基于HPLC指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的加味四逆散（顆粒）質(zhì)量標(biāo)志物分析及含量測(cè)定方法的建立

陳靜梅，李澤宇，梁秋明，岳子俊，唐佐偉，郝二偉，杜正彩，侯小濤*，鄧家剛

基于HPLC指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的加味四逆散（顆粒）質(zhì)量標(biāo)志物分析及含量測(cè)定方法的建立

陳靜梅1, 2, 3, 4，李澤宇2, 3, 4, 5，梁秋明6，岳子俊1，唐佐偉1，郝二偉2, 3, 4, 5，杜正彩2, 3, 4, 5，侯小濤1, 2, 3, 4*，鄧家剛2, 3, 4, 5

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200 2. 廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530200 3. 廣西農(nóng)作物廢棄物功能成分研究協(xié)同創(chuàng)新中心，廣西 南寧 530200 4. 廣西中醫(yī)濕病方藥理論與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530200 5. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)廣西中醫(yī)藥科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，廣西 南寧 530200 6. 廣西欽州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 欽州 535000

基于指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析預(yù)測(cè)加味四逆散（Jiawei Sini Powder，JSP）（顆粒）潛在的質(zhì)量標(biāo)志物（quality markers，Q-Marker），并對(duì)Q-Marker成分進(jìn)行含量測(cè)定，為其質(zhì)量控制提供參考。采用HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)分析JSP（顆粒）潛在Q-Marker。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建物質(zhì)-效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步分析預(yù)測(cè)JSP（顆粒）藥效關(guān)聯(lián)的Q-Marker，并建立對(duì)預(yù)測(cè)得到的標(biāo)志性成分進(jìn)行含量測(cè)定的HPLC方法。建立了JSP（顆粒）的HPLC指紋圖譜，標(biāo)記28個(gè)共有峰，對(duì)其進(jìn)行峰歸屬，其中1、9、11號(hào)峰來(lái)自白芍，26、27號(hào)峰來(lái)自枳實(shí)，13、28號(hào)峰來(lái)自炙甘草，2、4、10、12、16、24號(hào)峰來(lái)自代代花，15、17、22號(hào)峰來(lái)自半枝蓮，25號(hào)峰來(lái)自白芍和炙甘草共有，3、5～8、14、18～21、23號(hào)峰來(lái)自枳實(shí)和代代花共有，并指認(rèn)了其中的9個(gè)共有峰，分別為芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、野黃芩苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、甘草酸銨。相似度評(píng)價(jià)顯示，10批JSP（顆粒）樣品的相似度為0.954～1.000。主成分分析（principal component analysis，PCA）顯示前4個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為95.003%，正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）顯示有12個(gè)成分變量重要性投影（variable importance projection，VIP）值較大。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析得出芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷5個(gè)成分可能為JSP（顆粒）潛在的Q-Marker。同時(shí)測(cè)定以上5個(gè)成分的含量，方法學(xué)考察結(jié)果良好，平均加樣回收率為92.52%～96.48%，RSD為1.3%～2.6%。10批樣品中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.107 6～0.203 6、0.475 9～1.204 6、2.310 9～5.223 8、0.410 3～0.796 8、4.311 9～8.343 3 mg/g。建立了JSP（顆粒）的HPLC指紋圖譜，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)出5個(gè)Q-Marker成分及建立其定量測(cè)定方法，為JSP（顆粒）研制成古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑提供質(zhì)量控制依據(jù)。

加味四逆散；質(zhì)量標(biāo)志物；HPLC；指紋圖譜；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；主成分分析；正交偏最小二乘-判別分析；芍藥內(nèi)酯苷；芍藥苷；柚皮苷；橙皮苷；新橙皮苷

