黑曲霉酸性果膠裂解酶在大腸桿菌中的表達(dá)和酶學(xué)性質(zhì)研究

張海云,馬佳寧,李陽陽,陽鵬輝,宋偉艷,劉松

1(江南大學(xué) 未來食品科學(xué)中心,江蘇 無錫,214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122)3(大連理工大學(xué) 化工學(xué)院,遼寧 大連,116024)

果膠酶是指能分解果膠物質(zhì)的復(fù)合酶類,一般包括原果膠酶、多聚半乳糖醛酸酶、果膠酯酶及果膠裂解酶等[1-3]。果膠裂解酶(EC 1.10.3.2)能夠以β-反式消去作用斷裂植物細(xì)胞中果膠的α-1,4糖苷鍵,形成不飽和寡聚半乳糖醛酸[2]。其中,酸性果膠裂解酶是指能在低pH條件下發(fā)揮作用的裂解酶,該酶在果汁、釀酒等工業(yè)中具有廣泛應(yīng)用[4]。酸性果膠裂解酶主要來自于黑曲霉(Aspergillusniger)[5]、大豆曲霉[6]、黃曲霉[7]、假絲酵母[8]和釀酒酵母[9]等。然而,天然果膠裂解酶的耐酸性還有待提高[10-14]。構(gòu)建高效、易操作的表達(dá)平臺是酸性果膠裂解酶分子改造的重要前提。

目前,酵母為酸性果膠裂解酶的主要表達(dá)宿主[15]。然而,酵母等真菌的基因操作周期長、菌體生長緩慢、效率低,不是酶分子改造的理想平臺[16-17]。與酵母等真菌表達(dá)體系相比,大腸桿菌Escherichiacoli具有發(fā)酵周期短、操作簡單的優(yōu)良特性,是較為理想的重組蛋白生產(chǎn)改造的宿主細(xì)胞。此外,一些真菌(Penicilliumoccitanis[18]和A.niger[19-20]等)的酸性果膠裂解酶雖已在E.coli中表達(dá),但無活性的包涵體是其主要存在形式。研究通過體外復(fù)性,可使40%的重組P.occitanis酸性果膠裂解酶包涵體重新折疊為可溶性活性蛋白[21]。然而,體外復(fù)性顯著增加了操作步驟,降低了酶蛋白制備效率[22]。

在E.coli中,蛋白標(biāo)簽的融合可以提高蛋白質(zhì)的溶解性[23]。常用來提高溶解性的蛋白標(biāo)簽有碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(carbohydrate-binding structural domain, CBM)、麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding protein, MBP)、大腸桿菌硫氧還原蛋白(thioredoxins, TrxA)、谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)[24]。例如,有研究通過融合TrxA蛋白標(biāo)簽策略優(yōu)化了HIV-1蛋白酶(一種逆轉(zhuǎn)錄病毒天冬酰胺蛋白酶)在E.coli中的異源表達(dá),表達(dá)量從0.83 mg/L提升到2.5 mg/L,有效提高了蛋白的溶解性[25-26]。

在本研究中,通過融合蛋白標(biāo)簽CBM、MBP、TrxA、GST優(yōu)化,提高來源于A.nigerAG11的酸性果膠裂解酶pelA(GenBank No.ANI_1_624124)在E.coliBL21(DE3)中的表達(dá)水平,構(gòu)建pelA在E.coli中的分子改造平臺,并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

A.nigerAG11、E.coliJM109、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒pET-28a(+)、蛋白標(biāo)簽CBM、MBP、TrxA、GST均由實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 主要試劑

柱回收試劑盒、蛋白質(zhì)marker,Thermo公司;大腸桿菌感受態(tài)制備試劑盒、限制性內(nèi)切酶、Primer STAR Max DNA聚合酶,大連TaKaRa公司;SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、真菌基因組DNA快速提取試劑盒、一步克隆試劑盒、卡納青霉素、重組HRV 3C蛋白酶、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG),上海生工公司;蛋白胨和酵母粉,Oxoid公司;底物柑橘果膠,美國Sigma公司;Bradford蛋白濃度檢測試劑盒,碧云天公司;蛋白電泳loading buffer和Bis-Tris預(yù)制凝膠,Invitrogen公司。其他常規(guī)試劑及藥品為國產(chǎn)或進(jìn)口分裝。

