基于鐵死亡途徑探討龜鹿二仙膠治療少弱精子癥的作用及機(jī)制

李 玲，黃家望，馮芷瑩，劉卓琳，王康宇，王 磊，何清湖, 4, 5

基于鐵死亡途徑探討龜鹿二仙膠治療少弱精子癥的作用及機(jī)制

李 玲1，黃家望2#，馮芷瑩1，劉卓琳2，王康宇1，王 磊3，何清湖2, 4, 5*

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長沙 410208 3. 湖南衡陽東健藥業(yè)有限公司，湖南 衡陽 421411 4. 湖南醫(yī)藥學(xué)院康復(fù)醫(yī)學(xué)與保健學(xué)院，湖南 懷化 418000 5. 互聯(lián)網(wǎng)（中西協(xié)同）健康服務(wù)湖南省工程研究中心，湖南 懷化 418000

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和體內(nèi)外實驗研究，探討鐵死亡在龜鹿二仙膠治療少弱精子癥中的作用。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫、HERB數(shù)據(jù)庫、PubChem數(shù)據(jù)庫和Swiss數(shù)據(jù)庫獲取龜鹿二仙膠的活性成分和作用靶點，Genecard數(shù)據(jù)庫和FerrDb數(shù)據(jù)庫檢索鐵死亡基因，GEO數(shù)據(jù)庫獲取少弱精子癥差異基因，三者取交集構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。使用H2O2刺激小鼠睪丸支持細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激損傷模型，并用龜鹿二仙膠含藥血清干預(yù)損傷模型細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)，檢測細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、總鐵和亞鐵離子含量，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，qRT-PCR和Western blotting檢測細(xì)胞谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）和?；o酶A合成酶長鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4）的mRNA和蛋白表達(dá)。使用環(huán)磷酰胺構(gòu)建小鼠少弱精子癥模型，ELISA檢測小鼠性激素水平，蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察小鼠睪丸組織病理學(xué)改變，免疫組化檢測小鼠睪丸組織GPX4和ACSL4蛋白表達(dá)。共獲取龜鹿二仙膠81個活性成分和190個作用靶點，686個鐵死亡基因和4777個少弱精子癥差異基因，龜鹿二仙膠干預(yù)少弱精子癥鐵死亡靶點共11個，GO富集分析共檢測到869個條目，KEGG共有35條。體外實驗顯示，龜鹿二仙膠含藥血清能顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS、LDH、總鐵和亞鐵離子含量（＜0.05、0.01），修復(fù)損傷線粒體，顯著降低的mRNA和蛋白表達(dá)（＜0.01），顯著促進(jìn)的mRNA和蛋白表達(dá)（＜0.01）。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，龜鹿二仙膠能改善少弱精子癥小鼠血清中性激素水平和睪丸組織病理損傷，顯著降低小鼠睪丸組織中ACSL4蛋白表達(dá)（＜0.01），顯著促進(jìn)睪丸組織中GPX4蛋白表達(dá)（＜0.01）。龜鹿二仙膠能有效治療少弱精子癥，拮抗鐵死亡的發(fā)生可能是龜鹿二仙膠治療少弱精子癥潛在的作用機(jī)制。

