空間代謝組學(xué)在中藥研究中的應(yīng)用

趙 杰，馮素香

·專(zhuān) 論·

空間代謝組學(xué)在中藥研究中的應(yīng)用

趙 杰1, 2，馮素香1*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院，河南 鄭州 450000 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)，呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450000

空間代謝組學(xué)是基于質(zhì)譜成像和代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)展而來(lái)的一門(mén)新興組學(xué)技術(shù)，通過(guò)原位檢測(cè)生物體系中內(nèi)源性小分子和外源性藥物代謝物的分子結(jié)構(gòu)、空間分布及含量變化，精準(zhǔn)地反映代謝物在組織整體或微區(qū)的代謝網(wǎng)絡(luò)變化特征，深度揭示中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制。通過(guò)對(duì)近年來(lái)空間代謝組學(xué)技術(shù)在中藥質(zhì)量控制、中藥在生物體內(nèi)代謝及分布、中藥藥效機(jī)制和中藥毒性機(jī)制中的研究成果進(jìn)行綜述，為探索基于空間代謝組學(xué)技術(shù)的中藥研究提供理論依據(jù)。

空間代謝組學(xué)；中藥；質(zhì)量控制；體內(nèi)代謝及分布；藥效機(jī)制；毒性機(jī)制

中藥在我國(guó)的應(yīng)用已有數(shù)千年歷史積淀，在治療眾多復(fù)雜疾病方面具有豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)和獨(dú)特于西醫(yī)的特色優(yōu)勢(shì)。中藥是在中醫(yī)理論基礎(chǔ)指導(dǎo)下的遣方用藥，具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑和整體性等特點(diǎn)。雖然中藥臨床療效顯著，但一定程度上因藥效物質(zhì)不明、作用機(jī)制不清，制約了其現(xiàn)代化發(fā)展。近年來(lái)，以生物體內(nèi)小分子代謝物為研究主體的代謝組學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，其基于檢測(cè)整體代謝物動(dòng)態(tài)變化的研究策略與中醫(yī)藥理論相切合，為解決中醫(yī)藥發(fā)展的瓶頸問(wèn)題帶來(lái)了新機(jī)遇。目前已廣泛應(yīng)用于揭示中藥物質(zhì)基礎(chǔ)與藥效作用機(jī)制等方面的研究，并初步取得了諸多令人鼓舞的成果[1-2]。但是，由于中藥成分在生物體內(nèi)的代謝和分布往往具有精準(zhǔn)的空間定位，使得藥效作用與其在生物組織整體或微區(qū)的空間分布密不可分。然而，傳統(tǒng)代謝組學(xué)由于樣本前處理方法的限制，導(dǎo)致代謝物在組織中的空間分布信息缺失，使中藥的效應(yīng)部位和藥效機(jī)制難以得到全面、客觀地詮釋。

空間代謝組學(xué)是將質(zhì)譜成像與代謝組學(xué)技術(shù)相結(jié)合的一種新興組學(xué)技術(shù)，一方面通過(guò)質(zhì)譜成像技術(shù)提供代謝物在組織整體或微區(qū)的精確分布，另一方面利用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)區(qū)域內(nèi)的差異性成分進(jìn)行深度挖掘與生物信息學(xué)分析，從而將代謝物及其生物學(xué)功能與生物組織解剖特征相關(guān)聯(lián)，更為精準(zhǔn)、科學(xué)地解析中藥的藥效成分及在生物體內(nèi)對(duì)疾病的調(diào)控機(jī)制。因此，通過(guò)空間代謝組學(xué)技術(shù)構(gòu)建“分子結(jié)構(gòu)-空間分布-含量變化-代謝通路”相互關(guān)系，為尋找中藥藥效成分、治療靶點(diǎn)和作用機(jī)制提供新思路。本文通過(guò)總結(jié)空間代謝組學(xué)技術(shù)在中藥質(zhì)量控制、中藥在生物體內(nèi)代謝及分布、中藥藥效機(jī)制和中藥毒性機(jī)制中的研究進(jìn)展，并對(duì)空間代謝組學(xué)在中藥研究中存在的不足和未來(lái)的發(fā)展方向進(jìn)行了思考和展望，為探索基于空間代謝組學(xué)技術(shù)的中藥研究提供理論依據(jù)，促進(jìn)中藥的現(xiàn)代化、國(guó)際化進(jìn)程。

1 空間代謝組學(xué)概述

1.1 空間代謝組學(xué)技術(shù)

代謝組學(xué)由英國(guó)Nicholson教授提出，最初用于測(cè)定由遺傳或病理生理變化導(dǎo)致的生物體內(nèi)小分子代謝物動(dòng)態(tài)變化情況，目前已廣泛用于尋找疾病生物標(biāo)志物、揭示疾病發(fā)病及中藥藥效作用機(jī)制等研究[3-5]。代謝組學(xué)分析的樣本檢測(cè)前通常需要進(jìn)行萃取、研磨或勻漿等前處理。但是，對(duì)待分析樣本的均質(zhì)化處理將使得代謝產(chǎn)物在原有組織中的空間分布信息喪失。由于生物組織器官因由多種類(lèi)型細(xì)胞構(gòu)成并具有異質(zhì)性和復(fù)雜性，代謝物的空間分布與其病理生理功能改變緊密相關(guān)，有必要將代謝物動(dòng)態(tài)變化與空間位置分布聯(lián)系起來(lái)[6]。傳統(tǒng)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的代謝組學(xué)方法已無(wú)法滿足此類(lèi)需求，同時(shí)隨著分子原位成像技術(shù)的不斷發(fā)展，促進(jìn)了空間代謝組學(xué)的誕生。

