經(jīng)典名方清胃散基準(zhǔn)樣品濃縮干燥工藝及關(guān)鍵質(zhì)量屬性的研究

卞海雯，嚴(yán)國(guó)俊, 2*，曹杰楠，夏夢(mèng)瑩，高武鋒，潘金火，盛 華

經(jīng)典名方清胃散基準(zhǔn)樣品濃縮干燥工藝及關(guān)鍵質(zhì)量屬性的研究

卞海雯1，嚴(yán)國(guó)俊1, 2*，曹杰楠1，夏夢(mèng)瑩1，高武鋒1，潘金火1，盛 華3*

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 2. 江蘇省經(jīng)典名方工程研究中心，江蘇 南京 210023 3. 東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科，江蘇 南京 210002

對(duì)清胃散基準(zhǔn)樣品的濃縮干燥工藝進(jìn)行考察，確定其濃縮干燥工藝，并對(duì)清胃散基準(zhǔn)樣品中關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attributes，CQA）進(jìn)行研究。通過(guò)考察不同濃縮干燥方法，比較樣品中異阿魏酸、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀及丹皮酚的含量相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)煎液的保留率，確定清胃散基準(zhǔn)樣品的濃縮干燥工藝，結(jié)合前期研究出的煎煮工藝，制備15批清胃散基準(zhǔn)樣品。利用超快速液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（ultra fast liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry，UFLC-Q-TOF/MS）分析清胃散基準(zhǔn)樣品中的化學(xué)成分及入血原型成分，結(jié)合文獻(xiàn)研究初步確定清胃散基準(zhǔn)樣品CQA。確定了清胃散基準(zhǔn)樣品的濃縮干燥工藝為原方煎煮液加藥液量0.05 g/mL的β-環(huán)糊精直接噴霧干燥。分析出清胃散基準(zhǔn)樣品中化學(xué)成分有135個(gè)，入血原型成分28個(gè)，初步推測(cè)決定清胃散基準(zhǔn)樣品CQA的化學(xué)成分有黃連堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、表小檗堿、丹皮酚。建立的濃縮干燥工藝在保證最大程度清胃散標(biāo)準(zhǔn)煎液有效成分的基礎(chǔ)上適用于現(xiàn)代生產(chǎn)工藝；并且為后續(xù)基準(zhǔn)樣品CQA的確認(rèn)及制劑開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)，從而可以更全面地評(píng)價(jià)清胃散制劑質(zhì)量的優(yōu)劣。

經(jīng)典名方；清胃散；基準(zhǔn)樣品；濃縮；干燥；關(guān)鍵質(zhì)量屬性；異阿魏酸；鹽酸小檗堿；鹽酸巴馬汀；丹皮酚；UFLC-Q-TOF/MS

清胃散出自金代李東垣的《蘭室秘藏》[1]，由黃連（1.2 g）、地黃（1.2 g）、當(dāng)歸（1.2 g）、牡丹皮（2 g）及升麻（4 g）5味中藥組成，主治“因服補(bǔ)胃熱藥，致使上下牙疼痛不可忍，牽引頭腦、滿面發(fā)熱，大痛”[2]。本研究前期通過(guò)對(duì)金代時(shí)期的清胃散處方劑量、藥材基源、藥材炮制及水煎煮工藝的考證，還原經(jīng)典名方清胃散的標(biāo)準(zhǔn)煎液制備方法為原方飲片9.6 g，粉碎成最粗粉，加水150 mL，武火加熱至沸，文火保持微沸煎煮20 min，靜置后，傾出上清液，放至室溫，定容至100 mL。目前對(duì)經(jīng)典名方清胃散的研究多為文獻(xiàn)考證及藥理作用，未見(jiàn)其基準(zhǔn)樣品相關(guān)工藝研究的報(bào)道[3]。