龜鹿二仙膠；少弱精子癥；鐵死亡；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；實驗驗證

男性不育癥是指在定期無保護(hù)1年后，因男方因素導(dǎo)致女方無法懷孕[1]。其中少精子癥和弱精子癥是男性不育的常見原因，少精子癥指精子密度小于1.5×105個/mL，弱精子癥指精子總活動力小于40%[2-4]。精索靜脈曲張、睪丸炎、輻射、生態(tài)環(huán)境、飲酒和吸煙等因素是少弱精子癥的常見誘因[5]。目前臨床上對于少弱精子癥的主要治療策略是藥物治療，包括雄激素、促性腺激素、皮質(zhì)類固醇、促黃體生成素、卵泡刺激素和抗氧化劑，盡管這些藥物在臨床上應(yīng)用廣泛，但除促黃體生成素外，其他療法均未得到國際指南的推薦[6-7]。少弱精子癥與中醫(yī)古籍中記載的“精少”“精冷”“精清”相似，其病機(jī)主要是腎精虧損、腎陰腎陽平衡失調(diào)，故本病多以滋腎壯陽、益精填髓治療為主。龜鹿二仙膠最早記錄于中醫(yī)古籍《醫(yī)便》，由龜板膠、鹿角膠、人參和枸杞子4味藥組成，共奏補(bǔ)益肝腎、填精益髓、調(diào)節(jié)陰陽之功效?，F(xiàn)代臨床研究發(fā)現(xiàn)，龜鹿二仙膠能明顯改善男性精液異常患者的精液質(zhì)量[8]。鐵死亡是一種新型的程序性細(xì)胞死亡形式，細(xì)胞內(nèi)鐵的積累促進(jìn)脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[9]，越來越多研究聚焦于鐵死亡靶點[10]。異常增多的活性氧（reactive oxygen species，ROS）可導(dǎo)致精子DNA、RNA轉(zhuǎn)錄物和端粒損傷以及精子質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化損傷，是引起精子功能缺陷的主要原因，因此鐵死亡可能是少弱精子癥發(fā)生的潛在作用機(jī)制[11-12]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種整體分析的研究方法，將實驗室和臨床查詢與數(shù)據(jù)處理相結(jié)合，揭示中藥方劑用于治療疾病的機(jī)制，以指導(dǎo)藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)[13-14]?；诖?，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測鐵死亡在龜鹿二仙膠治療少弱精子癥的作用機(jī)制，探索藥物與機(jī)體的相關(guān)性，揭示其潛在作用機(jī)制，并通過體內(nèi)外實驗對其進(jìn)行驗證，以期為臨床運用龜鹿二仙膠治療少弱精子癥提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量200～220 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物公司，動物質(zhì)量許可證430727221102014186，于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動物實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審批（批準(zhǔn)號LLBH-202212060003）。

SPF級雄性BALB/c小鼠40只，體質(zhì)量20～25 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物公司，動物質(zhì)量許可證號430727221102777417，于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動物實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審批（批準(zhǔn)號LLBH-202205310006）。

1.2 細(xì)胞

小鼠TM4睪丸支持細(xì)胞（批號70004689）購自美國細(xì)胞培養(yǎng)物收藏中心。

1.3 藥材

龜鹿二仙膠由龜甲膠（湖南東健藥業(yè)有限公司，批號20170901）、鹿角膠（湖南東健藥業(yè)有限公司，20160903）、枸杞子（恒修堂藥業(yè)有限公司，批號2110027）、人參（湖南三湘中藥飲片有限公司，批號2020071606）組成，以上藥材經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院余娜副教授分別鑒定為龜科動物烏龜(Gray)的背甲及腹甲經(jīng)水煎煮、濃縮制成的固體膠，鹿科動物梅花鹿Temminck已骨化的角或鋸茸后翌年春季脫落的角基經(jīng)水煎煮、濃縮制成的固體膠，茄科植物寧夏枸杞L.的干燥成熟果實，五加科植物人參C. A. Mey.的干燥根和根莖，均符合《中國藥典》2020年版規(guī)定。

1.4 藥品與試劑

胎牛血清（批號2232241）購自美國Gibco公司；DMED/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基（批號WH2122A281）、磷酸鹽緩沖液（批號WH0022K191）、青霉素-鏈霉素混合液（批號WHAB23N201）、0.25%胰蛋白酶溶液（批號WH0123X302）購自武漢普諾賽生命科技有限公司；內(nèi)源性過氧化氫酶阻斷劑（批號K177711）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；鐵死亡抑制劑Ferrostain-1（Fer-1，批號347174-05-4）、TRIzol（批號5301100）購自美國Sigma公司；CCK-8細(xì)胞毒性檢測試劑盒（批號FU2082F83788）、ROS熒光法測定試劑盒（批號KL054B046842）、細(xì)胞總鐵比色法測定試劑盒（批號AK052DRD5674）、細(xì)胞亞鐵比色法測定試劑盒（批號AK0460Z61078）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）比色法測試盒（批號NM10J2D20952）、睪酮（testosterone，T）ELISA試劑盒（批號E-OSEL-M0003）、雌二醇（estradiol，E2）ELISA試劑盒（批號E-OSEL-M0008）、促黃體生成素（luteotropic hormone，LH）ELISA試劑盒（批號E-EL-M3053）、促卵泡激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）ELISA試劑盒（批號E-EL-M0511c）購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號05250410）、qPCR Mix試劑盒（批號05236502）購自NovoScript公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；β-actin抗體（批號ab8227）、谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）抗體（批號ab125066）、?；o酶A合成酶長鏈家族成員4（acyl-CoA synthetase long chain family member 4，ACSL4）抗體（批號ab155282）、山羊抗兔IgG二抗（批號ab150077）購自英國Abcam公司；環(huán)磷酰胺注射液（批號0B365A）購自美國Baxter公司；動物睪丸組織固定液（批號CR2202002）購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.5 儀器