空間代謝組學(xué)是組學(xué)研究的一個(gè)新技術(shù)，能夠在樣本復(fù)雜的空間結(jié)構(gòu)背景下檢測(cè)內(nèi)源性小分子物質(zhì)及藥物及其代謝物，并揭示各類(lèi)物質(zhì)含量變化的潛在機(jī)制[7]。與傳統(tǒng)代謝組學(xué)相比，空間代謝組學(xué)的特點(diǎn)主要表現(xiàn)在樣本預(yù)處理操作簡(jiǎn)化，不破壞待測(cè)樣本結(jié)構(gòu)，保留代謝物在組織中的空間分布信息[8]。空間代謝組學(xué)的發(fā)展，在很大程度上是由質(zhì)譜成像技術(shù)的快速發(fā)展所推動(dòng)的。質(zhì)譜成像是一種新興的分子成像技術(shù)，其能夠利用質(zhì)譜儀直接采集待測(cè)樣本切片的離子信息，并通過(guò)專(zhuān)業(yè)數(shù)據(jù)處理軟件將質(zhì)譜數(shù)據(jù)可視化，獲得內(nèi)源性分子與外源性藥物及其代謝物分子的結(jié)構(gòu)、在組織切片中的空間分布和含量信息[9]。與其他可視化分析技術(shù)相比，質(zhì)譜成像技術(shù)具有免標(biāo)記、高覆蓋、高靈敏度和檢測(cè)范圍廣等特點(diǎn)[10]。目前，空間代謝組學(xué)中應(yīng)用的質(zhì)譜成像技術(shù)主要包括：二次離子質(zhì)譜成像（secondary ion mass spectrometry mass spectrometry imaging，SIMS-MSI）、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜成像（matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging，MALDI-MSI）和解吸電噴霧電離質(zhì)譜成像（desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging，DESI-MSI）等[11]。其中，現(xiàn)階段以MALDI-MSI技術(shù)在空間代謝組學(xué)中的應(yīng)用最為廣泛。近年來(lái)，研究者針對(duì)MALDI-MSI質(zhì)譜技術(shù)需要真空操作、樣本處理復(fù)雜等問(wèn)題，后續(xù)研發(fā)出了多種常壓敞開(kāi)式質(zhì)譜成像技術(shù)并建立了相應(yīng)的空間代謝組學(xué)方法，如激光消融電噴霧電離質(zhì)譜成像技術(shù)和空氣動(dòng)力輔助解吸電噴霧離子化質(zhì)譜成像技術(shù)（air-flow-assisted desorption electrospray ionization mass spectrometry imaging，AFADESI-MSI）等[12-13]。常壓敞開(kāi)式質(zhì)譜成像技術(shù)降低了對(duì)質(zhì)譜采集環(huán)境的要求，簡(jiǎn)化了樣本預(yù)處理操作，為空間代謝組學(xué)的發(fā)展提供了新的契機(jī)。

1.2 空間代謝組學(xué)的流程

空間代謝組學(xué)的研究流程主要包括組織樣本獲取、切片制備、質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集和成像數(shù)據(jù)分析（圖1）。其中，樣本獲取和切片制備是影響質(zhì)譜成像結(jié)果真實(shí)性和準(zhǔn)確性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，此過(guò)程中樣本的完整性和分子密度的細(xì)微差別都會(huì)對(duì)檢測(cè)的分子類(lèi)型、質(zhì)譜響應(yīng)強(qiáng)度或空間定位產(chǎn)生影響[14]。在切片制備過(guò)程中，樣本通?？焖倮鋬鲇谝旱笄衅欢鴮?duì)于整體動(dòng)物和不易于切片的組織樣本則需要在切片之前進(jìn)行包埋處理[15-16]。對(duì)于中藥材樣本，質(zhì)地較為堅(jiān)硬的根莖類(lèi)藥材一般需要利用適宜的介質(zhì)進(jìn)行包埋處理后冷凍切片；而花、葉類(lèi)中藥鮮品在質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集過(guò)程中容易變形或移位，則需要采用轉(zhuǎn)印法間接分析[17-18]。冷凍或包埋處理的樣本通常采用冷凍切片機(jī)制備厚度均一的組織切片，厚度一般控制在5～20 μm[19]，隨后采用融裱法、膠帶法等方式將冷凍切片轉(zhuǎn)移至質(zhì)譜靶上。在質(zhì)譜成像儀掃描采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)之前，需要根據(jù)采用的質(zhì)譜成像技術(shù)對(duì)切片進(jìn)行相應(yīng)的預(yù)處理。在MALDI-MSI技術(shù)中，為了提高檢測(cè)離子響應(yīng)強(qiáng)度需要對(duì)樣本切片涂覆基質(zhì)，通常分析氨基酸、核苷酸類(lèi)低相對(duì)分子質(zhì)量化合物選用2,5-二羥基苯甲酸；分析蛋白質(zhì)、低聚糖類(lèi)化合物選用芥子酸；對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量500以下的小分子化合物選用3,4-二甲氧基肉桂酸和納米材料等新型基質(zhì)[20]。采用SIMS-MSI、DESI-MSI和其他敞開(kāi)式離子化質(zhì)譜成像技術(shù)則無(wú)需預(yù)處理即可上機(jī)。