胃痛是以胃脘部近歧骨處疼痛為主要癥狀的一種病證[1]。胃脘部疼痛是其主要的臨床表現(xiàn)[2]，多發(fā)病于青中年階段，占到總發(fā)病人群的65%左右，幼兒和老年人較少，且無(wú)顯著的性別差異[3]。近年來(lái)，中醫(yī)應(yīng)用于此病的臨床效果卓見(jiàn)成效，利用中醫(yī)辨證論治的理念，并依據(jù)病情需要進(jìn)行臨床加減，可減輕胃痛，改善患者生活質(zhì)量，安全性高，值得推廣。加味四逆散（Jiawei Sini Powder，JSP）是在全國(guó)第6批老中醫(yī)藥專(zhuān)家學(xué)術(shù)思想傳承工作指導(dǎo)老師鄧家剛教授指導(dǎo)下，在漢代張仲景經(jīng)典名方四逆散中柴胡、白芍［芍藥］、枳實(shí)、炙甘草的基礎(chǔ)上增加2味藥物，即代代花、半枝蓮而形成的，共6味藥材組成。代代花理氣寬胸、和胃止嘔，半枝蓮清熱解毒、活血化瘀、消腫止痛，整個(gè)方劑的功效概括為“疏肝解郁，理氣止痛”，主要用于中醫(yī)肝脾氣郁證之胃痛、脅痛等多種病癥[4-7]。該方長(zhǎng)期在臨床應(yīng)用，取得滿(mǎn)意效果。目前，尚未有對(duì)JSP整體性狀控制方面的研究，建立與完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有重要的意義。劉昌孝院士[8-11]提出的質(zhì)量標(biāo)志物（quality markers，Q-marker）的概念，旨在建立中藥全程質(zhì)量控制及質(zhì)量溯源體系。而中藥指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)研究，可以在整體觀的基礎(chǔ)上篩選出最能反映中藥質(zhì)量的標(biāo)志性成分[12-13]；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)多基因、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)與中醫(yī)藥多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)有異曲同工之妙，在中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究中具有較高的應(yīng)用價(jià)值[14-16]。因此，本研究以JSP顆粒劑為研究對(duì)象，將HPLC指紋圖譜與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合，并應(yīng)用相似度評(píng)價(jià)軟件和化學(xué)計(jì)量學(xué)手段，預(yù)測(cè)其發(fā)揮藥效的潛在Q-Marker，進(jìn)而采用HPLC技術(shù)對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，可以更加系統(tǒng)、全面地對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制，以期為JSP研制成古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑提供質(zhì)量控制依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters-HPLC型高效液相色譜儀，沃特世科技有限公司；SQP型十萬(wàn)分之一電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SB25-12D型超聲儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；DZKW-D-6型電熱恒溫水浴鍋，北京市光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.2 材料

1.2.1 試藥 色譜純乙腈、甲醇，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；磷酸為色譜級(jí)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余均為分析純，水為超純水。

1.2.2 對(duì)照品 芍藥苷（批號(hào)110736-202145）、柚皮苷（批號(hào)110722-202116）、橙皮苷（批號(hào)110721- 202019）、新橙皮苷（批號(hào)111857-201804）、甘草苷（批號(hào)111610-201908）、野黃芩苷（批號(hào)110842- 202010）、甘草酸銨（批號(hào)110731-202122）對(duì)照品均購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；芍藥內(nèi)酯苷（批號(hào)MUST-20131601）、柚皮素（批號(hào)MUST-20032406）對(duì)照品均購(gòu)買(mǎi)于成都曼思特生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%；JSP（顆粒），批號(hào)S211003、S211004、S211005、S211006、S211007、S211008、S211009、S221101、S221102、S221103，依次編號(hào)S1～S10，來(lái)自廣西大海陽(yáng)光藥業(yè)有限公司，規(guī)格為15 g/袋。

2 方法與結(jié)果

2.1 JSP（顆粒）的HPLC指紋圖譜研究

2.1.1 供試品溶液的制備 取JSP（顆粒）2 g，精密稱(chēng)定，置于錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲提取1.5 h，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取各對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加70%甲醇分別制成含芍藥內(nèi)酯苷1 mg/g、芍藥苷2 mg/g、甘草苷1 mg/g、野黃芩苷1 mg/g、柚皮苷3 mg/g、橙皮苷1 mg/g、新橙皮苷3 mg/g、柚皮素1 mg/g、甘草酸銨1 mg/g的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別吸取以上9種對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加70%甲醇制成不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 單味藥材溶液的制備 按JSP（顆粒）處方比例分別稱(chēng)取柴胡、白芍、枳實(shí)、炙甘草、代代花、半枝蓮藥材，按“2.1.1”項(xiàng)下方法分別制備單味藥材溶液。

2.1.4 色譜條件 色譜柱為X Select?HSS T3 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液；梯度洗脫條件：0～10 min，5%～7%乙腈；10～15 min，7%～10%乙腈；15～30 min，10%～12.5%乙腈；30～40 min，12.5%～17%乙腈；40～45 min，17%～18%乙腈；45～50 min，18%乙腈；50～60 min，18%～20.5%乙腈；60～68 min，20.5%～21%乙腈；68～70 min，21%～24%乙腈；70～80 min，24%～28%乙腈；80～85 min，28%～35%乙腈；85～90 min，35%～40%乙腈；90～100 min，40%～55%乙腈；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為240 nm。