ST8R型臺式高速冷凍離心機(jī)、Fresco21型微量冷凍離心機(jī)、3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；LM20型微量移液器（波蘭HTL公司）；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；JY300HE CFX96 TOUCH型實時定量PCR儀、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜設(shè)備（美國Bio-Rad公司）；Take3型超微量分光光度計、Synergy HTX多功能酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）；AE2000-T型倒置顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司）；HT7800型透射電鏡（日本日立公司）。

2 方法

2.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.1.1 龜鹿二仙膠活性成分、靶點及鐵死亡基因獲取 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18為條件檢索枸杞子、人參的主要成分，根據(jù)活性成分檢索得到枸杞子、人參對應(yīng)的靶點。鹿角膠、龜板膠均未納入TCMSP數(shù)據(jù)庫，通過HERB數(shù)據(jù)庫（http://herb.ac.cn/）、PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和Swiss數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）獲取鹿角膠、龜板膠主要活性成分及靶點，運用UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）標(biāo)準(zhǔn)化。在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）和FerrDb數(shù)據(jù)庫（http://www.zhounan.org/ferrdb/）獲取鐵死亡相關(guān)基因，整合2個數(shù)據(jù)庫基因，最終獲取鐵死亡相關(guān)基因。

2.1.2 少弱精子癥靶點獲取 通過GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），以“oligospermia”為檢索詞，獲取oligospermia微陣列表達(dá)譜。采用R語言limma包對檢索到的數(shù)據(jù)集中受損的睪丸樣本與功能正常的睪丸樣本的表達(dá)情況進(jìn)行比較，以“＜0.05且|log2FC|＞1”為篩選條件，鑒定出差異表達(dá)基因（differential expressed genes，DEGs）。

2.1.3 龜鹿二仙膠治療少弱精子癥的鐵死亡靶點獲取 通過韋恩圖在線繪制網(wǎng)站（http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/Venn/）取“龜鹿二仙膠藥物靶點”“oligospermia-DEGs”“鐵死亡相關(guān)基因”三者交集，獲取龜鹿二仙膠干預(yù)少弱精子癥鐵死亡靶點。

2.1.4 龜鹿二仙膠治療少弱精子癥的鐵死亡靶點相關(guān)性分析 將得到的龜鹿二仙膠干預(yù)少弱精子癥鐵死亡靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db. org/），獲取蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）相關(guān)信息，運用Cytoscape 3.9.0構(gòu)建蛋白互作關(guān)系。同時采用Pearson相關(guān)性分析，評價龜鹿二仙膠干預(yù)少弱精子癥鐵死亡靶點表達(dá)的相關(guān)性。

2.1.5 基因本體論（gene ontology，GO）功能和基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 采用R語言cluster Profiler包對龜鹿二仙膠干預(yù)少弱精子癥鐵死亡靶點進(jìn)行GO、KEGG富集分析，并對其進(jìn)行可視化。

2.2 細(xì)胞實驗

2.2.1 龜鹿二仙膠含藥血清的制備 龜鹿二仙膠由湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房制備。參考《醫(yī)便》《醫(yī)方考》《張氏醫(yī)通》中方劑配比，取鹿角膠、龜板膠、枸杞子、人參，以蒸餾水煎煮配制成相應(yīng)質(zhì)量濃度的藥液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｒ泽w表面積換算后大鼠每天ig劑量分別為龜甲膠400 mg/kg、鹿角膠800 mg/kg、枸杞300 mg/kg、人參200 mg/kg。采用UPLC-Q/TOF-MS法對龜鹿二仙膠的化學(xué)成分進(jìn)行分析，正、負(fù)離子模式分別鑒定出122、66個化合物[15]。SD大鼠隨機(jī)分為給藥組和正常組，每組15只，給藥組大鼠ig 5倍臨床劑量的龜鹿二仙膠，連續(xù)給藥7 d后收集大鼠血清，4 ℃靜置2 h后，2500 r/min離心10 min，收集血清，56 ℃水浴30 min滅活，0.22 μm濾過除菌，?20 ℃保存。

2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) TM4細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液的DMEM/F12培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度為90%時，用0.25%胰酶消化并傳代。

