消痔丸對巴豆油致肛門腫脹模型大鼠的藥效及作用機制研究

孫 科，李 新，韓彥琪，王春芳, 5，黃澤森, 5，彭亞倩, 5，徐 旭，許 浚，孫 巖，趙專友，張鐵軍*，柴國林*

消痔丸對巴豆油致肛門腫脹模型大鼠的藥效及作用機制研究

孫 科1，李 新2, 3, 4#，韓彥琪2, 3, 4，王春芳2, 3, 4, 5，黃澤森2, 3, 4, 5，彭亞倩2, 3, 4, 5，徐 旭2, 3, 4，許 浚2, 3, 4，孫 巖1，趙專友2, 3, 4，張鐵軍2, 3, 4*，柴國林1*

1. 蘭州佛慈制藥股份有限公司，甘肅 蘭州 730000 2. 天津藥物研究院，天津市中藥質(zhì)量標志物重點實驗室，天津 300462 3. 天津藥物研究院，中藥現(xiàn)代制劑與質(zhì)量控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室，天津 300462 4. 天津藥物研究院，藥物成藥性評價與系統(tǒng)轉(zhuǎn)化全國重點實驗室，天津 300462 5. 天津中醫(yī)藥大學，天津 301617

探討消痔丸對巴豆油誘導大鼠肛門腫脹模型的藥效作用及其作用機制。雄性SD大鼠隨機分為對照組、模型組及消痔丸低、中、高劑量（0.81、1.62、3.24 g/kg）組和柑橘黃酮片（0.27 g/kg）組和痔炎消片（0.86 g/kg）組，每組20只，連續(xù)ig給藥7 d，于給藥第4天，采用巴豆油涂抹肛管誘發(fā)肛門腫脹至72 h，通過測量肛門腫脹面積初步評估各給藥組治療效果；通過采集大鼠血液、肛門直腸組織進行生化指標及組織病理學等檢測，評價消痔丸治療效果及作用機制。與模型組比較，消痔丸組大鼠肛周腫脹、黏液溢出、便秘等癥狀明顯減輕，肛腸指數(shù)和血管通透性均顯著降低（＜0.001），肛門直腸組織鱗狀上皮細胞缺失、炎性細胞浸潤、水腫等現(xiàn)象明顯減少；血中白細胞數(shù)量及中性粒細胞、單核細胞比例顯著降低（＜0.01、0.001），淋巴細胞比例顯著升高（＜0.05）；血清及肛門直腸組織中白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、一氧化氮（nitric oxide，NO）水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）；肛門直腸組織中、、、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，）、、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，）基因表達顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）。消痔丸對巴豆油誘導的急性痔瘡模型治療作用顯著，其對于痔瘡引起的肛門腫脹、炎癥反應(yīng)、直腸血管通透性增加等均有很好的治療效果。

消痔丸；巴豆油；痔?。桓亻T腫脹；炎癥；血管通透性

痔病是一種肛門直腸疾病，定義為正常肛門墊的癥狀性增大和遠端移位。這些軟墊的任何出血、增大和突出以及黏膜脫垂都可能導致病理性痔病。痔病是最常見的直腸疾病，根據(jù)痔瘡所在位置可以分為外痔、內(nèi)痔和混合痔。痔瘡又稱痔核，其實質(zhì)部分主要由擴張、壁薄且充滿滯留血液的異常靜脈組成，靜脈內(nèi)常有血栓形成，此外還常見數(shù)量不等的漿細胞、淋巴細胞、中性粒細胞浸潤及肉芽腫等炎癥變化，表面可有潰瘍形成[1]。臨床常用的治療方法有保守治療、門診手術(shù)治療和外科手術(shù)治療，但手術(shù)治療容易復發(fā)，并伴有不良反應(yīng)。