圖1 空間代謝組學(xué)研究流程圖

樣本數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)譜掃描儀采集后，需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行批量讀取、背景扣除、數(shù)據(jù)篩選及生成圖像等，常用的軟件包有MassImager、MSiReader和ImageQuest等[21-22]。利用成像軟件將成像離子圖譜與組織切片的光學(xué)圖像或連續(xù)切片的病理染色圖像相結(jié)合，提取不同微區(qū)的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，隨后根據(jù)變量投影重要性指標(biāo)、獨(dú)立樣本檢驗(yàn)和倍率變化篩選差異代謝物。差異代謝物通過(guò)HMDB和METLIN等在線數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行二級(jí)碎片離子匹配后，經(jīng)在線網(wǎng)站MetaboAnalyst進(jìn)行代謝通路分析。

2 空間代謝組學(xué)在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用

中藥質(zhì)量控制是確保中藥臨床療效的重要保障。中藥藥用部位的成分組成、含量和分布情況能夠直觀地反映中藥質(zhì)量，但傳統(tǒng)分析方法難以實(shí)現(xiàn)?？臻g代謝組學(xué)利用質(zhì)譜成像技術(shù)對(duì)成分進(jìn)行原位表征，從而對(duì)中藥品種、產(chǎn)地、生長(zhǎng)年限、采摘時(shí)期和炮制加工等環(huán)節(jié)進(jìn)行評(píng)價(jià)，在中藥質(zhì)量控制中具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來(lái)，空間代謝組學(xué)在中藥質(zhì)量控制中的研究見(jiàn)表1。

Li等[23]基于MALDI-MSI技術(shù)對(duì)芍藥和牡丹根進(jìn)行鑒別，對(duì)單萜類(lèi)、丹皮酚苷類(lèi)和鞣質(zhì)酸等成分進(jìn)行空間分布表征，其中芍藥苷及其衍生物主要聚集在2種藥材根的木質(zhì)部和韌皮部，而牡丹皮苷和牡丹皮苷A等成分主要見(jiàn)于芍藥根皮層和木質(zhì)部及牡丹根的皮層和韌皮部。該研究首次可視化了沒(méi)食子鞣質(zhì)生物合成途徑主要中間體的空間分布，發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酰葡萄糖等13個(gè)主要中間體在2種藥材根部的空間分布存在明顯差異，為藥用成分在不同藥材中的空間分布及生物合成途徑的研究具有指導(dǎo)意義。Nie等[24]首次采用DESI-MSI技術(shù)鑒定了板藍(lán)根中包括生物堿、核苷和氨基酸類(lèi)等在內(nèi)的102個(gè)代謝物，并對(duì)其中19個(gè)代謝物在藥材中的空間分布進(jìn)行研究，其中優(yōu)質(zhì)板藍(lán)根藥材橫截面皮部占比多于木部，且皮部中代謝物離子強(qiáng)度較高。該研究隨后對(duì)不同品質(zhì)板藍(lán)根藥材進(jìn)行了正交偏最小二乘判別分析，發(fā)現(xiàn)精氨酸、3-甲酰基吲哚和紫丁香苷等11個(gè)代謝物可以作為區(qū)分優(yōu)質(zhì)和劣質(zhì)板藍(lán)根的質(zhì)量控制標(biāo)志物。與傳統(tǒng)的板藍(lán)根質(zhì)量評(píng)價(jià)方法相比，該研究將板藍(lán)根的形態(tài)特征與化學(xué)成分特征直接聯(lián)系起來(lái)，進(jìn)一步完善了板藍(lán)根藥材的質(zhì)量控制方法。Liu等[25]建立了雙層介質(zhì)嵌入樣品制備方法，并采用SIMS-MSI首次對(duì)天然和人工冬蟲(chóng)夏草的蟲(chóng)體進(jìn)行原位化學(xué)成分分析和成像，鑒定并成像的成分超過(guò)200個(gè)，其中大多數(shù)成分在蟲(chóng)體中分布均勻，而三酰甘油、甘油二酯、髓鞘相關(guān)糖蛋白和脂肪酸類(lèi)成分只在蟲(chóng)體的消化室外分布。該研究發(fā)現(xiàn)，除脂肪酸、甘油和甘油磷脂類(lèi)成分外，2種冬蟲(chóng)夏草的氨基酸、核苷、單糖、鞘脂和甾醇類(lèi)成分比例相當(dāng)。相較于傳統(tǒng)的冬蟲(chóng)夏草質(zhì)量控制方法，僅能分析特定溶劑在特定條件下提取的一類(lèi)或幾類(lèi)成分，該研究提供了一種無(wú)需溶劑萃取即可同時(shí)測(cè)定和評(píng)估各類(lèi)成分的方法，為冬蟲(chóng)夏草的鑒別提供了新方案。此外，研究者對(duì)丹參[26]、姜黃素[27]、三七[28]、黃連[29]、石斛[30]和銀杏[31]等藥材成分的空間分布均進(jìn)行了表征，為該類(lèi)藥材的質(zhì)量控制和成分特征部位的分離提取提供參考。