基準(zhǔn)樣品一般為煎液、濃縮浸膏或干燥品，本課題組通過(guò)前期文獻(xiàn)考證及實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)確定清胃散煎煮工藝，且本課題組欲將清胃散基準(zhǔn)樣品定為干燥粉末，因此，本研究選擇不同濃縮方式及干燥方式對(duì)清胃散煎液進(jìn)行濃縮干燥，通過(guò)比較不同方式所得樣品中指標(biāo)性成分含量及保留率，進(jìn)而選出最佳濃縮干燥工藝。從而確定合理且完整的清胃散基準(zhǔn)樣品濃縮干燥工藝，便于后續(xù)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及制劑研究?！度擞盟幬镒?cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)委員會(huì)藥物研發(fā)指導(dǎo)原則》（ICH Q8）[4]中提出藥品關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attributes，CQA）的概念。中藥制劑根據(jù)其復(fù)雜體系的特征和藥用物質(zhì)的分類(lèi)，CQA的提取和確認(rèn)應(yīng)以保證藥物有效性和安全性為前提，基于藥物本身的性質(zhì)、制備工藝、制劑要求和整體性特征表述研究的基礎(chǔ)上，全面考慮，以提取完整的能表征藥品性質(zhì)的質(zhì)量控制指標(biāo)，為企業(yè)生產(chǎn)過(guò)程控制和藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立提供依據(jù)[5]。

中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，不同于西藥單個(gè)或幾個(gè)特定成分，所以其質(zhì)量的控制一直是一個(gè)共同探索的問(wèn)題，目前大都是檢測(cè)主要成分或特征成分的含量高低來(lái)評(píng)價(jià)某一復(fù)方制劑的質(zhì)量。而對(duì)經(jīng)典名方清胃散進(jìn)行CQA的研究和確認(rèn)可以從更全面的角度去評(píng)價(jià)其質(zhì)量的優(yōu)劣。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TD6001型分析天平，天津市天馬儀器有限公司；MS-105DU型電子天平，梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司；FA1104N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；Biosafer-SB25-12DTD型超聲波清洗機(jī)，賽飛（中國(guó)）有限公司；400Y型多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；AE-1106A型電陶爐，佛山市順德區(qū)愛(ài)卡生活電器有限公司；LC-20型快速液相色譜儀，島津公司；Triple TOFTM5600型高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)，上海愛(ài)博才思分析儀器貿(mào)易有限公司；MX-S型可調(diào)式混勻儀，北京大龍實(shí)驗(yàn)室；1736R型多功能高速離心機(jī)，基因有限公司；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；DHG-9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LW-015型噴霧干燥機(jī)，上海利聞科學(xué)儀器有限公司；FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)，上海利聞科學(xué)儀器有限公司；SY-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；SHZ-III真空泵，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 藥材與試劑

甲醇、乙腈，色譜級(jí)，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆患姿?，ACS（色譜級(jí)），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、甲酸，質(zhì)譜純，美國(guó)默克公司；β-環(huán)糊精，上海源葉生物科技有限公司；純凈水，華潤(rùn)怡寶飲料（中國(guó)）有限公司；磷酸，分析純，南京化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇，分析純，上海泰坦化學(xué)有限公司；冰乙酸，分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。對(duì)照品異阿魏酸（批號(hào)111698-201904，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.3%，供含量測(cè)定用）、鹽酸小檗堿（批號(hào)110713-201814，質(zhì)量分?jǐn)?shù)86.7%，供含量測(cè)定用）、鹽酸巴馬?。ㄅ?hào)110732-201913，質(zhì)量分?jǐn)?shù)85.7%，供含量測(cè)定用）、丹皮酚（批號(hào)110708-201908，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%，供含量測(cè)定用），以上對(duì)照品均購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。變態(tài)辣辣椒粉（批號(hào)20220715-102），購(gòu)買(mǎi)于渝里香旗艦店。清胃散基準(zhǔn)樣品所用藥材來(lái)源信息見(jiàn)表1，均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉訓(xùn)紅教授鑒定，當(dāng)歸為為傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸(Oliv.) Diels的干燥根，黃連為毛茛科黃連屬植物黃連Franch.的干燥根莖，牡丹皮為毛茛科芍藥屬植物牡丹Andr.的干燥根皮，升麻為毛茛科類(lèi)葉升麻屬植物大三葉升麻Kom.的干燥根莖，地黃為玄參科地黃屬植物地黃Libosch.的干燥塊根。

表1 清胃散基準(zhǔn)樣品藥材信息

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量（160±20）g，共18只，購(gòu)于南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（浙）2019-20Z2，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：20210628Aazz0100000510，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循南京中醫(yī)藥大學(xué)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 清胃散基準(zhǔn)樣品的制備