消痔丸出自《瘍醫(yī)大全》，由地榆（炒炭）、牡丹皮、三顆針皮（炒炭）、大黃（酒炒）、黃芪、白及、槐角（蜜炙）、防己、白術(shù)（炒）、當歸（酒炒）、火麻仁（炒黃）及動物大腸12味中藥組成，具有消腫生肌、清熱潤便、補氣固脫、止血、止痛的功效，主要用于痔疾腫痛、便秘出血、脫肛不收及腸風下血、積滯不化等癥，主治痔瘡。消痔丸在臨床應(yīng)用效果較好，且未見明顯不良反應(yīng)，但其現(xiàn)代藥理機制的闡釋、作用特點挖掘等亟待完善。因此，本研究采用巴豆油建立急性痔瘡大鼠模型，探討消痔丸對急性痔瘡腫脹、炎性因子、致痛因子、血管通透性及機體免疫等方面的影響。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠140只，5周齡，體質(zhì)量180～200 g，由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供，許可證號SCXK（京）2019-0010。動物飼養(yǎng)在天津天誠新藥評價有限公司實驗動物屏障系統(tǒng)［合格證SYXK（津）2021-0008］，溫度、濕度、換氣次數(shù)由中央系統(tǒng)自動控制，溫度維持在20～26 ℃，相對濕度維持在40%～70%，通風次數(shù)為10～15次/h全新風，光照為12 h明、12 h暗。自由攝食飲水。實驗動物經(jīng)天津天誠新藥評價有限公司實驗動物倫理委員會批準（批準號No.2022081601）。

1.2 藥品與試劑

消痔丸（批號210712，0.04 g/丸）由蘭州佛慈制藥股份有限公司提供；柑橘黃酮片［批號2019224，500 mg/片（以總黃酮計）］購自法國施維雅藥廠；痔炎消片（批號220411，0.53 g/片）購自馬應(yīng)龍藥業(yè)集團股份有限公司；巴豆油（批號C13225401）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；伊文思藍（批號C14203506）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號20220806）購自北京索萊寶科技有限公司；一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒（批號061322220801）購自碧云天生物技術(shù)有限公司；大鼠白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號2207271）、大鼠前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）ELISA試劑盒（批號2208251）、大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號2208281）、大鼠IL-1β ELISA試劑盒（批號2208261）均購自上海西唐生物科技有限公司；大鼠γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）ELISA試劑盒（批號KL02RX6V8758）購自美國Immunoway公司；環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，）、、、、、基因引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號63347620）、PowerUp SYBR Green Master Mix（批號50837000）購自瑞士羅氏診斷公司；蘇木素染色液（貨號ZLI-9610）、伊紅染色液（貨號ZLI-9613）購自中杉金橋公司。

1.3 儀器

BC-2800Vet型全自動血液細胞分析儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；SpectraMaxM5型酶標儀（美國MolecularDevices公司）；WD-2103B型自動洗板機（北京六一生物科技有限公司）；BioPhotometer D30型核酸蛋白測定儀（德國Eppendorf公司）；T100型PCR儀（美國Bio-Rad公司）；LightCycler 480型熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）；TP1020型病理脫水機、HistoCore MULTICUT型病理切片機（德國Leica公司）；CKX43型正置光學顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 動物分組、給藥與造模

SD大鼠適應(yīng)期喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組、模型組及消痔丸低、中、高劑量（0.81、1.62、3.24 g/kg，相當于1/2、1、2倍臨床劑量）組及柑橘黃酮片（參照說明書急性發(fā)作期使用方法，即前3 d 0.18 g/kg，后4 d 0.27 g/kg）組和痔炎消片（0.86 g/kg）組，每組20只。每組中10只用于生化指標、病理等檢測，另外10只用于肛門直腸伊文思藍外滲含量檢測。各給藥組ig相應(yīng)藥物，對照組和模型組ig等體積0.1%羧甲基纖維素鈉溶液，1次/d，連續(xù)7 d。第4天給藥1 h后，除對照組外，用浸吸0.16 mL巴豆油混合液的棉簽插入已淺麻醉的大鼠肛門保持13 s，棉簽取出后在肛周均勻涂抹一圈，6 h后可見大鼠肛周組織充血腫脹并有炎性滲出，即造模成功。于末次給藥1 h，造模72 h后進行肛周觀察及取材。

2.2 觀察及檢測指標

2.2.1 肛周形態(tài)觀察及肛門腫脹抑制率測定 觀察、記錄各組大鼠肛周紅腫、黏液分泌、排便不暢、便血等情況。并于造模前（0 h）、造模后72 h分別測量各組大鼠肛門周圍組織的長直徑和短直徑，取其長短兩直徑均值的乘積作為腫脹面積，并計算肛門腫脹抑制率。

肛門腫脹抑制率＝1－(給藥72 h肛周面積－給藥0 h肛周面積)/(模型72 h肛周面積－模型0 h肛周面積)