2.2.3 CCK-8法測定H2O2干預(yù)濃度及龜鹿二仙膠含藥血清干預(yù)濃度 待細(xì)胞生長至對數(shù)期時消化離心，以5000個/孔接種至96孔板內(nèi)，分別加入0（對照）、100、200、300、400、500 μmol/L H2O2，每組設(shè)置4個復(fù)孔，干預(yù)3、6、12 h后，加入CCK-8試劑，采用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（）值，確定H2O2最佳干預(yù)濃度及時間。

待H2O2濃度及時間確定后，將對數(shù)期細(xì)胞生長的細(xì)胞消化離心接種至96孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，先加入400 μmol/L的H2O2至96孔板干預(yù)6 h，隨后去上清，再分別加入0、10%、20%、40%、60%、80%龜鹿二仙膠含藥血清，另設(shè)置對照組不給予H2O2及藥物干預(yù)，每組設(shè)置4個復(fù)孔。干預(yù)24 h后棄上清，加入CCK-8試劑，采用酶標(biāo)儀測定450 nm處的值，確定龜鹿二仙膠含藥血清最佳給藥濃度。

2.2.4 DCFH-DA熒光探針法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS含量 將細(xì)胞以5×106個/mL接種至6孔板，設(shè)置對照組（正常大鼠血清）、模型組（正常大鼠血清）及20%、10%龜鹿二仙膠含藥血清組和Fer-1（2 μmol/L）組。細(xì)胞融合生長至70%時，模型組和各給藥組均加入400 μmol/L的H2O2干預(yù)6 h后，棄上清，龜鹿二仙膠含藥血清組分別加入10%、20%龜鹿二仙膠含藥血清干預(yù)24 h，F(xiàn)er-1組在造模前12 h使用Fer-1干預(yù)[16]。收集細(xì)胞前2 h，在陽性對照孔內(nèi)加入ROS陽性對照試劑；收集細(xì)胞前1 h在各組細(xì)胞內(nèi)加入熒光探針DCFH-DA工作液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h后，收集細(xì)胞，重懸于PBS中，1000 r/min離心5 min，棄上清液，洗去多余的探針，洗滌2次，離心后將細(xì)胞重懸于PBS中，加入96孔酶標(biāo)板中。使用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長為488 nm、發(fā)射波長為525 nm處測定值。

2.2.5 比色法檢測LDH釋放量 將細(xì)胞接種至96孔板內(nèi)，按“2.2.4”項下方法進(jìn)行分組和給藥，另設(shè)置最大酶活對照孔，在實驗結(jié)束前1 h從細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)取出96孔板，在最大酶活對照孔中加入陽性對照裂解液試劑，并反復(fù)吹打，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)1 h后用移液槍吸打均勻后移至離心管中，400×離心5 min，吸取上清液，各組吸取50 μL上清液和50 μL反應(yīng)工作液移至96孔酶標(biāo)板中，37 ℃孵育10 min，向各孔中加入反應(yīng)終止劑，混勻，終止反應(yīng)，在450 nm處測定值。

2.2.6 比色法檢測各組細(xì)胞內(nèi)總鐵離子和亞鐵離子的含量 將細(xì)胞接種于6孔板中，按“2.2.4”項下方法進(jìn)行分組和給藥，用胰酶消化并收集細(xì)胞到離心管中，1000 r/min離心5 min，棄上清。根據(jù)試劑盒說明書檢測各組細(xì)胞總鐵離子的含量和細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子的含量。

2.2.7 TEM觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu) 將細(xì)胞接種于6孔板中，按“2.2.4”項下方法進(jìn)行分組和給藥，用胰酶消化并收集細(xì)胞到離心管中，1000 r/min離心5 min棄上清，得到細(xì)胞沉淀，加入PBS重懸。在直徑為2 nm的銅網(wǎng)上加入20 μL細(xì)胞懸液，用無菌蒸餾水沖洗，然后從濾紙吸收多余液體，在室溫下放置10 min后，在銅網(wǎng)滴入30 μL的3%磷鎢酸溶液，室溫復(fù)染5 min，充分晾干。在TEM下觀察每組銅網(wǎng)中細(xì)胞結(jié)構(gòu)并拍攝照片。

2.2.8 qRT-PCR檢測各組細(xì)胞內(nèi)鐵死亡標(biāo)志基因表達(dá) 將細(xì)胞接種于6孔板中，按“2.2.4”項下方法進(jìn)行分組和給藥，收集細(xì)胞，按照試劑盒說明書提取細(xì)胞中總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.2.9 Western blotting檢測各組細(xì)胞內(nèi)鐵死亡標(biāo)志蛋白表達(dá) 將細(xì)胞接種于6孔板中，按“2.2.4”項下方法進(jìn)行分組和給藥，收集細(xì)胞，使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉，加入一抗于4 ℃孵育過夜，加入二抗于37 ℃孵育1 h。ECL發(fā)光后，在化學(xué)發(fā)光成像儀中顯影成像。使用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.3 動物實驗

