·kg-1）[5]。礦區(qū)周邊水體銻質(zhì)量濃度平均達(dá)到10.51μg·L-1[6]。因此，針對銻污染研發(fā)對應(yīng)的修復(fù)技術(shù)對于保障銻污染農(nóng)田的安全生產(chǎn)和利用具有重要意義。

油菜（Brassica napusL.）是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，主要種植區(qū)域集中于長江流域，與銻礦主要分布地區(qū)重合。油菜生物量大、根系發(fā)達(dá)，對重金屬脅迫有一定耐性，地上部組織可累積較多含量的重金屬，被稱為是重金屬累積植物[7]。諸多研究表明油菜具有修復(fù)土壤重金屬鎘和鉛污染的能力[8-9]。相比于根、莖、葉，籽粒中重金屬富集量較低，地上部富積量高于地下部，機(jī)械化收割時(shí)即可實(shí)現(xiàn)邊修復(fù)邊生產(chǎn)[10-11]。因此，探究油菜對銻污染農(nóng)田的修復(fù)潛力對推廣植物修復(fù)技術(shù)具有應(yīng)用價(jià)值。

蚯蚓被譽(yù)為陸地生態(tài)系統(tǒng)“工程師”，其活動能顯著影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的物理、化學(xué)、生物學(xué)性質(zhì)，從而改變植物生長的生態(tài)環(huán)境，增強(qiáng)土壤微生物活性，影響土壤有機(jī)物轉(zhuǎn)化，為污染土壤生態(tài)修復(fù)提供良好的環(huán)境條件[12]。此外，蚯蚓對重金屬脅迫具有較高的耐性，在受重金屬污染土壤中可存活和再生繁殖，這是其應(yīng)用于植物-動物聯(lián)合修復(fù)污染土壤的基本前提[13]。研究表明，蚯蚓通過影響微生物和酶活性、微生物群落結(jié)構(gòu)，降低了鉻、鉛、鎳、鎘和銅等多種重金屬的生物有效性，強(qiáng)化了重金屬修復(fù)的去除效果[14-15]。銻污染情況下，蚯蚓對油菜積累銻的影響機(jī)制研究還鮮見報(bào)道。

本文通過探究赤子愛勝蚓（Eisenia fetidaSavigny，E.fetida）對油菜富集銻能力的影響效應(yīng)，在分析銻脅迫下土壤酶活性、細(xì)菌群落多樣性和結(jié)構(gòu)響應(yīng)的基礎(chǔ)上，探究蚯蚓-油菜復(fù)合體系對土壤銻污染的修復(fù)潛力，為開發(fā)動物-植物聯(lián)合修復(fù)重金屬污染土壤技術(shù)提供支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自湖南人文科技學(xué)院九耳校外基地（27°46'26.96″N，112°01'30.30″E），土樣經(jīng)自然風(fēng)干、搗碎、剔除雜質(zhì)，過2 mm 尼龍篩后備用。土壤pH為7.28，有機(jī)質(zhì)為22.34 g·kg-1，全氮為1.27 g·kg-1，堿解氮為128.53 mg·kg-1，全磷為0.96 g·kg-1，速效磷為43.63 mg·kg-1，全鉀為15.79 g·kg-1，速效鉀為185.15 mg·kg-1，銻為33.57 mg·kg-1。

供試蚯蚓品種為赤子愛勝蚓，購買于江蘇省句容市王軍蚯蚓養(yǎng)殖場。選用同一批次繁殖的赤子愛勝蚓作為受試生物，蚯蚓在供試土壤中馴化2 周。選取個(gè)體相似、體色鮮亮，有明顯生殖環(huán)的蚯蚓于室溫下清腸24 h后用于試驗(yàn)。

供試油菜品種為甘藍(lán)型雜交油菜南油雜1 號和灃油958，由婁底市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供，兩品種油菜在前期大田和室內(nèi)篩選試驗(yàn)中表現(xiàn)出較強(qiáng)的銻富集能力。