表1 空間代謝組學(xué)在中藥質(zhì)量控制中的應(yīng)用

生長(zhǎng)環(huán)境和年限能夠?qū)χ兴幊煞纸M成及含量產(chǎn)生直接影響，是中藥材質(zhì)量控制的主要考察指標(biāo)。Lu等[32]建立了高靈敏度的激光燒蝕碳纖維離子化質(zhì)譜成像（laser ablation carbon fiber ionization mass spectrometry imaging，LACFI-MSI）分析方法，對(duì)不同年限林下山參和園參新鮮根中活性代謝物的空間分布進(jìn)行了表征。該研究利用碳碳雙鍵廣泛存在于人參皂苷類(lèi)、聚乙烯類(lèi)和萜烯類(lèi)等活性成分中，采用[d]/[d]-雙（吡啶）四氟硼化碘作為碳碳雙鍵衍生化試劑增強(qiáng)代謝物響應(yīng)度，同時(shí)可視化了52種代謝物的空間分布，并通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)林下山參中代謝物的相關(guān)性高于園參。該研究避免了利用單一生物活性成分作為區(qū)分林下山參和園林參的不足。Zhao等[33]基于MALDI-MSI技術(shù)對(duì)枸杞果實(shí)發(fā)育過(guò)程中內(nèi)源性分子的空間分布進(jìn)行了可視化，結(jié)果顯示在此過(guò)程中內(nèi)源性分子空間分布差異較大。其中，膽堿、甜菜堿和檸檬酸均呈均勻分布，己糖主要分布在內(nèi)果皮和果肉組織中，蔗糖主要分布在種子組織中。隨著果實(shí)的發(fā)育，檸檬酸的信號(hào)強(qiáng)度降低，而膽堿、甜菜堿、己糖和蔗糖的信號(hào)強(qiáng)度增加。該研究填補(bǔ)了傳統(tǒng)技術(shù)無(wú)法呈現(xiàn)的內(nèi)源性分子空間分布信息，為深入了解內(nèi)源性分子生物合成和積累過(guò)程提供了新思路。此外，研究者對(duì)不同生長(zhǎng)年限的人參[34-36]、不同收獲階段的連翹[37]和連作丹參[38]的成分空間分布進(jìn)行分析，結(jié)果顯示生長(zhǎng)年限和收獲階段及種植方式不同中藥所含成分會(huì)發(fā)生較大變化，為提高種植中藥質(zhì)量及中藥材質(zhì)量控制提供重要依據(jù)。

中藥炮制是我國(guó)特有的藥材加工環(huán)節(jié)，對(duì)中藥藥性轉(zhuǎn)變、減毒增效等方面具有獨(dú)特作用，運(yùn)用空間代謝組學(xué)技術(shù)能夠直觀反映出炮制前后中藥所含成分的變化，可為炮制的工藝優(yōu)化提供科學(xué)指導(dǎo)。Liu等[39]通過(guò)結(jié)合DESI-MSI和代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)不同時(shí)間蒸制的附子中烏頭屬生物堿類(lèi)化合物進(jìn)行質(zhì)譜成像和分析，發(fā)現(xiàn)生附子和制附子內(nèi)烏頭堿類(lèi)成分明顯不同，且蒸制4 h對(duì)毒性成分的減弱及藥效成分的保留效果最佳。同時(shí)，篩選了42個(gè)代謝標(biāo)志物用于區(qū)分蒸制4、8 h的附子，并揭示了蒸制中的減毒過(guò)程主要是二酯二萜生物堿水解為單酯二萜生物堿再水解為非酯化二萜生物堿。該研究簡(jiǎn)化了傳統(tǒng)分析方法中復(fù)雜的樣本制備過(guò)程，從原始藥材樣本中直接分析和識(shí)別毒性成分變化，為確定附子的最佳炮制時(shí)間提供了理論依據(jù)。Ma等[40]利用MALDI-MSI技術(shù)對(duì)天麻在蒸制過(guò)程中13個(gè)酚類(lèi)內(nèi)源性分子的“空間-時(shí)間-含量”進(jìn)行表征，并通過(guò)整合巴利森苷類(lèi)成分與相應(yīng)水解酶的空間分布信息，揭示了蒸制能夠?qū)е滤饷甘Щ钸M(jìn)而保護(hù)巴利森苷類(lèi)成分，為天麻炮制工藝的改進(jìn)和標(biāo)準(zhǔn)化奠定了基礎(chǔ)。另外，通過(guò)分析女貞子[41]和三七[42]藥材炮制過(guò)程中成分的空間分布情況發(fā)現(xiàn)，炮制過(guò)程中藥成分發(fā)現(xiàn)明顯變化，為從宏觀角度闡明中藥炮制機(jī)制提供理論支撐。