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取同一批次JSP（顆粒）樣品（S1），按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄各共有峰的保留時(shí)間和峰面積，以柚皮苷為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。28個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別小于0.30%和2.80%，表明儀器和實(shí)驗(yàn)方法精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次JSP（顆粒）樣品（S1），按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液1份，分別于室溫放置2、4、8、12、16、24 h后，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄各共有峰的保留時(shí)間和峰面積，以柚皮苷為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。28個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別小于0.53%和3.00%，表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次JSP（顆粒）樣品（S1），按“2.1.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄各共有峰的保留時(shí)間和峰面積，以柚皮苷為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。28個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別小于0.97%和2.90%，表明該提取方法的重復(fù)性良好。

2.1.8 指紋圖譜的建立及相似度分析 取10批JSP（顆粒）樣品（S1～S10），按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下測(cè)定方法分析供試品溶液，并記錄生成HPLC圖。采用“中藥色譜指紋譜圖相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）”對(duì)上述譜圖進(jìn)行處理分析，以色譜圖S1為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗為0.1 min，對(duì)10批JSP（顆粒）樣品（S1～S10）的指紋圖譜進(jìn)行擬合生成對(duì)照指紋圖譜（R），根據(jù)峰面積的穩(wěn)定性和分離度共標(biāo)定了28個(gè)共有峰，以柚皮苷為參照峰，結(jié)果見(jiàn)圖1。10批JSP（顆粒）樣品（S1～S10）的指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜自動(dòng)匹配，其相似度為0.954～1.000，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.9 共有峰的歸屬與指認(rèn) 取“2.1.1”“2.1.2”“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、單味藥材溶液，按“2.1.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，通過(guò)比較各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間、紫外吸收光譜圖以及單味藥材色譜圖，確定了JSP（顆粒）中28個(gè)共有峰（1～28）在6味藥材中的歸屬，結(jié)果見(jiàn)圖2、3和表2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，1、9、11號(hào)峰來(lái)自白芍，26、27號(hào)峰來(lái)自枳實(shí)，13、28號(hào)峰來(lái)自炙甘草，2、4、10、12、16、24號(hào)峰來(lái)自代代花，15、17、22號(hào)峰來(lái)自半枝蓮，25號(hào)峰來(lái)自白芍和炙甘草共有，3、5～8、14、18～21、23號(hào)峰來(lái)自枳實(shí)和代代花共有。通過(guò)對(duì)照品比對(duì)保留時(shí)間和最大吸收波長(zhǎng)，確定了其中的9個(gè)成分，即9（芍藥內(nèi)酯苷）、11（芍藥苷）、13（甘草苷）、17（野黃芩苷）、19（柚皮苷）、20（橙皮苷）、21（新橙皮苷）、26（柚皮素）、28（甘草酸銨）號(hào)峰。

圖1 10批JSP (顆粒) 樣品(S1～S10)的HPLC指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜(R)

表1 10批JSP(顆粒)指紋圖譜相似度計(jì)算結(jié)果

圖2 共有峰的藥材歸屬HPLC圖

9-芍藥內(nèi)酯苷 11-芍藥苷 13-甘草苷 17-野黃芩苷 19-柚皮苷 20-橙皮苷 21-新橙皮苷 26-柚皮素 28-甘草酸銨

2.2 主成分分析（principal component analysis，PCA）

將10批胃痛顆粒指紋圖譜共有峰的峰面積為變量，導(dǎo)入SPSS 26.0軟件，以特征值＞1為提取標(biāo)準(zhǔn)，得到4個(gè)主成分，累積方差貢獻(xiàn)率為95.003%。說(shuō)明前4個(gè)成分可以反映JSP指紋圖譜中的大部分化學(xué)信息。通過(guò)Kaiser標(biāo)準(zhǔn)化的正交旋轉(zhuǎn)法，處理得到旋轉(zhuǎn)后的成分得分系數(shù)矩陣。各色譜峰系數(shù)反映了成分貢獻(xiàn)率大小，排名前8的成分分別為峰24、23、22、28（甘草酸銨）、26（柚皮素）、27、13（甘草苷）。