1.1.3 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10,自然pH。

TB(terrific broth)培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨12,酵母粉24,KH2PO4·3H2O 16.4,KH2PO42.31,甘油5,自然pH。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,土豆200,瓊脂15,自然pH。

上述培養(yǎng)基均121 ℃滅菌15 min。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1A.niger基因組的提取

將A.niger孢子懸液涂布于PDA培養(yǎng)基,在30 ℃下靜置培養(yǎng)4～7 d。加入無菌水刮取固體培養(yǎng)基表面上的孢子,經(jīng)濾膜過濾后接種于PDB培養(yǎng)基中,30 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h。通過離心及紗布過濾收集菌絲體,置于滅菌的研缽中(加液氮)研磨至細(xì)小粉末,用離心管收集待用。A.niger基因組使用真菌基因組DNA快速提取試劑盒提取。

1.2.2 PelA基因的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建

以A.nigerAG11基因組為模板,通過NCBI中的BLAST對序列進(jìn)行分析,編碼pelA的基因具有1 357 bp(包括4個(gè)內(nèi)含子)。使用SignalP 5.0進(jìn)行信號肽預(yù)測,pelA基因5′端有信號肽,可能會影響其在E.coli中的表達(dá),故使用表1中的引物AF和AR進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到切除信號肽,但帶有內(nèi)含子的pelA基因。擴(kuò)增程序?yàn)?98 ℃預(yù)變性3 min;98 ℃變性10 s;55 ℃退火15 s;72 ℃延伸50 s;循環(huán)32次;最后72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳檢測,對產(chǎn)物進(jìn)行純化并測序。使用NcoⅠ和XhoⅠ對pET-28a(+)載體和PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切。使用Solution Ⅰ分別將PCR產(chǎn)物連接至pET-28a(+)載體的雙酶切片段,并轉(zhuǎn)化至E.coliJM109。按照表1所示引物,使用Aex2F、Aex2R、Aex3F、Aex3R、Aex4F、Aex4R、Aex5F、Aex5R對重組載體進(jìn)行PCR以切除內(nèi)含子。用磷酸化酶處理所得PCR產(chǎn)物,并使用Solution Ⅰ連接酶連接,得到pelA表達(dá)載體pET-28a(+)-pelA。將其轉(zhuǎn)化至E.coliJM109,挑取4～6個(gè)轉(zhuǎn)化子送公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的菌株重新活化培養(yǎng)12 h后,參考質(zhì)粒提取說明書提取質(zhì)粒,得到重組質(zhì)粒pET-28a(+)-pelA。

1.2.3 重組pelA的表達(dá)

將構(gòu)建的pET-28a(+)-pelA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3),得到重組菌pET-28a(+)-pelA/BL21(DE3)。將重組菌接種于LB液體培養(yǎng)基(含50 g/L卡那霉素)中活化,37 ℃,220 r/min培養(yǎng)10 h。按照3%(體積分?jǐn)?shù))接種量轉(zhuǎn)接至TB發(fā)酵培養(yǎng)基(含50 g/L卡那霉素)中,在37 ℃,220 r/min搖床中培養(yǎng)至OD600約為1.0時(shí),加入IPTG(終濃度為2 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá),20 ℃、220 r/min培養(yǎng)24 h。

將重組菌發(fā)酵液離心并收集菌體,加入與發(fā)酵液等體積Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L,pH 7.0)重懸,置于冰水浴中超聲破碎。將超聲破碎儀的變幅桿末端插入樣品,在距離液面10～15 mm的中心位置固定,以間隙2 s、工作2 s為周期超聲處理4 min。整個(gè)超聲過程中樣品一直處于冰浴狀態(tài)。4 ℃、10 000 r/min離心20 min,分別測定菌裂解上清液和菌裂解液沉淀的酶活力,并對其進(jìn)行SDS-PAGE檢測。