3 空間代謝組學(xué)在中藥的生物體內(nèi)代謝及分布研究中的應(yīng)用

中藥活性成分在動(dòng)物各組織中的分布和代謝情況對(duì)明確中藥的靶器官、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制和評(píng)估潛在不良反應(yīng)具有重要作用。然而，傳統(tǒng)分析技術(shù)在樣本制備過(guò)程中會(huì)破壞組織結(jié)構(gòu)，難以清晰表征中藥活性成分及代謝物在區(qū)域內(nèi)分布情況?？臻g代謝組學(xué)依托質(zhì)譜成像技術(shù)，結(jié)合多變量統(tǒng)計(jì)分析手段，能夠同時(shí)表征中藥活性成分及其代謝物在不同組織器官整體或微區(qū)的空間代謝分布，呈現(xiàn)更為完整的代謝過(guò)程。近年來(lái)，空間代謝組學(xué)在中藥的生物體內(nèi)代謝分布中的研究見(jiàn)表2。

Gao等[43]采用DESI-MSI技術(shù)對(duì)7種鉤藤生物堿在大鼠大腦的分布情況進(jìn)行定量成像，發(fā)現(xiàn)7種生物堿在大鼠大腦存在相似的分布特征且呈彌漫分布，分布趨勢(shì)分別為單萜吲哚生物堿＞單萜氧化吲哚生物堿，型異構(gòu)體＞型異構(gòu)體。該研究首次在松果體中檢測(cè)到鉤藤生物堿，對(duì)今后該類(lèi)成分的藥效學(xué)研究具有指導(dǎo)意義。Wang等[44]結(jié)合MALDI-MSI技術(shù)成功建立了針對(duì)野黃芩苷和其代謝物在小鼠腎臟的成像方法，優(yōu)化了氧化石墨烯和咖啡酸的二元基質(zhì)檢測(cè)條件，提高野黃芩苷及3個(gè)代謝物在小鼠腎組織切片中的檢測(cè)效率。此外，相較于傳統(tǒng)代謝組學(xué)技術(shù)無(wú)法提供活性成分在組織內(nèi)的空間分布信息，該研究在小鼠ip野黃芩苷后，發(fā)現(xiàn)野黃芩苷及其代謝物野黃芩素2種成分主要分布在腎皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)且豐度較高，提示其可能具有預(yù)防和治療腎臟疾病的潛能。Zhu等[45]通過(guò)超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜和DESI-MSI技術(shù)，結(jié)合內(nèi)部非目標(biāo)精確和徹底背景扣除數(shù)據(jù)處理技術(shù)，用于消渴丸在斑馬魚(yú)體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)分析。該研究在斑馬魚(yú)體內(nèi)共檢測(cè)出消渴丸相關(guān)的13種原型成分和36種代謝物。隨后對(duì)芒柄花黃素在斑馬魚(yú)體內(nèi)代謝分布的研究發(fā)現(xiàn)，其能夠進(jìn)入斑馬魚(yú)體循環(huán)，并與體內(nèi)葡萄糖醛酸結(jié)合形成芒柄花黃素葡萄糖醛酸結(jié)合物，在體內(nèi)廣泛分布，尤以頭部和胃腸道居多。該研究為快速分析中藥復(fù)方在生物體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征及有效活性成分的高通量篩選提供了參考。Wei等[46]建立了基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)合DESI技術(shù)，用于分析大鼠iv人參皂苷Rg1后不同時(shí)間點(diǎn)在各組織切片內(nèi)的空間分布情況，其中人參皂苷Rg1在腎臟濃度最高，隨后依次為肝臟、肺、胰腺、心臟和大腦，并在1 h內(nèi)迅速清除。同時(shí)，該研究亦發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1在腎臟主要集中在腎盂段，而在大腦則分布于腦橋和延髓區(qū)。此項(xiàng)研究真實(shí)地反映了人參皂苷Rg1在各組織中的空間分布信息，為進(jìn)一步探究其療效及藥物開(kāi)發(fā)提供了參考。Meng等[47]使用MALDI-MSI技術(shù)對(duì)紅景天苷在小鼠腎臟、肝臟和脾臟等多個(gè)組織器官切片中的分布情況進(jìn)行成像表征，該研究發(fā)現(xiàn)小鼠iv紅景天苷后，主要分布于肝臟、腎臟和肺中，且在肝臟和肺中呈均勻分布，而在腎臟中則呈不均勻分布，推測(cè)可能與不同組織區(qū)域的血流灌注差異及葡萄糖共同轉(zhuǎn)運(yùn)體的不均勻表達(dá)有關(guān)。同時(shí)該研究證實(shí)MALDI-MSI技術(shù)與傳統(tǒng)技術(shù)分析結(jié)果一致，但能夠?qū)⒓t景天苷在組織中的分布情況可視化，促進(jìn)其對(duì)各器官的生物活性及潛在毒性的研究。Zhang等[48]利用虛擬校準(zhǔn)定量質(zhì)譜成像（virtual calibration quantitative mass spectrometry imaging，VC-QMSI）和AFADESI-MSI方法對(duì)紫杉醇和其前體藥物在整體裸小鼠和其皮下移植腫瘤組織切片中的分布情況進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)在注射紫杉醇或其脂質(zhì)體后，藥物分布在裸小鼠的多個(gè)器官內(nèi)，并且在胃腸道部位積累明顯，而腎臟幾乎無(wú)分布，提示紫杉醇主要通過(guò)膽汁排泄到糞便中。而注射紫杉醇前體藥物后，其與代謝后產(chǎn)生的紫杉醇則主要分布在腫瘤組織部位，并且在腫瘤內(nèi)低分化區(qū)和壞死區(qū)存在明顯特異性聚集。該研究為尋找中藥靶器官、預(yù)測(cè)中藥藥效及安全性具有指導(dǎo)意義。