半水酒石酸銻鉀[C4H4KO7Sb·1/2H2O，Sb（Ⅲ）]，分析純，生產(chǎn)廠家為西隴科學(xué)有限公司。試驗(yàn)過程中所用的其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，共設(shè)6個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。銻濃度和油菜品種的設(shè)置均根據(jù)課題組前期在銻礦區(qū)調(diào)查結(jié)果以及室內(nèi)品種篩選試驗(yàn)確定。油菜南油雜1號和灃油958對銻均具有較高的抗性，銻含量達(dá)到2 000 mg·kg-1時(shí)，未對其生長產(chǎn)生明顯抑制。

表1 試驗(yàn)處理樣品設(shè)計(jì)Table 1 Test treatment sample design

1.3 試驗(yàn)方法

準(zhǔn)確稱取1.8 kg 土壤至于花盆（12 cm×14 cm，直徑×深度）中。在播種前半個(gè)月將配好的半水合酒石酸銻鉀水溶液隨水施入土壤中充分混合，土壤平衡老化14 d。播種時(shí)將土壤再次拌勻，防止銻在土壤中分布不均，定期澆水，保持土壤含水量為田間持水量的60%～70%。油菜種子于2021 年10 月2 日播種，每盆點(diǎn)播10粒種子，播種深度3 cm，每盆放入赤子愛蚯蚓20 條，定期觀測油菜苗生長情況。于2021 年11月17日破盆取樣，測定作物的生理指標(biāo)（株高、生物量），從盆栽土壤的10～30 cm土層選取帶有完整根系的土塊，輕輕抖落土壤，緊附在根系表面且不易被抖落的土壤即為根際土壤。再去掉土壤中的根系和小石塊，一部分過篩至2 mm，一部分裝于無菌封口袋中，冰上放置帶回實(shí)驗(yàn)室后保存在-80 ℃冰箱中。

1.4 測定指標(biāo)和方法

1.4.1 生長指標(biāo)

每個(gè)處理取3 株油菜苗，用蒸餾水洗凈，吸水紙吸干，裝袋后于烘箱105 ℃殺青30 min，然后65 ℃烘干至質(zhì)量恒定，取平均值記作干質(zhì)量。

1.4.2 銻含量測定

土壤樣品置于室內(nèi)經(jīng)自然風(fēng)干、除雜后過100 目尼龍網(wǎng)篩，裝入聚乙烯密封袋中4 ℃密封保存?zhèn)溆?。油菜用自來水將表面的泥土沖洗干凈，再用去離子水反復(fù)清洗后置于室內(nèi)自然晾干。重金屬銻含量用原子熒光光度計(jì)（型號：AFS-2100）測定，檢測限值為0.01 mg·kg-1。設(shè)置質(zhì)量控制、空白控制和標(biāo)準(zhǔn)參考土壤（GBW07407，中國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)檢定中心）。質(zhì)量控制樣品的回收率在92%～108%之間，平行樣品的偏差在10%以內(nèi)。

富集系數(shù)（BCF）為植株體內(nèi)總銻含量與相對應(yīng)的土壤中銻含量之比，表示植物從土壤中吸收和富集銻的能力。

1.4.3 土壤養(yǎng)分的測定

土壤pH 采用電極法測定，全氮采用凱氏定氮法測定，全磷采用鉬銻抗比色法測定，全鉀采用原子吸收分光光度法測定，堿解氮采用擴(kuò)散法測定，速效磷采用NaHCO3提取法測定，速效鉀采用NH4Ac 火焰光度法測定，有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀容量法（外加熱法）測定，具體方法參照《土壤農(nóng)化分析》[16]。