2.3.1 給藥溶液的制備 龜鹿二仙膠制備方法同“2.2.1”項。按照60 kg成人體表換算劑量，龜鹿二仙膠高劑量為3.6 g/kg、低劑量為1.8 g/kg。

2.3.2 少弱精子癥模型小鼠的制備及分組 將40只小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組及龜鹿二仙膠高、低劑量（3.6、1.8 g/kg）組和Fer-1（0.8 mg/kg）組，每組8只。參考Cao等[17]的造模方法，小鼠連續(xù)3 d ip環(huán)磷酰胺（75 mg/kg）構(gòu)建少弱精子癥模型，模型建立后，F(xiàn)er-1組小鼠尾iv Fer-1，龜鹿二仙膠組ig 0.2 mL藥物，對照組和模型組ig等體積生理鹽水，連續(xù)給藥4周后處理動物。

2.3.3 ELISA法檢測小鼠血清性激素水平 收集各組小鼠血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中T、E2、LH和FSH水平。

2.3.4 蘇木素-伊紅（HE）染色觀察各組小鼠睪丸組織的病理學(xué)變化 取小鼠一側(cè)睪丸組織，用動物睪丸組織固定液固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟切片，HE染色，脫水，透明，封片，于顯微鏡下觀察其病理變化。

2.3.5 免疫組化法檢測各組小鼠睪丸組織中GPX4和ACSL4蛋白表達(dá)情況 取大鼠睪丸組織，用動物睪丸組織固定液固定，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟切片，脫蠟，抗原修復(fù)，一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育30 min，鏈霉素-親和素-生物素孵育30 min，DAB溶液顯色30 min后洗凈，蘇木素復(fù)染，隨后脫水，透明，封片，于顯微鏡下觀察睪丸組織染色情況，利用圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0對圖像進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

3.1.1 龜鹿二仙膠成分、靶點獲取和鐵死亡基因、少弱精子癥靶點獲取 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫、HERB數(shù)據(jù)庫、PubChem數(shù)據(jù)庫和Swiss數(shù)據(jù)庫共獲取龜鹿二仙膠81活性成分和190個作用靶點。從GeneCards數(shù)據(jù)庫和FerrDb數(shù)據(jù)庫中共獲取686個鐵死亡相關(guān)基因。

通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選得到GSE145467數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含10例功能正常的睪丸樣本和10例生精功能受損的睪丸樣本，以“＜0.05且|log2FC|＞1”為篩選條件，共獲生精功能受損的睪丸樣4777個DEGs，其中1605個差異上調(diào)，3172個差異下調(diào)（圖1）。

3.1.2 龜鹿二仙膠治療少弱精子癥的鐵死亡靶點獲取 通過在線韋恩圖取交集工具共獲取11個龜鹿二仙膠干預(yù)少弱精子癥鐵死亡靶點（圖2-A），基于GSE145467數(shù)據(jù)集，映射龜鹿二仙膠干預(yù)少弱精子癥鐵死亡靶點表達(dá)譜（圖2-B、C）。

圖1 少弱精子癥差異基因表達(dá)譜

*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

3.1.3 龜鹿二仙膠治療少弱精子癥的鐵死亡靶點相關(guān)性分析 將11個龜鹿二仙膠干預(yù)少弱精子癥鐵死亡靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)蛋白，使用Cytoscape 3.8.0軟件進(jìn)行美化（圖3-A），節(jié)點顏色從綠-淺藍(lán)-深藍(lán)，蛋白互作次數(shù)越大，同時節(jié)點越大。基于GSE145467數(shù)據(jù)集，映射龜鹿二仙膠干預(yù)少弱精子癥鐵死亡靶點表達(dá)譜，采用Pearson相關(guān)性分析（圖3-B），紅色表示兩基因呈正相關(guān)，藍(lán)色表示兩基因呈負(fù)相關(guān)。

3.1.4 GO功能和KEGG通路富集分析 在滿足＜0.05且＜0.2條件下，生物過程（biological process，BP）共有804條，細(xì)胞組成（cell component，CC）共有33條，分子功能（molecular function，MF）共有32條，KEGG共有35條。根據(jù)值進(jìn)行排序，對BP、CC、MF前10位及KEGG前20位進(jìn)行可視化（圖4）。