1.2.4 蛋白標(biāo)簽優(yōu)化提高胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平

為篩選蛋白標(biāo)簽CBM、MBP、TrxA、GST,采用一步克隆法分別將蛋白標(biāo)簽的基因序列融合到目的基因的5′端,使用表1所示引物進(jìn)行PCR?；虿僮鲄⒖?.2.2節(jié)的方法。挑取4～6個(gè)轉(zhuǎn)化子送公司進(jìn)行驗(yàn)證。將驗(yàn)證正確的菌株重新活化培養(yǎng)12 h后,參考質(zhì)粒提取說明書提取質(zhì)粒,獲得重組質(zhì)粒pET-28a(+)-pelA+CBM、pET-28a(+)-pelA+MBP、pET-28a(+)-pelA+TrxA、pET-28a(+)-pelA+GST。轉(zhuǎn)化進(jìn)感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21(DE3)中,構(gòu)成重組菌株pET-28a(+)-pelA+CBM/BL21(DE3)、pET-28a(+)-pelA+MBP/BL21(DE3)、pET-28a(+)-pelA+TrxA/BL21(DE3)、pET-28a(+)-pelA+GST/BL21(DE3)。培養(yǎng)方式參考1.2.3節(jié)。取菌裂解上清液測酶活力,比較不同蛋白標(biāo)簽對pelA胞內(nèi)表達(dá)的影響。

1.2.5 重組酶的分離純化

使用鎳親和層析柱(HisTrapTMFF)對重組酶pelA+CBM進(jìn)行分離純化。緩沖液A:50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5;緩沖液B:50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,500 mmol/L咪唑。取50 mL菌裂解上清液于0.22 μm 水系膜過濾后,上樣至用緩沖液A平衡的HisTrapTM FF。用5%的緩沖液B沖洗純化柱后,40%緩沖液B(含200 mmol/L咪唑)洗脫獲得重組酶pelA+CBM,用脫鹽柱Sephadex G25脫鹽,使用SDS-PAGE檢測其純度。

1.2.6 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)測定

對脫鹽后的重組pelA酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)分析。取出部分重組pelA+CBM酶,使用重組HRV 3C蛋白酶在4 ℃下處理16 h,以切除蛋白標(biāo)簽CBM。再經(jīng)過鎳親和層析柱對pelA進(jìn)行分離純化,獲得純pelA。比較蛋白標(biāo)簽切除前后的酶學(xué)性質(zhì)的差異。

最適反應(yīng)溫度:在pH 5.2條件下,測定不同反應(yīng)溫度(30～80 ℃)下的酶活力,以最大的酶活力為100%。

溫度穩(wěn)定性:將酶液置于不同溫度(30～80 ℃)處理2 h后,在標(biāo)準(zhǔn)條件下測定殘余酶活力,以未處理組的酶活力為100%。

最適反應(yīng)pH:在最適反應(yīng)溫度下,測定不同pH值(3.0～7.0)Na2HPO4-檸檬酸鹽緩沖液條件下的酶活力,使用相應(yīng)pH值的緩沖液配制底物,以最大的酶活力為100%。

pH穩(wěn)定性測定:將酶液置于不同pH值的(3.0～7.0)Na2HPO4-檸檬酸鹽緩沖液中,40 ℃條件下處理2 h,測定殘余酶活力,以未處理組的酶活力為100%。

1.2.7 重組酶的酶反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)測定

在酶的最適條件下測定質(zhì)量濃度為0～5 g/L的柑橘果膠的初始酶活力。根據(jù)上述酶反應(yīng)的數(shù)據(jù),繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖,計(jì)算酸性果膠裂解酶的Km和kcat。