1.4.4 土壤酶活性測定

蔗糖酶（IN）活性采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定，脲酶（UE）活性采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定，中性磷酸酶（NP）活性采用磷酸苯二鈉比色法測定，過氧化氫酶（CAT）活性采用紫外分光光度法測定。土壤酶活性測定試劑盒由蘇州科銘生物科技有限公司提供。

1.4.5 微生物多樣性測定

利用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 提取根際土壤總DNA，使用Nanodrop 對DNA 進(jìn)行定量檢測。利用338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'和806R：5' - GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3' 對16S rRNA 的V3～V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后，送至上海派森諾生物科技股份有限公司的Illumina MiSeq平臺進(jìn)行高通量測序。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 23.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，不同處理之間采用單因素方差分析（P＜0.05）和方差齊性檢驗(yàn)。使用QIIME 軟件和R軟件分析土壤微生物多樣性，利用分類操作單元（OTU）表計(jì)算根際土壤微生物群落的α 多樣性分析指數(shù)。利用GraphPad Prism 8 制圖，Origin 2019b 進(jìn)行主成分分析（PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 蚯蚓對油菜生物量及富集銻能力的影響

添加蚯蚓使油菜的生物量和銻含量均顯著增加（表2）。與空白對照（N、F）相比，添加銻（NSb 和FSb）處理的油菜干質(zhì)量均顯著下降（P＜0.05）。加入蚯蚓（NESb 和FESb）處理中的油菜干質(zhì)量較未加蚯蚓（NSb 和FSb）處理顯著提高（P＜0.05），分別增加了59.84%和81.25%。NSb 處理中油菜對銻的平均吸收量顯著高于FSb 處理（P＜0.05），但兩處理富集系數(shù)之間無顯著差異。添加蚯蚓處理中油菜對銻的吸收量均分別高于相對應(yīng)的未添加蚯蚓處理，NESb 處理中南油雜1號對銻的平均吸收量達(dá)到358.30 mg·kg-1，顯著高于其他處理（P＜0.05），富集系數(shù)也呈現(xiàn)同一趨勢。結(jié)果表明，油菜品種南油雜1 號對銻的富集能力要高于灃油958，蚯蚓可以提高油菜的生物量以及銻的富集量。

表2 不同處理的油菜生物量及其對銻的富集能力Table 2 Biomass and enrichment coefficient of oilseed varieties under different treatments

2.2 蚯蚓和油菜對銻污染土壤理化性質(zhì)和酶活性的影響

由表3可知，根際土pH 范圍為7.96～8.45，呈弱堿性，其中FESb 處理的pH 最大，顯著高于其余各處理（P＜0.05）。NSb和FSb處理中土壤全鉀和速效鉀含量顯著高于對照處理（P＜0.05）。培養(yǎng)周期內(nèi)，蚯蚓的加入（NESb 和FESb）提高了有機(jī)質(zhì)、全磷、速效鉀的含量，有機(jī)質(zhì)含量分別達(dá)到28.36 g·kg-1和28.14 g·kg-1，顯著高于未加蚯蚓處理，但兩個(gè)油菜品種間差異不顯著（P＞0.05）。

表3 不同處理油菜根際土壤的理化性質(zhì)Table 3 Physicochemical properties of oilseed rhizosphere soil under different treatments

如圖1 所示，銻和蚯蚓對油菜根際土壤的過氧化氫酶、蔗糖酶、中性磷酸酶、脲酶活性影響作用有差異。添加銻后，NSb、FSb 處理中土壤過氧化氫酶、蔗糖酶（除FSb 處理）和脲酶活性顯著降低（P＜0.05），NSb 處理中的中性磷酸酶活性較N 處理增加了2%，兩者之間差異不顯著（P＞0.05）。蚯蚓顯著提高了兩種油菜根際土壤中的過氧化氫酶、蔗糖酶和脲酶活性（P＜0.05），最大激活率分別為13%～31%、15%～48%和24%～44%。