2.2.2 肛門直腸大體觀察及肛腸指數(shù)測定 末次給藥1 h后，以1%戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采全血于抗凝采血管中，肛周脫毛，棉簽置入肛門內(nèi)作為指引，沿肛周5 mm處環(huán)形分離肛門，深置直腸15 mm處，剪斷直腸，移出標本，剔除周圍結(jié)締組織，縱剖，用冰冷生理鹽水漂洗，濾紙吸干表面水分，行肛門直腸大體觀察后稱定質(zhì)量，計算肛腸指數(shù)，并測量肛門直腸寬度。

肛腸指數(shù)＝肛腸濕質(zhì)量/體質(zhì)量

2.2.3 肛門組織病理學觀察 取部分肛門直腸組織，放入10%甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水、包埋后切片，石蠟切片經(jīng)脫蠟至水、蘇木素-伊紅（HE）染色后脫水封片，于顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

2.2.4 全血白細胞計數(shù)及分類 取抗凝采血管中部分全血，于全血細胞計數(shù)儀上測定白細胞及分類。

2.2.5 肛門組織及血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2、IFN-γ、NO含量測定 取?80 ℃凍存的肛門組織適量，加入適量生理鹽水勻漿至均勻、無明顯組織塊后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清為肛門組織待測樣品。取抗凝采血管中剩余全血，4 ℃、3000 r/min離心10 min，分離得到血清樣品，?80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ「亻T組織上清與血清樣品，按照試劑盒說明書檢測IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2、IFN-γ、NO含量。

2.2.6 qRT-PCR檢測肛門組織中、、、、和mRNA表達 稱取肛門組織適量，采用Trizol法提取總RNA，并按試劑盒要求合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列見表1。

2.2.7 血管通透性檢測 采用伊文思藍法檢測肛門及直腸組織血管通透性[2]。大鼠麻醉后經(jīng)尾靜脈注射2%伊文思藍溶液（40 mg/kg），1 h后移出肛門直腸標本置于10 mL離心管中，加入1 mL甲酰胺溶液（肛門直腸組織∶甲酰胺溶液＝100 mg/mL），55 ℃水浴孵育24 h，離心后取上清測定620 nm處的吸光度（）值，以甲酰胺為空白對照，用不同濃度伊文思藍溶液制作的標準曲線，計算各樣本伊文思藍含量。

2.3 統(tǒng)計學分析

3 結(jié)果

3.1 消痔丸對巴豆油致肛門腫脹模型大鼠肛門直腸的影響

3.1.1 肛周組織形態(tài)觀察及腫脹抑制率 對照組大鼠肛門回縮，無水腫等異常情況。模型組大鼠在造模2 h后肛門可見紅腫，且有少量黏液溢出；5～6 h后肛門腫脹度明顯，肛門潮濕度增加且黏液溢出增多，偶見輕度糜爛；24 h后大鼠肛門出現(xiàn)糞便異常滯留情況，偶見出血點；32 h后出現(xiàn)輕度排便困難，48 h后出現(xiàn)排便嚴重困難情況，72 h仍有糞便異常滯留情況。經(jīng)柑橘黃酮片、痔炎消片和不同劑量消痔丸給藥后可觀察到大鼠肛周腫脹程度降低，黏液分泌、糜爛、便秘及出血等癥狀均得到明顯改善。

表1 引物序列

通過測量各組大鼠肛門腫脹面積，計算得到各給藥組腫脹抑制率（表2），與造模前（0 h）比較，模型組造模后72 h腫脹面積顯著增加（＜0.01）；與模型組72 h比較，各給藥組72 h的腫脹面積均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），其中消痔丸中、高劑量組腫脹抑制率分別為53.21%和60.35%。

3.1.2 肛門直腸大體觀察 對照組大鼠直腸肛管形態(tài)正常，未發(fā)現(xiàn)黏膜出血、水腫和潰瘍；模型組大鼠直腸肛管出血水腫、顏色變淺，糞便積結(jié)滯留于結(jié)腸和直腸、結(jié)腸膨脹變形明顯、直腸增生性肥厚，并明顯失去彈性，直腸橫截面周長明顯增加（＜0.001，表3），說明直腸和肛門肌肉功能受損，腸道運動能力下降且腸壁血液循環(huán)受阻。柑橘黃酮片、痔炎消片與不同劑量的消痔丸干預(yù)后，均能使大鼠肛門直腸組織黏膜損傷減輕、水腫程度降低、組織增厚減輕、直腸橫截面周長降低（＜0.05、0.01、0.001）。