1.2.8 重組酶活力和蛋白含量的測定

采用HCl法測定酸性果膠裂解酶活力。將5 g/L柑橘果膠溶解于0.08 mol/L琥珀酸-琥珀酸鈉(pH 5.2)緩沖液中,用作底物。取2.9 mL底物,在30 ℃下預(yù)熱3 min后與100 μL適當(dāng)稀釋的粗酶液混合,30 ℃反應(yīng)30 min,加入1 mL的2 mol/L HCl終止液終止反應(yīng),在235 nm下測定其吸光度。1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)酶活力單位定義為:在測定條件下,每分鐘生成1 μmol雙鍵所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U)。采用Bradford法測定酶蛋白濃度,蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為牛血清蛋白。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究采用Origin 8.5軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey’s檢驗(yàn)(P<0.05和P<0.01),實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±方差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酸性果膠裂解酶重組菌株的構(gòu)建及表達(dá)

以A.nigerAG11基因組為模板,獲得切除信號肽和內(nèi)含子的pelA基因序列。電泳分析顯示,PCR產(chǎn)物的大小約為1 077 bp,符合理論值(圖1-a)。將PCR產(chǎn)物克隆至pET-28a(+)的NcoI-XhoI位點(diǎn),得到編碼pelA的質(zhì)粒pET-28a(+)-pelA’?；谝徊娇寺》ㄇ谐齪ET-28a(+)-pelA’中pelA的內(nèi)含子序列,進(jìn)一步構(gòu)建得到pelA表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-pelA(圖1-b)。上述表達(dá)質(zhì)粒序列均經(jīng)測序驗(yàn)證。

a-pelA PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析;b-pET-28a/pelA載體圖譜

SDS-PAGE分析顯示,pET-28a(+)-pelA/BL21(DE3)菌裂解上清液與沉淀部分均有pelA條帶(理論量38.8 kDa),但空白對照菌裂解液沉淀部分不存在該條帶,菌裂解上清液隱約出現(xiàn)疑似pelA條帶,應(yīng)為背景蛋白。初步判斷pelA在E.coliBL21(DE3)中成功表達(dá),且大部分以包涵體形式存在(圖2-a)。對pET-28a(+)-pelA/BL21(DE3)和空白對照菌裂解上清液與沉淀分別測定酶活力,在空白對照的菌裂解上清液與沉淀中都未檢測到pelA活性,而在pET-28a(+)-pelA/BL21(DE)組的菌裂解上清液中檢測到0.79 U/mL的酶活力,其菌裂解液沉淀也不具有活性(圖2-b)。上述結(jié)果表明,pelA在E.coli成功表達(dá),但主要以包涵體形式存在。大量研究表明,E.coli在表達(dá)外源蛋白時(shí)會抑制其在體內(nèi)的過量表達(dá),導(dǎo)致表達(dá)量降低、產(chǎn)生包涵體等,而將蛋白標(biāo)簽與目的蛋白進(jìn)行融合表達(dá),可以明顯提高蛋白質(zhì)產(chǎn)物的溶解性[21, 25-27]。因此,本研究采用融合蛋白標(biāo)簽的方式來提高pelA的溶解性,便于對其性質(zhì)進(jìn)行研究及后期改造。

M:蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量;1:pET-28a/pelA菌裂解液上清液;2:pET-28a/pelA菌裂解液沉淀;3:pET-28a(+)菌裂解液上清空白對照;4:pET-28a(+)菌裂解液沉淀空白對照a-重組菌表達(dá)pelA的SDS-PAGE分析;b-重組菌菌裂解液上清液和菌裂解液沉淀酶活柱狀圖