將15批清胃散基準(zhǔn)樣品（分別編號(hào)S1～S15，藥材組合方式見(jiàn)表2）按照前期考察出的水煎煮工藝進(jìn)行煎煮，采用單處方量（9.6 g飲片）煎煮液（100 mL）加藥液量5%的β-環(huán)糊精（g/mL）直接噴霧干燥的工藝，得到相對(duì)應(yīng)的基準(zhǔn)樣品。

表2 清胃散基準(zhǔn)樣品制備投料方式

2.2 指標(biāo)成分異阿魏酸、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀及丹皮酚的測(cè)定

2.2.1 色譜條件 Waters Symmetry C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.15%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～15 min，10%～15%乙腈；15～40 min，15%乙腈；40～50 min，15%～20%乙腈；50～75 min，20%～26%乙腈；75～78 min，26%～35%乙腈；78～85 min，35%乙腈；85～91 min，35%～90%乙腈；91～97 min，90%～10%乙腈；97～100 min，10%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積20 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別取異阿魏酸對(duì)照品8.60 mg、鹽酸小檗堿對(duì)照品4.66 mg、鹽酸巴馬汀對(duì)照品4.24 mg、丹皮酚對(duì)照品9.11 mg，精密稱(chēng)定，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為異阿魏酸1.708 0 mg/mL、鹽酸小檗堿0.808 0 mg/mL、鹽酸巴馬汀0.726 7 mg/mL、丹皮酚1.818 4 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。分別精密移取上述單一對(duì)照品溶液適量至25 mL量瓶?jī)?nèi)，甲醇定容，配制成混合對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為異阿魏酸68.32 μg/mL、鹽酸小檗堿32.32 μg/mL、鹽酸巴馬汀29.07 μg/mL、丹皮酚72.73 μg/mL。

2.2.3 供試品溶液的制備 取清胃散基準(zhǔn)樣品粉末0.4 g，精密稱(chēng)定，加入75%甲醇10 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（功率500 W、頻率45 kHz）45 min，再稱(chēng)定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下單一對(duì)照品溶液適量，制成質(zhì)量濃度為853.980 μg/mL的異阿魏酸對(duì)照品溶液、404.022 μg/mL的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液、72.673 μg/mL的鹽酸巴馬汀對(duì)照品溶液、909.178 μg/mL的丹皮酚對(duì)照品溶液，分別精密吸取上述對(duì)照品溶液，配制成不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，分別吸取10 μL注入高效液相色譜儀，進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行回歸，結(jié)果分別為異阿魏酸＝96 233.0－7 933.5，2＝0.999 9，線性范圍2.669～85.398 μg/mL；鹽酸小檗堿＝ 46 869.0＋9 919.5，2＝0.999 9，線性范圍1.263～40.415 μg/mL；鹽酸巴馬?。?6 427.00＋79.02，2＝1.000 0，線性范圍0.227～7.267 μg/mL；丹皮酚＝30 872.0－13 914.0，2＝0.999 9，線性范圍5.682～181.836 μg/mL，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度考察 精密稱(chēng)取清胃散基準(zhǔn)樣品粉末（S1）0.4 g，精密加入水5 mL，超聲30 min，放冷，稱(chēng)定質(zhì)量，加水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，加無(wú)水乙醇定容至10 mL，充分混合后過(guò)0.45 μm微孔濾膜。在“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，以丹皮酚的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄異阿魏酸、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和丹皮酚的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，計(jì)算其RSD，異阿魏酸、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和丹皮酚相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.35%，相對(duì)峰面積的RSD＜2.88%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性考察 精密稱(chēng)取清胃散基準(zhǔn)樣品粉末（S1）0.4 g，精密加入水5 mL，超聲30 min，放冷，稱(chēng)定質(zhì)量，加水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，加無(wú)水乙醇定容至10 mL，充分混合后過(guò)0.45 μm微孔濾膜。在“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定，以丹皮酚的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄異阿魏酸、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和丹皮酚的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，計(jì)算RSD，異阿魏酸、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和丹皮酚相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.15%，相對(duì)峰面積的RSD＜2.27%，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)均能保持穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性考察 精密稱(chēng)取清胃散基準(zhǔn)樣品粉末（S1）0.4 g，精密加入水5 mL，超聲30 min，放冷，稱(chēng)定質(zhì)量，加水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，加無(wú)水乙醇定容至10 mL，充分混合后過(guò)0.45 μm微孔濾膜，平行處理6份供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定，以丹皮酚的保留時(shí)間和峰面積為參照，記錄異阿魏酸、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和丹皮酚的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，計(jì)算RSD，異阿魏酸、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和丹皮酚相對(duì)保留時(shí)間的RSD＜0.23%，相對(duì)峰面積的RSD＜2.87%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率考察 取6份同一批次清胃散基準(zhǔn)樣品（S1），其中異阿魏酸、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀及丹皮酚的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為324.450、2 281.759、775.155、781.870 μg/g，精密稱(chēng)量基準(zhǔn)樣品粉末，再精密加入一定量的對(duì)照品，依法測(cè)定，計(jì)算其加樣回收率，結(jié)果異阿魏酸、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀及丹皮酚的平均加樣回收率分別為102.52%、105.08%、94.92%、99.99%，RSD分別為0.62%、1.62%、1.82%、1.50%，表明該方法回收率較好，方法可行。