3.2 細(xì)胞實驗

3.2.1 龜鹿二仙膠含藥血清對H2O2誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞活力的影響 如圖5-A～C所示，分別對TM4細(xì)胞使用不同濃度的H2O2干預(yù)3、6、12 h，隨著H2O2濃度和干預(yù)時間的增加，細(xì)胞活性降低，當(dāng)使用400 μmol/L H2O2干預(yù)6 h時，細(xì)胞抑制率達(dá)到31.38%，基于這個結(jié)果，后續(xù)實驗中，TM4細(xì)胞氧化應(yīng)激模型中，H2O2濃度選擇400 μmol/L。

如圖5-D所示，對TM4細(xì)胞使用H2O2干預(yù)造模后，使用不同濃度的龜鹿二仙膠含藥血清干預(yù)細(xì)胞，在20%含藥血清干預(yù)時細(xì)胞增殖率最高，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞增殖率有所下降，基于此，選取20%和10%含藥血清進(jìn)行后續(xù)實驗。

圖3 龜鹿二仙膠治療少弱精子癥鐵死亡靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)(A) 和相關(guān)性分析(B)

圖4 GO功能(A) 和KEGG通路(B) 富集分析

A-H2O2干預(yù)3 h對TM4細(xì)胞活性的影響 B-H2O2干預(yù)6 h對TM4細(xì)胞活性的影響 C-H2O2干預(yù)12 h對TM4細(xì)胞活性的影響 D-龜鹿二仙膠含藥血清對H2O2誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞活性的影響 與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下圖同

3.2.2 龜鹿二仙膠含藥血清對H2O2誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞形態(tài)的影響 如圖6所示，對照組細(xì)胞上皮樣貼壁，細(xì)胞狀況良好，形狀呈梭形或多角形，細(xì)胞核明顯；模型組細(xì)胞數(shù)量顯著減少，細(xì)胞變圓、變小，視野內(nèi)可見細(xì)胞碎片；各給藥組細(xì)胞形態(tài)大部分恢復(fù)，視野內(nèi)細(xì)胞碎片明顯減少，表明龜鹿二仙膠含藥血清能不同程度地改善H2O2對細(xì)胞造成的損傷。

3.2.3 龜鹿二仙膠含藥血清對H2O2誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞ROS、LDH、總鐵離子和亞鐵離子的影響 如圖7所示，與對照組比較，模型組ROS、LDH、總鐵離子和亞鐵離子含量均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組以上指標(biāo)均顯著降低（＜0.05、0.01）。

3.2.4 龜鹿二仙膠含藥血清對H2O2誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響 如圖8所示，模型組細(xì)胞線粒體雙層膜高度濃縮，線粒體收縮，線粒體嵴減少或消失；龜鹿二仙膠含藥血清干預(yù)后，細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)有不同程度的修復(fù)。

圖6 龜鹿二仙膠含藥血清對H2O2誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞形態(tài)的影響

圖7 龜鹿二仙膠含藥血清對H2O2誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞ROS、LDH、總鐵離子和亞鐵離子含量的影響(, n = 5)

箭頭所指為細(xì)胞線粒體的形態(tài)

3.2.5 龜鹿二仙膠含藥血清對H2O2誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞和mRNA表達(dá)的影響 如圖9所示，與對照組比較，模型組mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。

3.2.6 龜鹿二仙膠對H2O2誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞GPX4和ACSL4蛋白表達(dá)的影響 如圖10所示，與對照組相比，模型組細(xì)胞ACSL4蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），GPX4蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組ACSL4蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），GPX4蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。

圖9 龜鹿二仙膠含藥血清對H2O2誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞ACSL4和GPX4 mRNA表達(dá)的影響(, n = 3)

圖10 龜鹿二仙膠含藥血清對H2O2誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞ACSL4和GPX4蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

3.3 動物實驗

3.3.1 龜鹿二仙膠對少弱精子癥小鼠血清中性激素分泌的影響 如圖11所示，與對照組比較，模型組T和E2分泌顯著減少（＜0.01），LH和FSH分泌顯著增多（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組T和E2分泌顯著升高（＜0.05、0.01），LH和FSH分泌顯著減少（＜0.01）。