表2 空間代謝組學(xué)在中藥的生物體內(nèi)代謝及分布研究中的應(yīng)用

4 空間代謝組學(xué)在中藥藥效機(jī)制研究中的應(yīng)用

中藥及中藥復(fù)方因其多成分、多靶點(diǎn)特性在治療復(fù)雜疾病方面具有突出優(yōu)勢(shì)，但也為闡明藥效機(jī)制帶來(lái)了挑戰(zhàn)?？臻g代謝組學(xué)技術(shù)能夠?qū)Υx物在組織整體或微區(qū)的分布進(jìn)行原位表征，并且與組織病理學(xué)結(jié)果相關(guān)聯(lián)，更為深入地揭示藥效與代謝物之間的相互作用，為中藥藥效機(jī)制賦予科學(xué)內(nèi)涵。近年來(lái)基于空間代謝組學(xué)的中藥藥效及作用機(jī)制研究見(jiàn)表3。

Huang等[49]基于DESI-MSI的空間代謝組學(xué)方法，研究人參和西洋參對(duì)大鼠腦內(nèi)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)分布的影響。采用DESI-MSI技術(shù)對(duì)大鼠腦組織切片進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，隨后通過(guò)偏最小二乘判別分析對(duì)溫性和寒性相關(guān)的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行區(qū)分，篩選并鑒定出與人參和西洋參不同特性相關(guān)的神經(jīng)化學(xué)標(biāo)志物。該研究共鑒定了25個(gè)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行了質(zhì)譜成像分析，均主要分布于大腦矢狀面和冠狀面，其中17個(gè)歸類(lèi)為溫性標(biāo)志物，8個(gè)歸類(lèi)為涼性標(biāo)志物。該研究根據(jù)神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的貢獻(xiàn)度證明人參具有溫性，而西洋參具有涼性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)溫性和涼性神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)在大腦不同區(qū)域的分布及含量變化均會(huì)影響機(jī)體功能和代謝的變化，為揭示大鼠腦內(nèi)小分子神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)的空間分布和代謝提供了一種快速有效地可視化方案。Li等[50]利用基于液體萃取表面采樣方法和納米噴霧DESI-MSI（nano-spray DESI-MSI，nanoDESI-MSI）的空間代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)外傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）發(fā)病機(jī)制及血府逐瘀湯治療作用機(jī)制進(jìn)行了研究。采用脂質(zhì)代謝組學(xué)分析空白組、TBI組和血府逐瘀湯治療組大鼠不同腦區(qū)組織的差異脂質(zhì)物質(zhì)，隨后利用微液節(jié)點(diǎn)采樣質(zhì)譜成像技術(shù)分析大鼠腦組織切片，獲取目標(biāo)脂質(zhì)物質(zhì)在不同組大鼠各腦區(qū)的定量空間分布情況，進(jìn)而揭示疾病進(jìn)程及治療響應(yīng)機(jī)制。該研究發(fā)現(xiàn)TBI后損傷區(qū)域外彌漫性變化最大的是中腦區(qū)，并且在中腦和丘腦中多種磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰酸和二酰甘油類(lèi)代謝物含量在血府逐瘀湯治療后顯著升高，這與神經(jīng)炎癥在TBI慢性期激活的“自我修復(fù)”機(jī)制有關(guān)。另外，腦損傷后大部分腦區(qū)內(nèi)的糖鞘脂類(lèi)含量顯著升高，并且包括脂肪酸、氨基酸和嘌呤等在內(nèi)的小分子代謝物在TBI后均發(fā)生明顯變化，涉及10條代謝通路，其中6個(gè)血府逐瘀湯的靶蛋白與上述通路相關(guān)。Zhang等[51]利用脂質(zhì)組學(xué)和MALDI-MSI技術(shù)對(duì)蟾毒靈、華蟾蜍精及聯(lián)合治療作用后的裸鼠腫瘤組織及切片進(jìn)行分析，闡明蟾毒靈聯(lián)合華蟾蜍精抗癌的藥效作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)蟾毒靈聯(lián)合華蟾蜍精使用主要引起腫瘤細(xì)胞中鞘脂和甘油磷脂類(lèi)脂質(zhì)代謝物的改變，進(jìn)一步證實(shí)其影響了相關(guān)代謝酶的表達(dá)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞線粒體驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞凋亡和生物膜的系統(tǒng)性破壞。同時(shí)，該研究通過(guò)對(duì)抗癌脂質(zhì)標(biāo)志物進(jìn)行空間分布可視化，發(fā)現(xiàn)卵磷脂（20∶1/18∶2）和磷脂酰甘油（16∶0/18∶2）等4個(gè)顯著變化的脂質(zhì)代謝物主要分布在腫瘤的實(shí)質(zhì)區(qū)和間質(zhì)區(qū)。該研究為揭示脂質(zhì)重編程在蟾毒靈聯(lián)合華蟾蜍精抗癌中的作用及臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。Tian等[52]首次利用MALDI-MSI技術(shù)對(duì)百里醌治療大鼠腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)百里醌夠改善模型大鼠神經(jīng)行為評(píng)分，減少腦梗死面積及腦水腫，增加損傷后正常神經(jīng)元數(shù)量。進(jìn)一步對(duì)大鼠腦組織切片的質(zhì)譜成像研究發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血區(qū)主要位于受損傷側(cè)的皮層和紋狀體區(qū)域，并且百里醌能夠升高損傷區(qū)能量代謝、抗氧化和磷酯類(lèi)等分子代謝物的含量，揭示了百里醌藥效機(jī)制可能與調(diào)節(jié)能量代謝和小分子基底物質(zhì)代謝有關(guān)。Liu等[53]基于代謝組學(xué)和DESI-MSI技術(shù)研究了聚果榕果治療糖尿病大鼠的潛在藥效機(jī)制。發(fā)現(xiàn)聚果榕果提取物能夠抑制血糖水平并改善組織損傷程度，通過(guò)血清和肝臟代謝學(xué)組及肝臟組織切片質(zhì)譜成像分析結(jié)果相互印證，明確聚果榕果的藥效作用機(jī)制與調(diào)節(jié)氨基酸代謝和能量代謝有關(guān)。該研究為闡明中藥藥效作用機(jī)制提供了新思路。