2.3 濃縮工藝研究

2.3.1 供試品溶液的制備 按清胃散單處方量的5倍稱(chēng)取飲片48 g，加水750 mL，武火加熱至沸后轉(zhuǎn)文火煎煮，趁熱濾過(guò)，放至室溫，定容至500 mL，得樣品液。吸取樣品液5 mL于10 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇定容，充分混合后過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得濃縮工藝供試品溶液。

2.3.2 濃縮工藝考察

（1）減壓濃縮：取100 mL煎煮液于500 mL圓底燒瓶中，水浴75 ℃，壓力?0.085～?0.080 MPa，將濃縮液（體積大約為30 mL）倒出后用熱水洗滌圓底燒瓶并定容至50 mL。吸取樣品液5 mL于10 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇定容，充分混合后過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

（2）常壓濃縮：取100 mL煎煮液于蒸發(fā)皿中，水浴100 ℃，將濃縮液（體積大約為30 mL）倒出后用熱水洗滌蒸發(fā)皿并定容至50 mL。吸取樣品液5 mL于10 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇定容，充分混合后過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)不同濃縮方法的清胃散水煎液中的異阿魏酸、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、丹皮酚4種指標(biāo)成分含量及其保留率進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見(jiàn)表3，不同濃縮方法對(duì)比HPLC圖見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，無(wú)論何種濃縮方式，揮發(fā)性成分丹皮酚均有較大損耗，且保留率低，故本實(shí)驗(yàn)考慮不進(jìn)行濃縮，直接進(jìn)行干燥。

2.4 干燥工藝研究

2.4.1 供試品溶液的制備 同“2.3.1”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法。

2.4.2 干燥工藝

（1）噴霧干燥：取200 mL水煎液，加β-環(huán)糊精10 g，噴霧干燥。精密稱(chēng)取樣品約0.4 g，精密加入水5 mL，超聲30 min，放冷，稱(chēng)定質(zhì)量，加水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，加無(wú)水乙醇定容至10 mL，充分混合后過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

（2）冷凍干燥：取水煎液10 mL，冷凍干燥。精密稱(chēng)取樣品約0.14 g，精密加入水5 mL，超聲30 min，放冷，稱(chēng)定質(zhì)量，加水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，加無(wú)水乙醇定容至10 mL，充分混合后過(guò)0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 對(duì)不同干燥方法所得的清胃散樣品中的異阿魏酸、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、丹皮酚4種指標(biāo)成分含量及其保留率進(jìn)行測(cè)定，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果見(jiàn)表4，不同干燥方法對(duì)比HPLC圖見(jiàn)圖2。從3種指標(biāo)性成分保留率（除揮發(fā)性成分丹皮酚）及總保留率來(lái)看，噴霧干燥組均好于冷凍干燥組。冷凍干燥法所得樣品雖對(duì)于揮發(fā)性成分（如丹皮酚等）的保留率較高，但其效率低，時(shí)間長(zhǎng)，能耗大，成本高，不適于附加值較低的顆粒劑等普通口服制劑的生產(chǎn)，綜合考慮，選擇加輔料噴霧干燥方式。

表3 不同濃縮方法所得樣品中指標(biāo)成分含量及其保留率(, n = 3)