3.3.2 龜鹿二仙膠對少弱精子癥小鼠睪丸組織病理變化的影響 如圖12所示，與對照組比較，模型組小鼠睪丸的生精小管和睪丸間質(zhì)出現(xiàn)了顯著病理改變，各級精子細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死和排列紊亂，支持細(xì)胞空泡化，間質(zhì)水腫和充血。與模型組比較，各給藥組能不同程度地改善環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠睪丸組織病理損傷，生精細(xì)胞層數(shù)和數(shù)量明顯增多。

圖11 龜鹿二仙膠對少弱精子癥小鼠血清中性激素分泌的影響(, n = 5)

圖12 龜鹿二仙膠對少弱精子癥小鼠睪丸組織病理變化的影響(HE)

3.3.3 龜鹿二仙膠對少弱精子癥小鼠睪丸組織GPX4和ACSL4蛋白表達(dá)的影響 如圖13所示，與對照組比較，模型組小鼠睪丸組織ACSL4蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），GPX4蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠睪丸組織ACSL4蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），GPX4蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。

4 討論

不育癥是常見的男科疾病之一，國內(nèi)研究顯示，在過去15年中，中國男性精子質(zhì)量隨時間呈現(xiàn)下降趨勢，隨著國家“三孩”政策的放開，整個社會對于生育的需求進(jìn)一步擴(kuò)大，男性不育癥正成為一項嚴(yán)重的、亟需解決的社會學(xué)問題[18]。鐵死亡是近年來發(fā)現(xiàn)的一種鐵依賴性、以脂質(zhì)ROS堆積為特點的細(xì)胞死亡方式。研究發(fā)現(xiàn)，白消安誘導(dǎo)少弱精子癥小鼠模型睪丸組織表現(xiàn)出典型鐵死亡特征，抗氧化劑及鐵死亡抑制劑干預(yù)可抵抗鐵死亡，減輕少弱精子癥小鼠睪丸組織病理損傷，并改善附睪精液質(zhì)量[19]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為少弱精子癥病位在腎，核心病機(jī)之一就是腎陰虧虛、腎陽不足，腎藏精，主生殖，匯聚五藏六腑之精而藏之，為先天之本，是生殖之源，對生殖功能進(jìn)行調(diào)控[20]。龜鹿二仙膠是臨床上常用于治療經(jīng)久不孕的中醫(yī)經(jīng)典方劑，方中鹿角膠補(bǔ)益肝腎、益精養(yǎng)血，龜板膠滋陰潛陽、補(bǔ)血養(yǎng)血，二膠皆血肉之品合用補(bǔ)肝腎、益精血之功更甚，共為君藥；枸杞子滋補(bǔ)肝腎，益精明目；人參補(bǔ)氣益脾肺，同為臣藥，4藥合用，陰陽氣血并補(bǔ)，先后天同補(bǔ)，效專力宏，共奏補(bǔ)髓填精之功。

圖13 龜鹿二仙膠對少弱精子癥小鼠睪丸組織ACSL4和GPX4蛋白表達(dá)的影響(, n = 3)

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)得到龜鹿二仙膠81個活性成分和190個作用靶點，并得到了686個鐵死亡相關(guān)基因和4777個少弱精子癥的差異基因，三者取交集后得到11個龜鹿二仙膠治療少弱精子癥的鐵死亡相關(guān)靶點，對其進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)11個靶點之間具有較強(qiáng)的相互作用和相關(guān)性，隨后對其進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，在滿足＜0.05且＜0.2條件下，GO富集分析共檢測到869個條目，其中BP有804條，CC有33條，MF有32條，KEGG共有35條。體外實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H2O2誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞出現(xiàn)了線粒體收縮、線粒體嵴減少或消失等典型的鐵死亡特征，同時還能促進(jìn)細(xì)胞ROS、LDH、總鐵離子和亞鐵離子的含量，并還能促進(jìn)鐵死亡陽性基因的mRNA和蛋白表達(dá)，抑制鐵死亡陰性基因的mRNA和蛋白表達(dá)；龜鹿二仙膠含藥血清能有效地緩解細(xì)胞的線粒體損傷以及ROS、LDH、總鐵離子和亞鐵離子的含量，同時也能逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的鐵死亡相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)，并能有效改善細(xì)胞形態(tài)，表明龜鹿二仙膠可能是通過抑制細(xì)胞鐵死亡的發(fā)生來緩解H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。此外，本研究還通過環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)了小鼠少弱精子癥模型，結(jié)果顯示龜鹿二仙膠能有效調(diào)節(jié)模型小鼠的性激素水平，顯著促進(jìn)T和E2的分泌，抑制LH和FSH水平，還能有效改善模型小鼠睪丸組織的病理損傷，逆轉(zhuǎn)模型小鼠睪丸組織鐵死亡標(biāo)志蛋白的表達(dá)，提示龜鹿二仙膠可能是通過抑制鐵死亡的發(fā)生，進(jìn)而調(diào)節(jié)性激素水平來治療少弱精子癥。