圖1 蚯蚓和油菜對銻污染土壤過氧化氫酶、蔗糖酶、中性磷酸酶、脲酶活性的影響Figure 1 Effects of earthworm and oilseed on catalase，invertase，neutral phosphatase，and urease activity in antimony contaminated soil

通過冗余分析探究土壤酶和土壤理化性質(zhì)間的關(guān)系，結(jié)果見圖2。第一軸解釋了所有信息的53.57%，第二軸解釋了26.66%，累計(jì)解釋信息量為80.23%。土壤酶活性與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系主要由第一軸決定，全磷、全氮、堿解氮是影響土壤酶活性變化的重要因子。未添加蚯蚓的處理（N、NSb、FSb）主要分布在RDA1 負(fù)方向，添加蚯蚓的處理分布在RDA1 正方向。中性磷酸酶和過氧化氫酶位于第一象限，與全磷、全氮和pH 方向相同且夾角較小，均呈正相關(guān)關(guān)系，與土壤中銻含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。脲酶和蔗糖酶位于第四象限，與有機(jī)質(zhì)、堿解氮、富集系數(shù)方向相同，呈正相關(guān)關(guān)系。

圖2 土壤酶活性與環(huán)境因子的冗余分析Figure 2 Redundancy analysis for environmental factors associated with soil enzymatic activities

2.3 蚯蚓和油菜對銻污染根際土壤細(xì)菌群落多樣性的影響

2.3.1 樣品中所含OUT數(shù)目分析

以97%相似性水平劃分標(biāo)準(zhǔn)OTUs，對6 組處理獨(dú)有的OTUs 和組間樣品共有的OTUs 進(jìn)行韋恩圖分析（圖3）。6 組處理根際土壤共有OTUs 數(shù)1 471 個(gè)，低于各處理獨(dú)有的OTUs，分別占處理N、F、NSb、FSb、NESb 和FESb 細(xì)菌總OTUs 數(shù)目的27.53%、26.04%、31.17%、29.27%、29.71%和29.38%，說明油菜根際細(xì)菌群落在銻和蚯蚓的外界擾動下，其組成仍保持了一定的相似性。

圖3 不同處理中根際土壤細(xì)菌群落的OTUs數(shù)目韋恩圖Figure 3 Venn diagram of OTUs numbers of bacterial communities of oilseed rhizosphere soil under different treatments

2.3.2 油菜根際土壤細(xì)菌α多樣性分析

不同處理油菜根際細(xì)菌群落豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)分析結(jié)果見表4。蚯蚓和銻對根際土壤細(xì)菌群落多樣性具有一定的影響，但處理間差異均不顯著（P＞0.05）。所有處理的Good's coverage 指數(shù)均超過了0.973，表明測序結(jié)果能完整反映各處理根際土壤微生物群落組成信息。N 處理的Chao1、Pielou's evenness、Shannon、Simpson 指數(shù)均高于其他處理，分別達(dá)到4 835.8、0.916 2、11.026 和0.999 1，F(xiàn) 處理的Good's coverage 指數(shù)高于其他處理，表明銻脅迫下添加蚯蚓會降低油菜根系細(xì)菌群落的多樣性。

表4 不同處理對細(xì)菌群落α多樣性的影響Table 4 Effects of different treatment on α diversity of bacterial community

2.4 蚯蚓和油菜系統(tǒng)對銻污染根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 油菜根際土壤細(xì)菌群落組成的差異分析

在門水平上（圖4a），相對豐度排在前10 的菌門從大到小排列為Proteobacteria（變形菌門）＞Actinobacteria（放線菌門）＞Acidobacteria（酸桿菌門）＞Chloroflexi（綠彎菌門）＞Bacteroidetes（擬桿菌門）＞Gemmatimonadetes（芽孢桿菌門）＞Firmicutes（厚壁菌門）＞Rokubacteria（棒狀桿菌門）＞Cyanobacteria（藍(lán)細(xì)菌門）＞Verrucomicrobiota（疣微桿菌門）。與對照相比，添加銻主要降低了油菜根際土壤Actinobacteria、Chloroflexi 和Acidobacteria 的相對豐度，提高了Proteobacteria、Firmicutes 和Rokubacteria 的相對豐度。進(jìn)一步添加蚯蚓后，根際土壤中Actinobacteria、Proteobacteria和Acidobacteria 的相對豐度降低，Bacteroidetes、Cyanobacteria和Chloroflexi的相對豐度增加。