與母液組比較：*＜0.05；與減壓濃縮組比較：#＜0.05

*< 0.05mother liquor group;#< 0.05vacuum concentration group

A-常壓濃縮 B-減壓濃縮 C-母液 D-混合對(duì)照品 1-異阿魏酸 2-鹽酸小檗堿 3-鹽酸巴馬汀 4-丹皮酚

2.4.4 干燥工藝的確定 按李東垣古法，清胃散的服用劑量：全方飲片9.6 g，加水150 mL，煎至100 mL，1次服用。經(jīng)典名方制劑清胃散最終劑型是顆粒劑，服用方法與服用劑量必須同李東垣古法。此處制備藥用基準(zhǔn)樣品時(shí)，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)得出單處方量飲片含固量約為3 g，若按單處方量飲片所得100 mL藥液加藥液體積5%的β-環(huán)糊精，則需加β-環(huán)糊精5 g，總固體量約為8 g；若按單處方量飲片所得100 mL藥液加藥液體積10%的β-環(huán)糊精，則需加β-環(huán)糊精10 g，總固體量約為13 g。在后期顆粒劑成型過(guò)程中，尚需在藥用基準(zhǔn)樣品中加一定比例的矯味劑和稀釋劑，如果將顆粒劑設(shè)計(jì)成單劑量為10 g，此處若按5%的比例加β-環(huán)糊精，后期成型時(shí)還有加輔料的空間；此處若按10%的比例加β-環(huán)糊精，則后期成型時(shí)已沒(méi)有加輔料的空間，除非進(jìn)一步加大顆粒劑的劑量。根據(jù)上述分析，經(jīng)綜合權(quán)衡考慮，初定清胃散藥用基準(zhǔn)樣品濃縮干燥工藝為單處方量（飲片9.6 g）煎煮液（100 mL）加藥液量5%的β-環(huán)糊精直接噴霧干燥。

表4 不同干燥方法所得樣品中指標(biāo)成分含量及保留率(, n = 3)

與母液組比較：*＜0.05；與噴霧干燥組比較：#＜0.05

*< 0.05mother liquor group;#< 0.05spray drying group

A-冷凍干燥 B-噴霧干燥 C-母液 D-混合對(duì)照品 1-異阿魏酸 2-鹽酸小檗堿 3-鹽酸巴馬汀 4-丹皮酚

2.5 CQA研究

2.5.1 色譜條件 Acquity T3色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～2 min，95%乙腈；2～20 min，95%～5%乙腈；20～25 min，5%乙腈；25～27 min，5%～95%乙腈；27～30 min，95%乙腈；體積流量0.4 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積5 μL。

2.5.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)，質(zhì)量掃描范圍為100～150，同時(shí)采用觸發(fā)信息關(guān)聯(lián)采集模式（IDA）的方法對(duì)目標(biāo)離子進(jìn)行碎裂分析，具體參數(shù)如下：霧化氣380 kPa，輔助氣414 kPa，氣簾氣276 kPa，輔助加熱器溫度500 ℃，噴霧電壓（IS）?4500 V，去簇電壓（DP）?80 V，碰撞電壓（CE）?15 V[6]。進(jìn)樣前及進(jìn)樣后，采用校正液對(duì)準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)進(jìn)行校正[7]。

2.5.3 供試品溶液的制備 取清胃散基準(zhǔn)樣品0.4 g，精密稱(chēng)定，加入75%甲醇10 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲（功率500 W、頻率45 kHz）45 min，稱(chēng)定質(zhì)量，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液[6]。

2.5.4 ig液的制備

（1）辣椒水煎液：稱(chēng)取變態(tài)辣辣椒粉125 g，加入1000 mL蒸餾水，置于鍋中煎煮。共煎煮2次，每次1 h，合并提取液，最終濃縮成1000 mL的辣椒水煎液，保存在4 ℃冰箱中，備用。

（2）清胃散標(biāo)準(zhǔn)煎液：稱(chēng)取原方飲片9.6 g，粉碎成最粗粉，加水150 mL，武火加熱至沸，文火保持微沸煎煮20 min，靜置后，傾出上清液，放至室溫，定容至100 mL，保存在4 ℃冰箱中備用。