表2 消痔丸對巴豆油致肛門腫脹模型大鼠肛門腫脹的影響(, n = 10)

與模型組0 h比較：##＜0.01；與模型組72 h比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001

##< 0.010 h model group;*< 0.05**< 0.01***< 0.00172 h model group

3.1.3 肛腸指數(shù) 肛腸指數(shù)可在一定程度反映組織腫脹程度，越大代表組織炎癥腫脹程度越高。如表4所示，與對照組比較，模型組大鼠肛腸指數(shù)顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，柑橘黃酮片和痔炎消片與不同劑量的消痔丸均可顯著降低大鼠肛腸指數(shù)（＜0.001）。

表3 消痔丸對巴豆油致肛門腫脹模型大鼠直腸肛管的影響(, n = 10)

與對照組比較：#＜0.05##＜0.01###＜0.001；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01***＜0.001，下表同

#< 0.05##< 0.01###< 0.010control group;*< 0.05**< 0.01***< 0.001model group, same as below tables

表4 消痔丸對巴豆油致肛門腫脹模型大鼠肛腸指數(shù)的影響(, n = 10)

3.2 消痔丸對巴豆油致肛門腫脹模型大鼠血管通透性的影響

局部毛細血管通透性增高可引起大分子血漿蛋白外滲形成組織水腫，一般采用伊文思藍定量檢測將血管通透性準確量化。如表5所示，與對照組比較，模型組大鼠直腸肛管的伊文思藍含量顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，柑橘黃酮片、痔炎消片及不同劑量消痔丸組可顯著降低大鼠直腸肛管的伊文思藍含量（＜0.05、0.01、0.001）。

3.3 消痔丸對巴豆油致肛門腫脹模型大鼠肛門直腸組織病理的影響

如圖1所示，對照組大鼠肛門直腸組織結(jié)構(gòu)正常，腺上皮、鱗狀上皮、黏膜層、黏膜下層、肌層黏膜和肌層完整。模型組大鼠肛門直腸組織黏膜上皮層壞死、丟失，鱗狀上皮、腺上皮、黏膜層和黏膜下層出現(xiàn)充血、水腫，黏膜下層及肌層上層可見大量粒細胞、漿細胞、淋巴細胞等炎性細胞浸潤，炎癥區(qū)黏膜增厚，并伴有血管擴張。不同劑量的消痔丸可明顯改善黏膜下層、肌層水腫、出血，黏膜增厚也明顯改善，并可抑制炎性細胞浸潤至肌層上層，消痔丸低劑量組鱗狀上皮壞死并未得到改善，但消痔丸中高劑量組可改善鱗狀上皮壞死、丟失，提示消痔丸對急性炎癥反應(yīng)具有治療作用。

表5 消痔丸對巴豆油誘導肛門腫脹模型大鼠血管通透性的影響(, n = 10)

紅色箭頭代表炎性細胞浸潤，藍色箭頭代表出血

red arrow indicates inflammatory cell infiltration, blue arrow indicates hemorrhage

圖1 消痔丸對巴豆油誘導肛門腫脹模型大鼠肛門直腸組織病理的影響(HE)

Fig. 1 Effect of Xiaozhi Pills on anorectal tissue pathology of hemorrhoidal rats induced by croton oil preparation (HE)

3.4 消痔丸對巴豆油致肛門腫脹模型大鼠全血白細胞計數(shù)及分類的影響

如表6所示，與對照組比較，模型組大鼠外周血白細胞數(shù)量升高（＜0.001），中性粒細胞和單核細胞比例顯著增加（＜0.001），淋巴細胞比例顯著降低（＜0.01），推測為大鼠肛管經(jīng)巴豆油涂抹后誘導炎癥反應(yīng)，刺激白細胞募集于肛管直腸部位。與模型組比較，柑橘黃酮片與痔炎消片可顯著降低全血中白細胞數(shù)量（＜0.05），降低中性粒細胞與單核細胞比例（＜0.05、0.01）。不同劑量的消痔丸可顯著降低全血中白細胞數(shù)量（＜0.001），降低中性粒細胞與單核細胞比例（＜0.01、0.001），消痔丸中劑量組顯著增加淋巴細胞比例（＜0.05）。

3.5 消痔丸對巴豆油致肛門腫脹模型大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2、IFN-γ、NO水平的影響