表2 JSP (顆粒)共有峰歸屬

2.3 正交偏最小二乘-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）

在PCA分組的基礎(chǔ)上，以10批樣品中28個(gè)共有峰面積為原始數(shù)據(jù)，導(dǎo)入SIMCA-P13.0軟件，進(jìn)行OPLS-DA建模分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。從模型驗(yàn)證的參數(shù)圖可知，模型的穩(wěn)定性和交叉驗(yàn)證的預(yù)測(cè)力都較高（2＝0.852，R2＝0.993，R2＝0.986），說(shuō)明所建立的OPLS-DA模型可以很好地用于不同批次間JSP的分析。

圖4 10批JSP(顆粒)的OPLS-DA得分散點(diǎn)圖

為了進(jìn)一步確認(rèn)對(duì)樣品分類(lèi)貢獻(xiàn)度較大的成分，采用OPLS-DA中變量重要性投影值（variable importance projection，VIP）篩選差異性標(biāo)志物，結(jié)果見(jiàn)圖5。按VIP值由大到小篩選出組間具有差異的標(biāo)志性成分，VIP值越大，成分對(duì)樣品分類(lèi)貢獻(xiàn)越大。由圖可知前15名VIP值較大，分別為峰18、27、13（甘草苷）、17（野黃芩苷）、20（橙皮苷）、11（芍藥苷）、10、14、21（新橙皮苷）、19（柚皮苷）、16、9（芍藥內(nèi)酯苷）、1、7、4。

圖5 10批JSP(顆粒)中28個(gè)共有峰的VIP值

2.4 基于物質(zhì)-效應(yīng)關(guān)聯(lián)的JSP（顆粒）核心成分篩選分析

2.4.1 成分與疾病交集靶點(diǎn)的獲取 綜合考慮JSP的HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)果，以及基于可測(cè)性及可溯性的原則，共篩選出潛在芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、野黃芩苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、甘草酸銨9個(gè)指標(biāo)性成分作為候選成分。在swiss target prediction數(shù)據(jù)庫(kù)獲取這9個(gè)指標(biāo)性成分的作用靶點(diǎn)，并結(jié)合中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP），確定特征圖譜鑒定出的有效作用靶點(diǎn)。除甘草酸銨無(wú)有效作用靶點(diǎn)外，經(jīng)過(guò)Uniport數(shù)據(jù)庫(kù)統(tǒng)一校正去重后共得到成分靶點(diǎn)183個(gè)。以“stomachache”“hypochondriac pain”“gastritis”為關(guān)鍵詞檢索與胃痛疾病相關(guān)的基因，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取疾病作用靶點(diǎn)1581個(gè)。最終取藥物成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)交集，得到55個(gè)JSP治療胃痛相關(guān)疾病的潛在作用靶點(diǎn)（圖6）。

2.4.2 蛋白與蛋白相互作用（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)關(guān)系的構(gòu)建與關(guān)鍵靶點(diǎn)分析 將成分與疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING軟件中進(jìn)行PPI分析，物種限定為“Homo sapiens”。以置信度＞0.9作為篩選條件，隱藏?zé)o關(guān)聯(lián)性的點(diǎn)位，得到核心PPI網(wǎng)絡(luò)，將網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytocape 3.8.2軟件中進(jìn)行可視化分析，包括度值（degree）、介數(shù)中心性（betweenness centrality）、接近中心度（closeness centrality）的數(shù)值分析，詳細(xì)分析圖及拓?fù)洚悩?gòu)參數(shù)如圖7和表3所示。篩選得到的核心互作蛋白包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）等。

圖6 成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的韋恩圖

圖7 PPI核心網(wǎng)絡(luò)圖

表3 PPI核心拓?fù)洚悩?gòu)參數(shù)信息

2.4.3 基因本體論（gene ontology，GO）生物功能注釋與京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集 將JSP治療胃痛相關(guān)疾病的核心靶點(diǎn)信息導(dǎo)入Metascape平臺(tái)和David平臺(tái)進(jìn)行功能和信號(hào)通路分析，依據(jù)＜0.01，涉及靶點(diǎn)數(shù)量≥3，富集因子＞1.5的條件篩選出關(guān)鍵作用通路，結(jié)合核心作用通路的有效作用靶點(diǎn)，得到KEGG富集分析-核心靶點(diǎn)-通路作用圖（圖8）。分析結(jié)果顯示，JSP治療胃痛相關(guān)疾病作用靶點(diǎn)主要富集在Ras信號(hào)通路（Ras signaling pathway）、磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路、松弛素信號(hào)通路（Relaxin signaling pathway）、Rap1信號(hào)通路（Rap1 signaling pathway）等，提示這些經(jīng)典通路可能在JSP治療胃痛相關(guān)疾病作用中發(fā)揮著重要作用。