2.5.5 血液樣品的制備 雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為3組：空白組、對(duì)照組、給藥組?？瞻捉M大鼠每日10:00時(shí)ig 1次蒸餾水，連續(xù)9 d。其余大鼠（對(duì)照組和給藥組）每日10:00時(shí)以10 mL/kg的劑量ig 120 mg/mL的辣椒水煎液，連續(xù)ig 9 d（其中給藥組第4天開(kāi)始，在ig辣椒混懸液1 h前，以10 mL/kg的劑量ig清胃散標(biāo)準(zhǔn)煎液）。第9日晚禁食不禁水過(guò)夜，第10天ig 1 mL無(wú)水乙醇，空白組ig等量蒸餾水。每天記錄各組大鼠體質(zhì)量、體溫以及唇、齒、舌、爪的顏色。給藥1 h后，腹主動(dòng)脈取血，置于離心管中，3000 r/min離心15 min，取上清液，即得。向上清液中加入4倍量乙腈沉淀蛋白，置渦旋儀中渦旋90 s，以13 000 r/min離心10 min，取上清液，進(jìn)樣分析。

2.5.6 數(shù)據(jù)分析方法 由Analyst TF 1.6軟件采集數(shù)據(jù)，通過(guò)PeakView 1.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)解析。首先通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database andAnalysis Platform，TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp. php）[8]構(gòu)建清胃散中黃連、地黃、當(dāng)歸、牡丹皮、升麻5種藥材的化學(xué)成分庫(kù)，借助ChemSpider（https://www.chemspider.com/）、化源網(wǎng)（https:// www.chemsrc.com/）等網(wǎng)站搜集化合物信息及對(duì)應(yīng)的.mol文件。然后，根據(jù)測(cè)得的數(shù)據(jù)，以分子式及[M＋H]+、[M＋NH4]+、[M－H]?、[M＋COOH]?等離子對(duì)應(yīng)的精確相對(duì)分子質(zhì)量為關(guān)鍵詞，檢索構(gòu)建的5種藥材化合物數(shù)據(jù)庫(kù)，相對(duì)分子質(zhì)量檢索差異設(shè)定＜5×10?6，對(duì)檢索得到的結(jié)果利用碎片離子進(jìn)行確證[9]。

2.5.7 大鼠體征及一般行為學(xué)觀察結(jié)果 空白組大鼠鼻、唇、爪、趾、耳朵、舌頭呈淡粉色，狀態(tài)良好，毛發(fā)整齊有光澤，飲食正常，小便淡黃色，大便成型，為棕色或棕褐色的濕潤(rùn)粒狀；對(duì)照組大鼠鼻、唇、爪、趾、耳朵近紅色，毛發(fā)雜亂、光澤度差，前切牙之間牙齦出現(xiàn)紅腫，部分甚至出現(xiàn)潰爛出血的情況，舌頭呈紅色或紅紫色，性情急躁，易被激怒，聲音嘶啞，難以捕捉，小便短小呈亮黃色，大便干硬、秘結(jié)，呈黑色小粒狀，給藥后，清胃散給藥組大鼠大小便性狀發(fā)生轉(zhuǎn)變，牙齦紅腫、潰爛出血的情況有所緩解，接近空白組。

2.5.8 化學(xué)成分及入血原型成分研究 清胃散基準(zhǔn)樣品中共鑒定出135個(gè)清胃散化學(xué)成分，總離子流圖見(jiàn)圖3-A，鑒定結(jié)果見(jiàn)表5。正離子模式下有52個(gè)成分，負(fù)離子模式下有83個(gè)成分。