表3 空間代謝組學(xué)在中藥藥效及作用機(jī)制研究中的應(yīng)用

5 空間代謝組學(xué)在中藥毒性機(jī)制研究中的應(yīng)用

由于中藥中部分藥材存在嚴(yán)重的多器官毒性，使含毒性藥材的中藥復(fù)方安全性備受質(zhì)疑。然而，中藥毒性成分往往是其藥效成分，并具有其他中藥無(wú)法替代的獨(dú)特療效。因此，明確中藥毒性物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制對(duì)有毒中藥的減毒增效、臨床合理應(yīng)用及低毒新藥研發(fā)意義重大?？臻g代謝組學(xué)能夠研究毒性中藥成分及其代謝物在組織器官內(nèi)的分布及生物代謝過(guò)程情況，為確定毒性靶器官并揭示毒性分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

Wang等[54]采用基于AFADESI-MSI技術(shù)的空間代謝組學(xué)方法，研究了馬兜鈴酸I給藥后大鼠腎臟切片的空間代謝譜變化情況并揭示了其腎毒性作用機(jī)制，篩選出了包括肌酸酐、肌酸和精氨酸等在內(nèi)的38個(gè)差異代謝物，涉及通路包括精氨酸-肌酸酐代謝通路、尿素循環(huán)、絲氨酸合成通路、脂類(lèi)、膽堿、組胺、賴氨酸和三磷酸腺苷的代謝通路。通過(guò)質(zhì)譜成像與相鄰組織的病理切片對(duì)比發(fā)現(xiàn)，涉及代謝物主要分布在腎組織形態(tài)改變的病理病變區(qū)域。此外，發(fā)現(xiàn)給予馬兜鈴酸I后大鼠腎皮質(zhì)的代謝變化比腎外髓質(zhì)和腎內(nèi)髓質(zhì)的代謝變化更顯著，提示腎皮質(zhì)對(duì)馬兜鈴酸I毒性更為易感。與傳統(tǒng)代謝組學(xué)技術(shù)分析結(jié)果相比，該研究可視化了差異代謝物在組織內(nèi)的空間分布情況，更有利于篩選與藥物毒性密切相關(guān)的原位生物標(biāo)志物，揭示潛在的毒性分子機(jī)制。Li等[55]通過(guò)空間代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)方法對(duì)魚(yú)藤酮致小菜蟲(chóng)毒性作用機(jī)制進(jìn)行了研究。通過(guò)對(duì)小菜蟲(chóng)整體切片的質(zhì)譜成像分析發(fā)現(xiàn)，單磷酸腺苷和肌苷在小菜蛾全身分布且在魚(yú)藤酮暴露后水平顯著升高，而鳥(niǎo)苷-5′-單磷酸和色氨酸則顯著下調(diào)，提示魚(yú)藤酮能夠影響小菜蛾體內(nèi)嘌呤和氨基酸代謝。空間脂質(zhì)組學(xué)結(jié)果表明，魚(yú)藤酮可顯著破壞小菜蛾細(xì)胞膜中的甘油磷脂，抑制脂肪酸生物合成，消耗甘油二酯，促進(jìn)脂肪氧化。該研究表明空間代謝組學(xué)不僅能夠發(fā)現(xiàn)代謝變化，而且亦可揭示代謝變化涉及的特定組織區(qū)域及關(guān)鍵代謝途徑，為中藥的毒性作用機(jī)制研究提供了新方案。Jiang等[56]采用空間代謝組學(xué)與網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)整合分析方法，對(duì)何首烏導(dǎo)致肝毒性作用機(jī)制進(jìn)行研究。利用網(wǎng)絡(luò)毒理學(xué)篩選出何首烏的30個(gè)潛在肝毒性作用靶點(diǎn)，涉及的通路包括磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、絲裂原活化蛋白激酶、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、Ras和缺氧誘導(dǎo)因子-1通路，并且分子對(duì)接結(jié)果證實(shí)8個(gè)關(guān)鍵毒性成分與mTOR、PIK3CA和Akt1等10個(gè)核心靶點(diǎn)具有高結(jié)合活性。對(duì)小鼠肝臟切片的空間代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，何首烏提取物給予小鼠后肝臟代謝分布顯著改變，篩選出?；撬帷⑴；悄懰帷⑾佘蘸鸵阴Ｈ舛緣A類(lèi)等小分子代謝物與何首烏肝毒性有關(guān)，涉及通路包括亞麻酸和亞油酸代謝、肉毒堿合成和支鏈脂肪酸氧化等6條代謝通路。隨后，整合分析發(fā)現(xiàn)何首烏導(dǎo)致肝毒性機(jī)制與膽汁淤積、線粒體損傷、氧化應(yīng)激和能量、脂質(zhì)代謝紊亂密切相關(guān)，為何首烏的肝毒性機(jī)制及安全臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