如表7所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2、IFN-γ、NO水平均顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，柑橘黃酮片可顯著降低IL-6、IL-1β、TNF-α和PGE2水平（＜0.05），痔炎消片可顯著降低IL-6、TNF-α水平（＜0.05）；不同劑量的消痔丸可顯著降低血清中IL-1β、TNF-α、PGE2、IFN-γ和NO水平（＜0.05、0.01），中、高劑量的消痔丸可顯著降低血清中IL-6水平（＜0.05、0.01）。

3.6 消痔丸對巴豆油致肛門腫脹模型大鼠肛門直腸組織中IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2、IFN-γ、NO水平的影響

如表8所示，與對照組比較，模型組肛門直腸組織中IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2、IFN-γ、NO水平均顯著升高（＜0.01、0.001）；與模型組比較，柑橘黃酮片與痔炎消片可顯著降低肛門直腸組織中IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2、IFN-γ、NO水平（＜0.05、0.01、0.001），不同劑量的消痔丸可顯著降低肛門直腸組織中IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2、NO水平（＜0.05、0.01、0.001），中、高劑量的消痔丸可顯著降低肛門直腸組織中IFN-γ水平（＜0.05、0.01）。

3.7 消痔丸對巴豆油致肛門腫脹模型大鼠肛門組織中IL-6、IL-1β、TNF-α、COX-2、IFN-γ、iNOS mRNA表達的影響

前期研究發(fā)現(xiàn)，巴豆油涂抹肛管及肛周后可誘導炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)在IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2等炎癥因子水平顯著升高，因此，對相關(guān)炎癥因子基因水平的表達進行考察。如表9所示，與對照組比較，模型組、、、、、mRNA表達水平顯著升高（＜0.05、0.01、0.001）；而經(jīng)不同給藥組處理后，各炎癥因子基因表達水平均有不同程度的下降，柑橘黃酮片和痔炎消片可顯著降低肛門直腸組織中、、、、mRNA表達水平（＜0.05、0.01、0.001），不同劑量的消痔丸均可顯著降低IL-1β、、、mRNA表達水平（＜0.05、0.01、0.001），中、高劑量的消痔丸可顯著降低、mRNA表達水平（＜0.01）。

表6 消痔丸對巴豆油誘導肛門腫脹模型大鼠全血白細胞計數(shù)及分類的影響(, n = 10)

表7 消痔丸對巴豆油誘導肛門腫脹模型大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2、IFN-γ、NO水平的影響(, n = 10)

表8 消痔丸對巴豆油誘導肛門腫脹模型大鼠肛管直腸組織中IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2、IFN-γ、NO水平的影響(, n = 10)

表9 消痔丸對巴豆油誘導肛門腫脹模型大鼠肛門直腸組織中IL-6、IL-1β、TNF-α、COX-2、IFN-γ、iNOS mRNA表達的影響(, n = 10)

4 討論

痔瘡最早可見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》之《素問·生氣通天論》，言：“因而飽食，筋脈橫解，腸澼為痔”，指出了痔的病因病機為飲食不節(jié)、筋脈血肉瘀滯松弛和腸澼?，F(xiàn)代醫(yī)學對痔瘡的發(fā)病機制主要有肛墊下移學說、靜脈曲張學說等。肛墊下移學說認為，在腹壓升高等原因下肛墊內(nèi)的結(jié)締組織和黏膜下肌遭到破壞而松弛、斷裂，肛墊失去支持而下移，脫出肛門而為痔瘡[3]。靜脈曲張學說認為，痔瘡形成與痔靜脈叢淤血、擴張和屈曲相關(guān)。由于門靜脈系統(tǒng)無靜脈瓣，人長期處于直立的體位導致了痔靜脈壓力升高，各種原因引起的腹內(nèi)壓升高、門脈高壓可導致痔靜脈曲張[4]。痔瘡作為最常見的肛腸疾病之一，日漸呈現(xiàn)全年齡段發(fā)病趨勢[5]。痔瘡臨床癥狀表現(xiàn)為排便困難、肛周腫脹、疼痛出血等[6]。