JSP治療胃痛相關(guān)疾病在體內(nèi)的作用位置和生物過(guò)程見(jiàn)GO分析圖（圖9）。生物學(xué)過(guò)程（biological processes，BP）富集分析提示，細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性的調(diào)控在JSP治療胃痛相關(guān)疾病中比較重要；細(xì)胞組分（cellular component，CC）富集分析表明，靶點(diǎn)的產(chǎn)物可能主要在細(xì)胞外基質(zhì)、薄膜側(cè)面、血小板α顆粒部位；分子功能（molecular function，MF）富集分析表明，靶點(diǎn)可能是通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白激酶活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性等發(fā)揮作用。

2.4.4 物質(zhì)-效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 為了進(jìn)一步確定JSP的關(guān)鍵效應(yīng)物質(zhì)，為后續(xù)成分定量及相關(guān)方法學(xué)檢測(cè)分析做鋪墊，擬通過(guò)構(gòu)建物質(zhì)-效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)確定最為核心的效應(yīng)成分。篩選原則是基于以上的作用靶點(diǎn)及作用通路分析，選出作用最強(qiáng)的前10條作用通路，并與相匹配的作用靶點(diǎn)及成分一一對(duì)應(yīng)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape軟件中，根據(jù)節(jié)點(diǎn)度值的連接強(qiáng)度確定核心效應(yīng)物質(zhì)（圖10）。研究發(fā)現(xiàn)芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷的連接強(qiáng)度較大，表明這5種物質(zhì)相對(duì)來(lái)說(shuō)對(duì)應(yīng)更強(qiáng)的效應(yīng)。

2.4.5 Q-Marker的分析 通過(guò)建立JSP的HPLC指紋圖譜，共標(biāo)定了28個(gè)共有峰，指認(rèn)了9個(gè)化學(xué)成分，再根據(jù)PCA和OPLS-DA結(jié)果可知，PCA中對(duì)主成分貢獻(xiàn)較大的前8名色譜峰分別為峰24、23、22、28（甘草酸銨）、26（柚皮素）、27、13（甘草苷），OPLS-DA中VIP值前15名色譜峰分別為峰18、27、13（甘草苷）、17（野黃芩苷）、20（橙皮苷）、11（芍藥苷）、10、14、21（新橙皮苷）、19（柚皮苷）、16、9（芍藥內(nèi)酯苷）、1、7、4。綜合考慮JSP的HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)結(jié)果，以及基于可測(cè)性及可溯性的原則，剔除未知色譜峰，共篩選出芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、野黃芩苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、甘草酸銨9個(gè)指標(biāo)性成分作為候選成分。將9個(gè)候選成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，構(gòu)建物質(zhì)-效應(yīng)的網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步分析JSP的潛在Q-Marker。在物質(zhì)-效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建中，其主要靶點(diǎn)為EGFR、轉(zhuǎn)化蛋白p21/H-Ras-1（transforming protein p21/H-Ras-1，HRAS）、人絲裂原激活蛋白激酶激酶1（recombinant mitogen activated protein kinase 1，MAP2K1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）等靶點(diǎn)；主要通路為癌癥相關(guān)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、Ras信號(hào)通路（Ras signaling pathway）等。主要的靶點(diǎn)和信號(hào)通路與治療胃痛相關(guān)疾病均有一定聯(lián)系，如PI3K/Akt信號(hào)通路參與胃黏膜上皮重建、促進(jìn)胃部腫瘤的發(fā)生發(fā)展[17]。實(shí)驗(yàn)研究表明，PI3K/Akt通路能夠調(diào)控萎縮性胃炎和胃癌胃黏膜的損傷程度，當(dāng)PI3K激活后，在細(xì)胞質(zhì)膜上產(chǎn)生磷脂酰肌醇三磷酸酯，該蛋白與信號(hào)蛋白Akt和磷酸肌醇依賴(lài)性激酶1結(jié)合，后者在細(xì)胞中含有PH結(jié)構(gòu)域，導(dǎo)致Akt激活，從而調(diào)節(jié)胃黏膜細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[18]。由網(wǎng)絡(luò)圖可知芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷的連接強(qiáng)度較大，表明這5種物質(zhì)相對(duì)來(lái)說(shuō)對(duì)應(yīng)更強(qiáng)的效應(yīng)。