圖4 不同處理在門水平的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)Figure 4 Bacterial community structure of different treatments at the phyla level

為了進(jìn)一步比較樣本間的物種組成差異，明確各樣本的物種豐度分布趨勢，將相對豐度排名前20 的微生物的豐度值繪制熱圖進(jìn)行物種組成分析（圖4b）。在門水平下，6個(gè)樣品聚合為3類。施加銻處理的NSb、FSb處理聚為一類，銻加入影響了油菜根際土的微生物群落結(jié)構(gòu)。添加蚯蚓處理后的樣品NESb、FESb 處理聚為一類，說明蚯蚓進(jìn)一步改變了銻脅迫下油菜根際土壤細(xì)菌的群落組成分布。

從根際土壤的細(xì)菌群落中選取相對豐度均存在顯著富集的物種進(jìn)行細(xì)菌群落組成差異分析，由圖5可知，從門水平到屬水平各個(gè)分類單位設(shè)定線性判別分析（LDA）閾值為2。N 處理存在顯著富集的物種有Subgroud_17、Oligoflexus和Candidatus_Chloroploca，F(xiàn)處理下顯著富集的物種有Xanthobacteraceae、Roseiflexaceae、Ilumatobacteraceae和Terrabacter。NSb 處理存在顯著富集的物種有Rhodobacteraceae、211ds20。FESb處理下存在顯著富集的物種是Truepera、Pseudarthrobacter等。NESb處理下達(dá)到顯著富集的物種有16種，歸屬于Actinobacteria 的Micrococcaceae，歸屬于Bacteroidetes 的Flavobacterium，歸屬于Verrucomicrobia 的Verrucomicrobiaceae，以及Bdellovibrio、Candidatus Nucleicultrix、Prosthecobacter、Thermomonas和Candidatus Pacebacteria。

圖5 不同處理土壤細(xì)菌群落相對豐度差異物種條形圖Figure 5 Bar graph of species with different relative abundance of soil bacterial communities under different treatments

2.4.2 油菜根際土壤細(xì)菌群落組成與環(huán)境因子的關(guān)系

對根際土壤細(xì)菌群落相對豐度排名前10 的菌門和土壤環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)性熱圖分析（圖6）。排名前10 的優(yōu)勢菌門中有5 個(gè)優(yōu)勢菌門豐度與土壤環(huán)境因子呈顯著相關(guān)，Actinobacteria 和Acidobacteria 與土壤環(huán)境因子主要呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。Actinobacteria 與速效鉀和有機(jī)質(zhì)呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），Acidobacteria 與中性磷酸酶和全磷呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。Proteobacteria 與堿解氮、速效鉀、有機(jī)質(zhì)、土壤銻含量和富集系數(shù)呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），Bacteroidetes與過氧化氫酶、脲酶呈極顯著相關(guān)（P＜0.01），F(xiàn)irmicutes 與全鉀呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。銻脅迫下，添加蚯蚓提高了土壤中Bacteroidetes 的相對豐度以及土壤酶中的脲酶和過氧化氫酶的活性，同時(shí)在提升Proteobacteria 的相對豐度時(shí)促進(jìn)了土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化。

圖6 土壤環(huán)境因子與根際細(xì)菌群落組成相關(guān)性熱圖Figure 6 Correaltion heatmap between soil physicochemical proproties and bacterial community compositions