痔病是人類特有疾病，痔病動物模型以模擬其病理學特征為目的[7]。目前痔瘡動物模型造模方法較多，如化學試劑（巴豆油、醋酸等）誘導，細菌誘導，肛門周圍皮膚創(chuàng)傷，靜脈曲張等，其中最常用也較為成熟的仍是化學試劑局部刺激方法[1]。研究發(fā)現(xiàn)巴豆油可刺激肛管直腸組織內(nèi)小膠質(zhì)細胞釋放IL-6、TNF-α等炎癥因子，并增加iNOS表達，合成并釋放更多的NO，加速痛覺敏化，導致大鼠肛門腫脹，較為吻合臨床上痔病患者的病理診斷[8-9]，因此本研究采用巴豆油混合液作用于大鼠肛門直腸黏膜，成功構(gòu)建了大鼠急性痔病，表現(xiàn)為肛周腫脹、黏液溢出等肛腸宏觀癥狀，此外伊文思藍含量顯著增加提示巴豆油可引起直腸毛細血管嚴重擴張，同時組織病理的觀察進一步證實了這一點。而消痔丸可顯著改善巴豆油所致大鼠肛周宏觀癥狀，降低肛腸指數(shù)和直腸伊文思藍含量，抑制肛門直腸組織鱗狀上皮細胞的缺失、炎性細胞浸潤、充血等，初步表明消痔丸能減輕巴豆油引起的嚴重水腫、出血及炎癥，改善急性痔病的整體進展。

痔病發(fā)展的確切病理生理學仍未確定，但可能與肛墊的機械損傷、靜脈瘀血、痔神經(jīng)叢或肛腸區(qū)域的血管異常以及組織炎癥有關(guān)，在脫垂或血栓形成的病變中，炎癥反應(yīng)尤其明顯，因此，炎癥可能在痔病的發(fā)病或急性痔瘡癥狀的加重中發(fā)揮作用[10]。據(jù)報道，痔組織中TNF-α、IL-6、COX-2、iNOS等因子的表達高于正常肛墊組織[11]，從而引起局部T細胞異常堆積，引起局部炎性因子分泌和功能失控[12]。現(xiàn)代藥理學研究表明，牡丹皮中丹皮酚是發(fā)揮抗炎作用的主要成分，對由角叉菜、蛋清等致炎劑致大鼠足腫脹、二甲苯性小鼠耳廓腫脹和內(nèi)毒素所致腹腔毛細血管通透性升高等均有明顯抑制作用，可抑制大鼠白細胞炎性趨向性和PGE2合成，并顯示出明顯的外周及中樞鎮(zhèn)痛作用[13]。酒大黃可更有效降低肺炎大鼠血白細胞數(shù)與TNF-α水平，減少肺泡炎性滲出，抗菌消炎作用增強[14]?；苯屈S酮可顯著抑制二甲苯所致小鼠耳廓腫脹以及小鼠濾紙肉芽腫、角叉菜膠引起的大鼠足腫脹，并降低腹腔毛細血管通透性，還可下調(diào)脂多糖刺激的RAW264.7巨噬細胞中IL-6水平，抑制NO和PGE2釋放，表現(xiàn)出良好的抗炎活性[15]。同時方中白及收斂止血、消腫生肌；防己祛風止痛、利水消腫；白術(shù)健脾益氣、燥濕利水，為發(fā)揮消腫作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。研究表明，白及多糖能刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞的增殖和血管內(nèi)皮生長因子的表達，還可刺激巨噬細胞iNOS、TNF-α和IL-1β的表達，從而促進傷口愈合，發(fā)揮消腫生肌作用[16]。防己黃芪湯能降低水通道蛋白2含量，減少液體積聚于組織間隙或體腔內(nèi)，從而發(fā)揮利水作用[17]。白術(shù)多糖一方面可通過非Toll樣受體4依賴性絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子-κB信號通路誘導脾細胞激活，促進NO、免疫球蛋白G和細胞因子的分泌，另一方面可顯著提高IEC-6細胞中多胺含量、胞質(zhì)中Ca2+水平，激活多胺-kv1.1信號通路，促進腸上皮細胞的遷移，促進腸損傷的愈合[18]，從而發(fā)揮健脾燥濕利水作用。本研究表明消痔丸可顯著降低血液中白細胞數(shù)量及中性粒細胞、單核細胞比例，顯著降低血清及肛門直腸組織中致炎及致痛因子IL-6、IL-1β、TNF-α、PGE2、IFN-γ、NO的含量，抑制肛門直腸組織中、、、、、mRNA的表達水平。