圖8 KEGG富集分析-核心靶點(diǎn)-通路作用圖

圖9 GO富集分析圖

圖10 物質(zhì)-效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)圖

有文獻(xiàn)報(bào)道，以芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷為代表的單萜及其苷類(lèi)成分具有鎮(zhèn)痛、抗炎的作用，是白芍中公認(rèn)的藥效物質(zhì)，以前者含有量最高，為質(zhì)量控制指標(biāo)成分[19-20]。橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷等黃酮類(lèi)成分具有胃排空、改善大鼠的胃潰瘍癥狀及抗炎鎮(zhèn)痛等作用[21-22]；枳實(shí)中柚皮苷和新橙皮苷被預(yù)測(cè)為Q-Marker[23]。研究表明[6]，代代花中含有豐富的揮發(fā)油、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等二氫黃酮類(lèi)成分，具有抗炎、抗病毒、促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)等藥理作用。

綜上所述，通過(guò)指紋圖譜和化學(xué)計(jì)量學(xué)分析所獲得的9個(gè)指標(biāo)性成分可通過(guò)作用于多靶點(diǎn)、干預(yù)多條通路發(fā)揮藥效作用，說(shuō)明指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)所選的指標(biāo)成分具有合理性。而從物質(zhì)-效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)中可知，9個(gè)指標(biāo)性成分中，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷的連接強(qiáng)度較大，表明這5種物質(zhì)相對(duì)來(lái)說(shuō)對(duì)應(yīng)更強(qiáng)的效應(yīng)。因此，綜合有效性、可測(cè)性和可溯源性原則，確定芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷為JSP的潛在Q-Marker，可作為JSP的檢測(cè)成分。

2.5 JSP（顆粒）中5個(gè)成分含量測(cè)定

2.5.1 供試品溶液的制備 制備方法同“2.1.1”項(xiàng)。

2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 取各對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加70%甲醇分別制成含芍藥內(nèi)酯苷1 mg/mL、芍藥苷2 mg/mL、柚皮苷3 mg/mL、橙皮苷1 mg/mL、新橙皮苷3 mg/mL的單一對(duì)照品儲(chǔ)備液：分別吸取以上5種對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加70%甲醇制成不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。

2.5.3 陰性樣品溶液的制備 按JSP（顆粒）處方工藝分別制備缺白芍陰性、缺枳實(shí)、代代花的陰性樣品，按“2.1.1”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.5.4 色譜條件 色譜柱為X Select?HSS T3 C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液；梯度洗脫條件：0～10 min，2%～3%乙腈；10～15 min，3%～14%乙腈；15～25 min，14%～19.5%乙腈；25～35 min，19.5%～21.5%乙腈；35～45 min，21.5%～22%乙腈；45～47 min，22%～42%乙腈；47～55 min，42%～50%乙腈；55～58 min，50%乙腈；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣體積10 μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。

2.5.5 系統(tǒng)適用性與專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取“2.5.1”～“2.5.3”項(xiàng)下的供試品溶液、混合對(duì)照品溶液和陰性樣品溶液，按“2.5.4”項(xiàng)下液相色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果如圖11所示，5種指標(biāo)成分色譜峰于其相鄰色譜峰之間的分離度均＞1.5，各陰性樣品溶液色譜圖在待測(cè)成分出峰位置無(wú)干擾，表明該方法下5種成分專(zhuān)屬性良好。

1-芍藥內(nèi)酯苷 2-芍藥苷 3-柚皮苷 4-橙皮苷 5-新橙皮苷

2.5.6 線(xiàn)性關(guān)系考察 將“2.5.2”項(xiàng)下制成的5個(gè)質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.5.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并記錄5種成分的峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），以峰面積為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行線(xiàn)性回歸，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并得到相關(guān)系數(shù)和線(xiàn)性范圍，結(jié)果分別為芍藥內(nèi)酯苷＝11 338 712.0＋8 780.3，＝1.000 0，線(xiàn)性范圍3.571～238.000 μg/mL；芍藥苷＝13 110 958.8＋59 875.4，＝0.999 7，線(xiàn)性范圍12.60～492.00 μg/mL；柚皮苷＝25 184 174.0＋145 092.5，＝1.000 0，線(xiàn)性范圍254.0～1 222.0 μg/mL；橙皮苷＝23 394 991.5－108 034.5，＝0.999 6，線(xiàn)性范圍6.144～400.000 μg/mL；新橙皮苷＝24 395 012.9－122 447.7，＝0.999 9，線(xiàn)性范圍56.83～1 820.00 μg/mL；結(jié)果表明5種成分在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系均良好。