2.4.3 油菜根際土壤細(xì)菌群落組成與環(huán)境因子的主成分分析

對表征土壤特性的土壤養(yǎng)分、酶活性和細(xì)菌群落因子進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖7。主坐標(biāo)的前兩軸總共解釋了所有信息的54.33%（PC1和PC2分別解釋了36.04%和18.29%的信息）。PC1 主要綜合了速效鉀、全鉀、土壤銻含量、富集系數(shù)、Proteobacteria、Actinobacteria 的信息，即PC1 正方向與土壤的污染程度有關(guān)，PC1 負(fù)方向與微生物群落有關(guān)，PC2 綜合了過氧化氫酶、脲酶、中性磷酸酶、全磷、全氮的信息，與土壤酶活性及養(yǎng)分轉(zhuǎn)化有關(guān)。

圖7 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、土壤養(yǎng)分和酶活性的主成分分析Figure 7 Principal component analysis of bacterial community structure，soil nutrients and enzyme activity under different treatments

6 組樣品分布在不同區(qū)域，處理間樣點(diǎn)離散程度較大。N、F處理聚集在主坐標(biāo)第一軸的左側(cè)，添加銻的處理位于PC1 正方向。N、F 樣點(diǎn)與Actinobacteria豐度、Chloroflexi 豐度、Shannon 指數(shù)、Simpson 指數(shù)之間夾角較小，說明在未受銻脅迫的自然環(huán)境中，南油雜1號和灃油958根際土壤的特性中主要的差異來自微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性。NSb、FSb 樣點(diǎn)位于第四象限，在速效鉀、全鉀、土壤銻含量上載荷量較高，表明酒石酸銻鉀作為外源銻污染物添加后，土壤中鉀、銻含量以及Proteobacteria 豐度增加，Actinobacteria、Chloroflexi豐度減少。NESb、FESb樣點(diǎn)聚集在第一象限，與未添加蚯蚓的NSb、FSb 樣點(diǎn)在PC2 上分異明顯，其中過氧化氫酶、脲酶、中性磷酸酶有較高的載荷，說明蚯蚓添加主要影響銻污染土壤中酶的活性。

3 討論

3.1 銻污染土壤中添加蚯蚓對油菜生長和富集的影響

南油雜1 號中富集銻的含量及富集系數(shù)均顯著高于灃油958（P＜0.05）（表2）。不同品種油菜對同種重金屬的積累能力差異較大，部分甘藍(lán)型油菜品種對鎘的積累能力主要受從根到地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)過程影響[17]。重金屬積累是多細(xì)胞、多組織和多器官協(xié)同作用的復(fù)雜生理過程[18]。韌皮部運(yùn)輸是水稻籽粒中鎘的主要運(yùn)輸途徑，大于90%的鎘來自韌皮部運(yùn)輸[19]。銻在油菜中的富集轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)理還鮮有報(bào)道，下一步可利用南油雜1號開展銻累積特性的分子機(jī)制研究。

添加蚯蚓使銻脅迫下油菜的生物量和銻富集系數(shù)均有顯著增加，表明蚯蚓可促進(jìn)油菜生長和增進(jìn)土壤銻向油菜體內(nèi)轉(zhuǎn)移。研究表明，接種蚯蚓后印度芥菜地上部生物量增加了22.6%～88.6%，并顯著促進(jìn)了植株地上部鋅和鉛的積累[20]。環(huán)境中銻主要以Sb（Ⅲ）和Sb（Ⅴ）兩種無機(jī)態(tài)形式存在，Sb（Ⅲ）比Sb（Ⅴ）更容易吸附在金屬或礦物的表面并固定，其有效性降低，而Sb（Ⅴ）的溶解性較強(qiáng)，Sb（Ⅲ）的氧化對銻的移動起著至關(guān)重要的作用[21]。蚯蚓主要通過排泄蚓糞及挖掘活動形成的蚓穴影響土壤結(jié)構(gòu)，增加土壤團(tuán)聚體及孔隙度[22]。蚯蚓擾動形成的好氧環(huán)境，促進(jìn)了Sb（Ⅲ）氧化成Sb（Ⅴ），增加了銻的移動性[23]，這可能是蚯蚓促進(jìn)銻從土壤向油菜轉(zhuǎn)移的因素之一，當(dāng)然這其中的驅(qū)動因子還不明確。