圖3 清胃散基準(zhǔn)樣品(A)、含藥血漿(B)在正(I)、負(fù)(II)離子模式下的UFLC-Q-TOF/MS總離子流圖

表5 UFLC-Q-TOF/MS對(duì)清胃散基準(zhǔn)樣品化學(xué)成分的分析鑒定

續(xù)表5

續(xù)表5

979.91[M－H]?204.078 61.5C12H12O3203.071 0, 203.059 7, 159.081 1, 91.021 33-亞丁基-7-羥基苯酞（3-butylidene-7-hydroxyphthalide）當(dāng)歸 9810.19[M＋HCOO]?674.366 62.1C37H54O11655.354 4, 589.337 0, 523.299 8, 463.282 2, 415.282 0升麻苷（cimicifugoside）升麻 9910.31[M＋H]+192.115 0?0.7C12H16O4189.071 3洋川芎內(nèi)酯（senkyunolide）當(dāng)歸 10010.58[M＋HCOO]?620.392 40.5C35H56O9619.345 3, 561.337 5, 487.307 6升麻醇-3-O-β-D-吡喃木糖苷（cimigenol-3-O-β-D-xylopyranoside）升麻 10110.61[M＋HCOO]?680.413 60.1C37H60O11679.408 1, 637.395 9, 619.384 7, 579.349 7, 59.016 1鐵破鑼苷III（beesioside III）升麻 10211.09[M－H]?660.387 40.3C37H56O10659.382 8, 617.366 8, 599.355 2, 581.351 8, 559.330 523-表-26-脫氧乳腺素（23-epi-26-deoxyactein）升麻 10311.33[M＋H]+190.099 4?0.9C12H14O2173.095 0, 161.059 7, 145.100 9, 115.054 0, 105.069 8Z-藁本內(nèi)酯（Z-ligustilide cis-ligustilide）當(dāng)歸 10411.33[M＋H]+190.099 4?0.9C12H14O2173.095 0, 161.059 7, 145.100 9丁苯酞［(3S)-3-butyl-3H-isobenzofuran-1-one 當(dāng)歸 3-n-butyl phthalide E-ligustilide］ 10511.34[M＋H]+662.403 0?6.6C37H58O10585.375 8, 435.325 8, 381.274 2, 239.178 4乙酰升麻醇-3-O-L-阿拉伯糖苷（23-O-acetylshengmanol-升麻 3-O-α-L-arabinopyranoside） 10612.33[M＋HCOO]?502.365 80.2C31H50O5487.342 3, 447.340 0, 409.317 3, 395.273 3, 329.223 9ethyl 2-[2-(octadecyloxy)benzoyl]-3-oxobutanoate升麻 10712.59[M＋NH4]+486.334 5?4.1C30H46O5487.344 6, 469.332 1, 451.339 37,8-二羥基升麻醇（7,8-didehydrocimigenol）升麻 10812.75[M＋NH4]+488.350 2?2.1C30H48O5453.334 4, 447.116 9, 257.189 0升麻醇（cimigenol）升麻 10913.14[M＋H]+194.167 1?1.5C13H22O135.117 5, 121.101 6香葉基丙酮（geranylacetone）升麻 11015.78[M－H]?456.360 43.5C30H48O3455.345 8白樺脂酸（mairin）牡丹皮 11115.78[M－H]?456.360 43.5C30H48O3455.345 8齊墩果酸（oleanolic acid）牡丹皮 11216.95[M＋H]+256.240 2?2.3C16H32O2192.900 1, 192.872 8, 192.840 5, 160.972 9, 119.956 7軟脂酸-D5（hexadecanoic-D5 acid）升麻 11317.26[M－H]?280.240 24.4C18H32O2279.232 3十八碳二烯酸（octadecadienoic acid）當(dāng)歸、升麻

續(xù)表5

通過(guò)對(duì)質(zhì)譜信息進(jìn)行比對(duì)分析，并根據(jù)保留行為結(jié)合化學(xué)成分庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)，135個(gè)成分中有21個(gè)來(lái)自于黃連、有25個(gè)來(lái)自于地黃、有27個(gè)來(lái)自于牡丹皮、有35個(gè)來(lái)自于當(dāng)歸、有39個(gè)來(lái)自于升麻。分析鑒定了28個(gè)清胃散入血原型成分，總離子流圖見(jiàn)圖3-B，鑒定結(jié)果見(jiàn)表6。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選擇不同濃縮方法及干燥方法對(duì)清胃散煎液進(jìn)行濃縮干燥，通過(guò)比較不同方法所得樣品中指標(biāo)性成分含量及保留率，進(jìn)而選出最佳濃縮干燥工藝，從而確定合理且完整的清胃散基準(zhǔn)樣品濃縮干燥工藝。本實(shí)驗(yàn)采用整方研究法，通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對(duì)遵照古法制得的清胃散基準(zhǔn)樣品中化學(xué)成分進(jìn)行了快速表征，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索樣品峰信號(hào)一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合文獻(xiàn)資料對(duì)比分析[10]，共鑒別出清胃散基準(zhǔn)樣品中135個(gè)化學(xué)成分，并通過(guò)血清藥物化學(xué)分析出清胃散基準(zhǔn)樣品28個(gè)原型入血成分，其中入血成分有鹽酸黃連堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、表小檗堿、降氧化北美黃連次堿、丹皮酚、香豆酸、棕櫚酸甲酯、益母草苷等。這些化合物的潛在作用靶點(diǎn)較多，在胃熱證的治療中可能發(fā)揮重要作用。