2.5.7 精密度試驗(yàn) 取樣品（S1）約2 g，按“2.5.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算各成分RSD值。結(jié)果顯示，5種成分芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的峰面積RSD分別為0.9%、0.4%、0.6%、0.6%、0.5%，表明儀器精密度良好。

2.5.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品（S1）約2 g，按“2.5.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后，按“2.5.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算各成分RSD值。結(jié)果顯示，5種成分芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的峰面積RSD分別為1.7%、0.7%、0.3%、0.5%、0.4%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次的樣品（S1），每份約2 g，按“2.5.1”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.5.4”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算各成分含量及其RSD值。結(jié)果顯示，5種成分芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.7%、0.7%、0.3%、0.5%、0.4%，表明提取方法的重復(fù)性良好。

2.5.10 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批次已測(cè)定5種成分含量的樣品（S1）6份，每份1.0 g，精密稱(chēng)定，分別加入具塞錐形瓶中，精密加入1 mL混合對(duì)照品溶液（與樣品中5種待測(cè)成分相同含量的混合對(duì)照品溶液），按“2.5.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算6份供試品平均加樣回收率及RSD值。結(jié)果顯示，芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均加樣回收率分別為95.23%、96.48%、92.52%、94.26%、93.96%，RSD分別為2.6%、0.95%、2.0%、1.4%、1.3%，表明提取方法的準(zhǔn)確度良好。

2.5.11 供試品含量測(cè)定 取10批JSP（顆粒）樣品（S1～S10）各2 g，按“2.5.1”項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，按“2.5.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品中5種成分平均含量，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示10批JSP（顆粒）樣品（S1～S10）中成分芍藥內(nèi)酯苷在0.107 6～0.203 6 mg/g、芍藥苷在0.475 9～1.204 6 mg/g、柚皮苷在2.310 9～5.223 8 mg/g、橙皮苷在0.410 3～0.796 8 mg/g、新橙皮苷在4.311 9～8.343 3 mg/g，10批樣品中5種成分平均含量波動(dòng)范圍不大，制備工藝穩(wěn)定。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)基于Q-Marker可測(cè)、特有、有效、傳遞及配伍“五原則”，首先采用HPLC建立JSP（顆粒）指紋圖譜，篩選出28個(gè)共有峰，確定了28個(gè)共有峰在6味藥材中的歸屬，并結(jié)合PCA及OPLS-DA和可測(cè)性，篩選出9個(gè)候選Q-Marker，分別為芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、甘草苷、野黃芩苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柚皮素、甘草酸銨。隨后采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從有效性方面對(duì)9個(gè)可能的標(biāo)志物成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及相關(guān)通路的富集，涉及的靶點(diǎn)和通路與治療胃痛相關(guān)癥狀有關(guān)，主要包括VEGFA、EGFR、TNF、SRC、HRAS、BCL2L1、PTGS2等核心靶點(diǎn)，富集的通路包括Ras signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、Relaxin signaling pathway、Rap1 signaling pathway等，最終預(yù)測(cè)得到5個(gè)Q-Marker成分，建立其HPLC含量測(cè)定方法。

表4 10批JSP (顆粒) 中5個(gè)成分的含量測(cè)定結(jié)果(n = 3)

建立JSP（顆粒）的指紋圖譜，從整體上對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制，本實(shí)驗(yàn)分別考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%硫酸水溶液5 種不同的流動(dòng)相下色譜峰的分離情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為乙腈-水、甲醇-水時(shí)，峰較少，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.1%磷酸水溶液溶液時(shí)，峰的數(shù)量接近，但乙腈-0.1%磷酸水溶液系統(tǒng)各峰分離效果好，故選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相。同時(shí)，采用200～400 nm全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在240 nm處色譜峰數(shù)目較多，各峰吸收較均勻，可體現(xiàn)指紋圖譜的整體性和模糊性。而在對(duì)芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷5種成分進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm時(shí)的峰信號(hào)響應(yīng)值較高，分離度良好，可同時(shí)測(cè)定5種成分含量。另外，考察了色譜柱溫度（25、30、35 ℃），體積流量（0.8、1.0、1.2 mL/min）及不同類(lèi)型色譜柱，最終確定上述色譜條件。

綜上所述，本研究首次采用指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，預(yù)測(cè)JSP（顆粒）的Q-Marker，然后測(cè)定其含量，為JSP研制成古代經(jīng)典名方中藥復(fù)方制劑提供質(zhì)量控制依據(jù)，同時(shí)也為中藥質(zhì)量控制指標(biāo)性成分的選擇提供了一種新的思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Analysis of quality markers of Jiawei Sini Powder (Granules) based on HPLC fingerprint and network pharmacology and establishment of content determination method