3.2 銻污染土壤中添加蚯蚓對土壤養(yǎng)分的影響

蚯蚓作為“生態(tài)系統(tǒng)的工程師”，在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中起著改善土壤物理結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)土壤pH、破碎粗有機(jī)物、促進(jìn)養(yǎng)分循環(huán)等的作用[24-25]。本試驗(yàn)中，添加蚯蚓顯著增加了銻脅迫下土壤有機(jī)質(zhì)的含量。其原因可能是由于當(dāng)銻含量達(dá)到2 000 mg·kg-1時(shí)，銻對蚯蚓產(chǎn)生了一定的毒性效應(yīng)，蚯蚓死亡率達(dá)28.25%～30.00%，死亡的蚯蚓經(jīng)微生物分解增加了土壤有機(jī)質(zhì)含量[26]。銻含量偏高對蚯蚓活性產(chǎn)生一定的抑制作用，減少了土壤有機(jī)質(zhì)的消耗。再者，蚯蚓吞吐過程形成的微團(tuán)粒結(jié)構(gòu)，使有機(jī)碳得到保存，并未引起顯著的激發(fā)效應(yīng)，使有機(jī)碳礦化和固存作用之間的平衡沒有被打破[27-28]。后期試驗(yàn)中，應(yīng)考慮降低銻含量，明確中低污染農(nóng)田中蚯蚓-植物聯(lián)合修復(fù)效果。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加蚯蚓顯著增加了銻脅迫下南油雜1 號根際土壤中堿解氮和全磷的含量。諸多研究結(jié)果表明，蚯蚓能夠影響土壤氮素循環(huán)，促進(jìn)土壤有機(jī)氮的礦化過程，使礦質(zhì)氮、NO-3和微生物量氮含量均提高[29]。蚯蚓可以增加土壤的生物有效態(tài)磷含量[30]，主要途徑是通過促進(jìn)磷酸酶的活性而間接改變土壤磷形態(tài)，提高磷活性[31]。

3.3 銻污染土壤中添加蚯蚓對土壤生物特性的影響

土壤酶在維持土壤健康和養(yǎng)分循環(huán)方面發(fā)揮著重要作用，可以作為衡量土壤質(zhì)量的生物指標(biāo)[32]。蚯蚓提高了過氧化氫酶、蔗糖酶、中性磷酸酶和脲酶活性（圖1），且過氧化氫酶與銻含量呈顯著負(fù)相關(guān)，蔗糖酶與有機(jī)質(zhì)呈顯著正相關(guān)，中性磷酸酶與全磷呈正相關(guān)，脲酶與全氮和堿解氮呈正相關(guān)（圖2）。

過氧化氫酶活性能在一定程度上反映重金屬的污染程度，與土壤銅和鋅含量呈顯著性負(fù)相關(guān)[33]。赤子愛勝蚓屬于表?xiàng)万球?，主要以地表的枯枝落葉和腐殖質(zhì)為食，能刺激與土壤碳循環(huán)緊密聯(lián)系的蔗糖酶的活性，進(jìn)而促進(jìn)蔗糖水解產(chǎn)生更易被吸收的葡萄糖和果糖，在可溶性營養(yǎng)物質(zhì)的生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用[34]。脲酶與氮循環(huán)有關(guān)，能夠催化尿素分解生成氨、二氧化碳和水，為植物提供氮素營養(yǎng)，與有效氮含量密切相關(guān)[35]。因此，蚯蚓改善了土壤質(zhì)量，在銻脅迫下促進(jìn)了油菜根際土壤養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化，從而提高了土壤酶活性。