綜上，消痔丸可明顯改善巴豆油誘導的肛門直腸組織損傷，主要通過抑制IL-6、TNF-α、PGE2等相關(guān)炎癥及致痛細胞因子和調(diào)節(jié)其相應(yīng)的靶基因發(fā)揮治療痔病腫痛、炎癥和便秘出血等作用，并且本研究發(fā)現(xiàn)消痔丸中劑量（相當于臨床劑量）對急性痔病的改善具有劑量優(yōu)勢，為臨床應(yīng)用奠定一定的藥理研究基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Pharmacodynamic effect and mechanism of Xiaozhi Pills in croton oil preparation induced hemorrhoidal model in rats

SUN Ke1, LI Xin2, 3, 4, HAN Yan-qi2, 3, 4, WANG Chun-fang2, 3, 4, 5, HUANG Ze-sen2, 3, 4, 5, PENG Ya-qian2, 3, 4, 5, XU Xu2, 3, 4, XU Jun2, 3, 4, SUN Yan1, ZHAO Zhuan-you2, 3, 4, ZHANG Tie-jun2, 3, 4, CHAI Guo-lin1

1. Lanzhou Foci Pharmaceutical Co., Ltd., Lanzhou 730000, China 2. Tianjin Key Laboratory of Quality Marker of Traditional Chinese Medicine, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 3. National & Local United Engineering Laboratory of Modern Preparation and Quality Control Technology of Traditional Chinese Medicine, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 4. National Key Laboratory of Druggability Evaluation and Systematic Translational Medicine, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 5. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China

To explore the pharmacodynamic effect and mechanism of Xiaozhi Pills (消痔丸) on croton oil preparation induced hemorrhoidal rats model.Male SD rats were randomly grouped into control group, model group, Xiaozhi Pills low-, medium-, high-dose (0.81, 1.62, 3.24 g/kg) groups, Citrus Bioflavonoids Tablets (柑橘黃酮片, 0.27 g/kg) group and Zhiyanxiao Tablets (痔炎消片, 0.86 g/kg) group, with 20 rats in each group. Rats were continuous ig administration for 7 d, on 4th day of administration, croton oil preparation was applied to the anal canal to induce anal swelling for 72 h. The treatment effect of each treatment group was preliminarily evaluated by measuring the area of anal swelling; Blood and anorectal tissues of rats were collected for biochemical indicators and histopathology tests to evaluate the therapeutic effect and mechanism of Xiaozhi Pills.Compared with model group, the symptoms of perianal swelling, mucus overflow and constipation in Xiaozhi Pills group were significantly reduced, anorectal index and vascular permeability were significantly decreased (< 0.001); The absence of squamous epithelial cells, inflammatory cell infiltration and edema in anal and rectal tissues were significantly reduced. The number of white blood cells and proportion of neutrophils and monocytes in blood were significantly decreased (< 0.01, 0.001), while the proportion of lymphocytes was significantly increased (< 0.05). Levels of interleukin-6 (IL-6), IL-1β, tumor necrosis factor-α (TNF-α), prostaglandin E2(PGE2), interferon-γ (IFN-γ) and nitric oxide (NO) in serum and anorectal tissue were significantly reduced (< 0.05, 0.01, 0.001);,,, cyclooxygenase-2 (),and inducible nitric oxide synthase () gene expressions in anal and rectal tissues were significantly reduced (< 0.05, 0.01, 0.001).Xiaozhi Pills has a significant therapeutic effect on croton oil preparation induced acute hemorrhoids model, and it has a good therapeutic effect on anal swelling, inflammatory reaction, rectal vascular permeability increase caused by hemorrhoids.

Xiaozhi Pills; croton oil preparation; hemorrhoidal disease; hemorrhoidal swelling; inflammation; vascular permeability

R285.5

A

0253 - 2670(2023)20 - 6734 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.20.017

2023-02-02

國家自然科學基金重點項目（U21A20406）；蘭州市人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目（2022-RC-2）

孫 科（1990—），男，碩士，工程師，研究方向為中藥學。E-mail: skwind@163.com

通信作者：張鐵軍，研究員，主要研究方向中藥新藥開發(fā)及大品種二次開發(fā)研究。E-mail: zhangtj@tjipr.com

柴國林，正高級工程師，主要研究方向中藥研發(fā)及中藥質(zhì)量控制。E-mail: 3136174195@qq.com

李 新（1992—），女，碩士，助理研究員，研究方向為天然產(chǎn)物及中藥復方藥理及機制探討。E-mail: lix6@tjipr.com

[責任編輯 李亞楠]