CHEN Jing-mei1, 2, 3, 4, LI Ze-yu2, 3, 4, 5, LIANG Qiu-ming6, YUE Zi-jun1, TANG Zuo-wei1, HAO Er-wei2, 3, 4, 5, DU Zheng-cai2, 3, 4, 5, HOU Xiao-tao1, 2, 3, 4, DENG Jia-gang2, 3, 4, 5

1. Faculty of Pharmacy, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 2. Guangxi Key Laboratory of Efficacy Study on Chinese Materia Medica, Nanning 530200, China 3. Guangxi Collaborative Innovation Center of Research on Functional Ingredients of Agricultural Residues, Nanning 530200, China 4. Guangxi Key Laboratory of Theory and Transformation of Damp Disease Prescriptions, Nanning 530200, China 5. Guangxi Scientific Experimental Center of Traditional Chinese Medicine, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 6. Guangxi Qinzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Qinzhou 535000, China

To analyze and predict potential quality markers (Q-Marker) of Jiawei Sini Powder (JSP, 加味四逆散) (Granules), and determine the content of Q-Marker components based on fingerprint and network pharmacology methods, providing reference for quality control.Firstly, the potential Q-Marker of JSP (Granules) were analyzed by fingerprint and chemometrics. On this basis, a substance effect network was constructed through network pharmacology to further analyze and predict the Q-Marker associated with the efficacy of JSP (Granules), and an HPLC method was established to determine the content of the predicted landmark components.An HPLC fingerprint of JSP (Granules) was established, identifying 28 common peaks, and assigning them to different peaks. Among them, peaks 1, 9, and 11 come from Baishao (, PRA), peaks 26, and 27 come from Zhishi (, AFI), peaks 13, and 28 come from Zhigancao (etcum, GRRPM), peaks 2, 4, 10, 12, 16, and 24 come from Daidaihua (var.), peaks 15, 17, and 22 come from Banzhilian (), peaks 25 come from both PRA and GRRPM, peaks 3, 5—8, 14, 18—21, and 23 come from both AFI andvar.. Nine common peaks were identified, including albiflorin, paeoniflorin, glycyrrhizin, scutellarin, naringin, and hesperidin, neohesperidin, naringin, ammonium glycyrrhetate. The similarity evaluation showed that the similarity of 10 batches of JSP (Granules) samples ranges from 0.954—1.000. Principal component analysis (PCA) showed that the cumulative variance contribution rate of the first four principal components was 95.003%, while orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) showed that 12 components had higher variable importance projection values. On this basis, the network pharmacology method was used to analyze and conclude that albiflorin, paeoniflorin, naringin, hesperidin and neohesperidin may be the potential Q-Marker of JSP (Granules). The content of the above five components was determined simultaneously, and the methodological investigation results were good. The average sample recovery rate was 92.52%—96.48%, and the RSD was 1.3%—2.6%. The mass fractions of albiflorin, paeoniflorin, naringin, hesperidin, and neohesperidin in 10 batches of samples were 0.107 6—0.203 6, 0.475 9—1.204 6, 2.310 9—5.223 8, 0.410 3—0.796 8, 4.311 9—8.343 3 mg/g.This study established an HPLC fingerprint of JSP (Granules) and combined it with network pharmacology to predict five Q-marker components and establish a quantitative determination method, providing a quality control basis for the development of JSP (Granules) into ancient classic Chinese medicine compound formulations.

Jiawei Sini San; quality markers; HPLC; fingerprint; network pharmacology; principal component analysis; orthogonal partial least squares-discriminant analysis; albiflorin; paeoniflorin; naringin; hesperidin; neohesperidin

R283.6

A

0253 - 2670(2023)20 - 6682 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.20.012

2023-05-26

中國(guó)東盟傳統(tǒng)藥物研究國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室建設(shè)（二期）資助項(xiàng)目（AD19110165）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)2022年研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（YCSZ2022004）；2020年度廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行補(bǔ)助項(xiàng)目（20-065-38）

陳靜梅（1996—），女，廣西梧州人，碩士研究生，從事中藥分析學(xué)研究。Tel: 13257715817 E-mail: 2369375473@qq.com

通信作者：侯小濤（1969—），女，博士生導(dǎo)師，教授，從事中藥活性成分與質(zhì)量控制研究。E-mail: xthou@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]