重金屬在土壤中的積累會造成土壤中原始微生物群落結(jié)構(gòu)的改變，使得土壤肥力和質(zhì)量降低，土壤中微生物的多樣性減少[36]。也有研究表明，重金屬污染對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響較小[37]。蚯蚓通過蚓觸圈，對有機(jī)殘留物和礦質(zhì)土壤進(jìn)行攝取和擾動，可直接影響生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能，改變土壤的結(jié)構(gòu)及特性，進(jìn)而影響土壤細(xì)菌群落的組成[38]。蚯蚓增加土壤中細(xì)菌數(shù)量造成優(yōu)勢菌群豐度變化的原因可能是蚯蚓選擇性吞食菌種以及腸道環(huán)境對微生物的刺激作用[39]。

銻添加提高了油菜根際土壤中Proteobacteria 的豐度，且土壤中銻含量與Proteobacteria 呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），表明銻污染土壤中，Proteobacteria 耐性較強(qiáng)，這與前人研究結(jié)果一致[40]。Proteobacteria 是土壤圈層中相對豐度最高的一類細(xì)菌，攜帶有大量關(guān)于DNA 修復(fù)和重金屬抗性的基因，是最耐脅迫的細(xì)菌[41]。研究證實(shí)，在銻礦場篩選出的8 株耐銻細(xì)菌均來自Proteobacteria，其可將Sb（Ⅲ）氧化為Sb（Ⅴ）從而降低土壤毒性[42]，變形菌門中的α-、β-和γ-變形菌綱細(xì)菌也可將與銻同主族的As（Ⅲ）氧化為As（Ⅴ），從而降低砷的有效性[43]。

蚯蚓未改變銻脅迫下油菜根際土壤中優(yōu)勢菌門的組成，而主要影響其豐度占比，增加了Bacteroidetes、Cyanobacteria 和Chloroflexi 的豐度。Bacteroidetes含有較多的重金屬抗性和還原基因，適應(yīng)性較強(qiáng)[44]。在重金屬復(fù)合污染土壤中，蚯蚓腸道微生物中Bacteroidetes 豐度達(dá)到18.8%[45]。歸屬Bacteroidetes 的Sphingobacterium屬已被證明與超富集植物東南景天聯(lián)合可有效修復(fù)鎘污染土壤[46]。圖5 中，添加蚯蚓后（NESb），南油雜1 號根際土壤微生物群落中歸屬于Bacteroidetes 的Flavobacterium豐富度顯著高于其他處理（P＜0.05），這與相關(guān)研究結(jié)果一致[47]。Flavobacterium是蚯蚓腸道中重要的反硝化細(xì)菌，能促進(jìn)氮循環(huán)中N2O 的釋放[48]。Bacteroidetes 與土壤脲酶呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01，圖6）。因此，銻脅迫下蚯蚓對土壤氮素循環(huán)相關(guān)酶和微生物的作用，及其對銻脅迫的響應(yīng)機(jī)制應(yīng)引起關(guān)注。

4 結(jié)論

（1）銻污染土壤中，添加蚯蚓可以提高油菜的生物量并促進(jìn)其對銻的富集。

（2）銻能顯著降低油菜根際土壤中過氧化氫酶、中性磷酸酶、脲酶的活性，提高Proteobacteria、Firmicutes 和Rokubacteria 的豐度；添加蚯蚓可以促進(jìn)銻脅迫下油菜根際土壤養(yǎng)分循環(huán)，提高土壤酶活性，增加Bacteroidetes、Cyanobacteria和Chloroflexi的豐度。

（3）從土壤生態(tài)的角度初步得出，蚯蚓-油菜聯(lián)合能降低農(nóng)田土壤中銻的含量，起到一定生態(tài)修復(fù)的效果，且南油雜1號的修復(fù)潛能大于灃油958。