6 結(jié)語(yǔ)與展望

空間代謝組學(xué)是近年來(lái)基于質(zhì)譜成像技術(shù)逐漸發(fā)展起來(lái)的組學(xué)研究新方法，其填補(bǔ)了傳統(tǒng)代謝組學(xué)對(duì)原位可視化分析的不足，在尋找潛在生物標(biāo)志物和闡明疾病的發(fā)病機(jī)制等方面取得了諸多研究成果，已成為生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。將空間代謝組學(xué)技術(shù)引入到中藥領(lǐng)域研究中，能夠?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制、體內(nèi)代謝分布、藥效機(jī)制和毒性機(jī)制的研究提供新的視角。然而，目前空間代謝組學(xué)在中藥領(lǐng)域的研究仍處于起步發(fā)展階段，在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中，仍然存在諸多不足，可以從以下方面開(kāi)展深入研究：（1）空間代謝組學(xué)在樣本制備、數(shù)據(jù)采集和處理等其他關(guān)鍵性操作過(guò)程中尚未形成統(tǒng)一規(guī)范的操作準(zhǔn)則，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性較差，因此有必要建立規(guī)范的空間代謝組學(xué)操作流程和定量分析方法；（2）空間代謝組學(xué)利用質(zhì)譜成像儀捕獲組織切片中代謝物的精確質(zhì)譜信息，儀器的靈敏度和分辨率對(duì)后續(xù)分析至關(guān)重要，而提高檢測(cè)分辨率將大大延長(zhǎng)成像時(shí)間，因此迫切需要能夠兼顧高分辨率和成像速度的新型高靈敏度質(zhì)譜成像設(shè)備；（3）深入開(kāi)展中藥活性/毒性成分及其代謝產(chǎn)物與體內(nèi)差異代謝物的空間分布關(guān)聯(lián)性研究，進(jìn)而明確中藥活性/毒性成分及其作用靶區(qū)，更精確地闡明中藥的藥效或毒性作用機(jī)制；（4）將空間代謝組學(xué)與空間蛋白質(zhì)組學(xué)和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)等空間組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平對(duì)中藥質(zhì)量控制、代謝分布及藥效或毒性機(jī)制等的深層次研究。綜上所述，空間代謝組學(xué)技術(shù)在中藥領(lǐng)域的研究仍存在巨大的發(fā)展空間，經(jīng)過(guò)不斷地完善與創(chuàng)新，必然會(huì)進(jìn)一步推動(dòng)中藥的現(xiàn)代化發(fā)展。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Application of spatial metabolomics in traditional Chinese medicine research

ZHAO Jie1, 2, FENG Su-xiang1

1. Academy of Chinese Medical Sciences, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China 2. Collaborative Innovation Center for Chinese Medicine and Respiratory Diseases Co-constructed by Henan province & Education Ministry of P. R., Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China

Spatial metabolomics is an emerging technology based on the development of mass spectrometry imaging and metabolomics technology, which accurately reflects the metabolic network changes of metabolites in the whole or micro regions of the tissue by detecting the molecular structure, spatial distribution, and content changes of endogenous small molecules and exogenous drug metabolites in biological systems, and reveals the efficacy material basis and mechanism of traditional Chinese medicine (TCM) in depth. This study aims to review the research achievements of spatial metabolomics technology in the quality control, metabolism and distribution in organism, pharmacodynamic mechanism, and the toxicity mechanism of TCM in recent years, providing a theoretical basis for exploring the research of TCM based on spatial metabolomics technology.

spatial metabolomics; traditional Chinese medicine; quality control; metabolism and distribution; pharmacodynamic mechanism; toxicity mechanism

R285

A

0253 - 2670(2023)20 - 6569 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.20.001

2023-05-10

河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專(zhuān)項(xiàng)課題（2023ZY1029）；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（232102311215）；中國(guó)博士后科學(xué)基金（2020M672244）

趙 杰，博士，講師，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制研究。E-mail: jiezhao1702@163.com

通信作者：馮素香，博士生導(dǎo)師，教授，從事中藥質(zhì)量分析與新藥研究。E-mail: fengsx221@163.com

[責(zé)任編輯 趙慧亮]