綜上，本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，并通過體內(nèi)外實驗驗證，預(yù)測并分析驗證了龜鹿二仙膠治療少弱精子癥模型鐵死亡發(fā)生的藥效機(jī)制和作用機(jī)制，初步揭示了龜鹿二仙膠抗鐵死亡的藥效機(jī)制，以期為中醫(yī)藥治療少弱精子癥提供新的思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Therapeutic effect and mechanism of Guilu Erxian Gel on oligospermia based on iron death pathway

LI Ling1, HUANG Jia-wang2, FENG Zhi-ying1, LIU Zhuo-lin2, WANG Kang-yu1, WANG Lei3, HE Qing-hu2, 4, 5

1. School of Traditional Chinese Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. School of Integrated Chinese and Western Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 3. Hunan Hengyang Dongjian Pharmaceutical Co., Ltd., Hengyang 421411, China 4. Department of Rehabilitation and Healthcare, Hunan University of Medicine, Huaihua 418000, China 5. Hunan Engineering Research Center of Internet-Chinese and Western Medicine Collaboration-Health Service, Huaihua 418000, China

To investigate the role of ferroptosis in the treatment of oligospermia with Guilu Erxian Gel (龜鹿二仙膠, GLEXG) through network pharmacology and,experiments.The active ingredients and targets of GLEXG were obtained from TCMSP, HERB, PubChem and Swiss databases, ferroptosis-related genes were retrieved from Genecard and FerrDb databases. The differentially expressed genes in oligospermia were obtained from GEO database, and protein interaction network was constructed by taking the intersection of the three datasets. Gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) pathway enrichment analyses were performed., an oxidative stress injury model was constructed in H2O2-induced mouse testicular sertoli cells, and cells were treated with GLEJ-containing serum. Cell morphology, reactive oxygen species (ROS), lactate dehydrogenase (LDH), total iron and ferrous ion were measured. The ultrastructure of cells was observed by transmission electron microscopy. The mRNA and protein expressions of glutathione peroxidase 4 (GPX4) and acyl-CoA synthetase long chain family member 4 (ACSL4) were measured by qRT-PCR and Western blotting., a mouse model of oligospermia was constructed using cyclophosphamide. The levels of sex hormones were measured by ELISA, and pathological changes in testicular tissue were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining. The protein expressions of GPX4 and ACSL4 in testicular tissue were detected by immunohistochemistry.A total of 81 active ingredients and 190 targets of GLEXG were obtained, along with 686 ferroptosis-related genes and 4777 differentially expressed genes in oligospermia. A total of 11 shared targets were identified for GLEXG and ferroptosis in oligospermia by network pharmacology, and a total of 869 items and 35 KEGG pathways were enriched.experiments showed that GLEXG-containing serum significantly reduced ROS, LDH, total iron, and ferrous ion levels (< 0.05, 0.01), repaired damaged mitochondria, and significantly decreased the mRNA and protein expressions of ACSL4 (< 0.01), significantly promoted the mRNA and protein expressions of GPX4 (< 0.01).experiments showed that GLEXG improved sex hormone levels in serum and pathological damage of testicular tissue, significantly decreased the expression of ACSL4 protein in testicular tissue (< 0.01), and significantly promoted the expression of GPX4 protein in testicular tissue (< 0.01).GLEXG can effectively treat oligospermia, and antagonising the occurrence of iron death may be a potential mechanism of action of GLEXG in treatment of oligospermia.

Guilu Erxian Gel; oligospermia; ferroptosis; network pharmacology; experimental verification

R285.5

A

0253 - 2670(2023)20 - 6722 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.20.016

2023-04-27

國家自然科學(xué)基金資助項目（81973863）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（S202010541105，S202210541108）

李 玲（1983—），女，博士研究生，高級實驗師，從事中醫(yī)藥防治感染性疾病的研究。E-mail: liling1049@hnucm.edu.cn

通信作者：何清湖（1965—），男，博士，教授，從事中醫(yī)藥防治男科疾病的研究。E-mail: Hqh19651111@163.com

黃家望（1999—），男，碩士研究生，從事中醫(yī)藥防治感染性疾病的研究。E-mail: 1518522909@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]