大量研究表明[11-17]，鹽酸黃連堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、表小檗堿均來(lái)自黃連，對(duì)胃熱證模型而言，黃連中主要藥效物質(zhì)生物堿具有較強(qiáng)的抗?jié)冏饔?，其中鹽酸小檗堿可促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和組織再生，對(duì)胃黏膜保護(hù)作用效果顯著；丹皮酚是牡丹皮中發(fā)揮抗炎作用的主要成分，能使白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等多種細(xì)胞因子明顯降低，同時(shí)使白細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，表明丹皮酚能較好抑制炎癥反應(yīng)。故初步推測(cè)決定清胃散基準(zhǔn)樣品CQA的化學(xué)成分有鹽酸黃連堿、鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀、表小檗堿、丹皮酚。

雖然液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在中藥分析方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但其數(shù)據(jù)分析大多是通過(guò)將所得化合物結(jié)合文獻(xiàn)資料、質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)、化合物保留時(shí)間、質(zhì)譜裂解規(guī)律等進(jìn)行比對(duì)[18-23]，從而進(jìn)行鑒定，具有一定的局限性，且鑒定的化合物部分存在同分異構(gòu)體的情況，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需采用對(duì)照品比對(duì)等手段進(jìn)一步核對(duì)驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)只分析出清胃散基準(zhǔn)樣品入血成分中的原型成分，代謝成分仍未分析，后續(xù)課題組會(huì)進(jìn)一步進(jìn)行分析鑒定，進(jìn)一步確認(rèn)出決定清胃散基準(zhǔn)樣品CQA的化學(xué)成分，為后續(xù)制劑研究提供基礎(chǔ)。

表6 UFLC-Q-TOF/MS對(duì)清胃散基準(zhǔn)樣品體內(nèi)入血原型成分的分析鑒定

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on concentration and drying process and key quality attributes of benchmark samples of classical prescription Qingwei San

BIAN Hai-wen1, YAN Guo-jun1, 2, CAO Jie-nan1, XIA Meng-ying1, GAO Wu-feng1, PAN Jin-huo1, SHENG Hua3

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Jiangsu Province Engineering Research Center of Classical Prescription, Nanjing 210023, China 3. Eastern Theater Command General Hospital, Nanjing 210002, China

To investigate the concentration and drying process of Qingwei San (清胃散) benchmark samples and study its critical quality attributes (CQA).Different concentration and drying methods were performed to compare the retention rates of isoferulic acid, berberine hydrochloride, palmatine hydrochloride and paeonol in the samples relative to the standard decoction, which can determine the concentration and drying process of Qingwei San benchmark samples. A total of 15 batches of benchmark samples were further prepared with the previous processing method. The ultra fast liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry (UFLC-Q-TOF/MS) analysis was performed to analyze the chemical components and blood prototype components in the benchmark sample of Qingwei San, combined with preliminary research to tentatively identify the CQA of Qingwei San benchmark samples.The concentration and drying process of the Qingwei San benchmark samples was determined to be direct spray drying with 0.05 g/mL β-cyclodextrin. Moreover, 135 chemical components and 28 prototype components were analyzed in Qingwei San benchmark samples, and coptisine, berberine hydrochloride, palmatine hydrochloride, epiberberine, and paeonol were the potential CQA of Qingwei San benchmark samples.The concentration and drying process of Qingwei San standard decoction was established in this study, which may provide a reference for subsequent CQA confirmation of Qingwei San benchmark samples and formulation development, enabling a comprehensive evaluation of the quality of Qingwei San formulations.

classic prescription; Qingwei San; benchmark samples; concentration; drying; critical quality attributes; isoferulic acid; berberine hydrochloride; palmatine hydrochloride; paeonol; UFLC-Q-TOF/MS

R283.6

A

0253 - 2670(2023)20 - 6616 - 13

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.20.007

2023-03-16

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助（81773910）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助（82074004）；江蘇高?！扒嗨{(lán)工程”項(xiàng)目資助（2020）

卞海雯，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩巹?。Tel: 18851092597 E-mail: 1415540607@qq.com

通信作者：嚴(yán)國(guó)俊，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴庯嬈爸苿┢焚|(zhì)傳遞過(guò)程及評(píng)價(jià)方法。Tel: 13770598093 E-mail: yanguojun@njucm.edu.cn

盛 華，主管藥師，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)專(zhuān)業(yè)。Tel: 13770718720 E-mail: 21991949@qq.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]