2.2 融合標(biāo)簽優(yōu)化提高pelA表達(dá)水平

將蛋白標(biāo)簽MBP、TrxA、CBM、GST的基因序列分別融合到pelA基因的5′端,構(gòu)建pET-28a(+)-pelA+MBP、pET-28a(+)-pelA+TrxA、pET-28a(+)-pelA+CBM和pET-28a(+)-pelA+ GST 表達(dá)載體(圖3-a)。將它們分別轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中,并在20 ℃,220 r/min下發(fā)酵24 h。分別測定菌裂解上清液中pelA的酶活力,結(jié)果顯示,蛋白標(biāo)簽的融合均有提高pelA活性的作用。與重組菌pET-28a(+)-pelA/BL21(DE3)產(chǎn)pelA的胞內(nèi)活性相比,重組菌pET-28a(+)-pelA+MBP/BL21(DE3)、pET-28a(+)-pelA+TrxA /BL21(DE3)、pET-28a(+)-pelA+GST/BL21(DE3)、pET-28a(+)-pelA+CBM/BL21(DE3)的胞內(nèi)活性分別提高了2.47、2.79、2.85、4.12倍。其中,重組菌pET-28a(+)-pelA+CBM/BL21(DE3)菌裂解上清液中酶活力最高,達(dá)到3.25 U/mL(圖3-b)。通過SDS-PAGE結(jié)果發(fā)現(xiàn),與其他3種融合蛋白標(biāo)簽(MBP、TrxA、GST)的蛋白條帶相比,融合CBM的菌裂解液沉淀蛋白條帶較細(xì),而菌裂解上清液中的蛋白條帶較粗(圖3-c)。其中融合蛋白標(biāo)簽MBP的菌裂解上清液蛋白條帶雖然很粗,但其活力不高,這可能是因?yàn)镸BP標(biāo)簽較大,對蛋白結(jié)構(gòu)功能有影響。以上結(jié)果說明,蛋白標(biāo)簽CBM能提高胞內(nèi)表達(dá)量,有效減少包涵體的形成。而采用包涵體體外復(fù)性法,雖然使重組P.occitanis酸性果膠裂解酶的酶活力提高3.9倍[21],但蛋白制備過程繁瑣,且提高效果不如融合蛋白標(biāo)簽CBM的方法。因此選取重組菌pET-28a(+)-pelA+CBM/BL21(DE3)對pelA酶進(jìn)行表達(dá)。

M:蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量;1:pelA+MBP菌裂解液上清液;2:pelA+MBP菌裂解液沉淀;3:pelA+TrxA菌裂解液上清液;4:pelA+TrxA菌裂解液沉淀;5:pelA+CBM菌裂解液上清液;6:pelA+CBM菌裂解液沉淀;7:pelA+GST菌裂解液上清液;8:pelA+GST菌裂解液沉淀(不同蛋白標(biāo)簽重組酶用箭頭指出)a-重組蛋白標(biāo)簽優(yōu)化菌株表達(dá)載體構(gòu)建;b-重組蛋白標(biāo)簽優(yōu)化菌株菌裂解液上清酶活力;c-蛋白標(biāo)簽優(yōu)化表達(dá)pelA的SDS-PAGE分析

2.3 重組pelA的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 重組pelA的純化和動力學(xué)參數(shù)測定

用0.22 μm的濾膜過濾菌裂解上清液,用40%的緩沖液B洗脫pelA+CBM,獲得目的蛋白條帶,蛋白條帶與理論值相符。取出一部分洗脫蛋白,用重組HRV 3C蛋白酶在4 ℃下處理16 h,切除蛋白標(biāo)簽CBM,獲得目的蛋白條帶pelA,蛋白條帶符合理論值(圖4)。脫鹽后測定蛋白濃度和酶活力。

M:蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量;1～2:30%B液洗脫pelA+CBM;3～5:40%緩沖液B洗脫pelA+CBM;6:酶切標(biāo)簽后40%緩沖液B洗脫pelA

為了研究CBM對pelA催化性能的影響,測定了最適條件下pelA+CBM和pelA以柑橘果膠為底物時(shí)的動力學(xué)參數(shù),其結(jié)果列于表2。結(jié)果顯示,pelA的Km是pelA+CBM的1.66倍,表明pelA+CBM對柑橘果膠底物的親和力比pelA的強(qiáng)。pelA的kcat/Km比pelA+CBM低48.81%,這表明切除CBM后pelA的催化效率降低。這些結(jié)果證明CBM可以提高pelA的催化效率,正如一些研究所證明的,CBM具有通過與底物特異性結(jié)合來增強(qiáng)底物與催化模塊長期接觸的鄰近效應(yīng)作用,從而提高酶的催化效率[28-29]。

2.3.2 重組pelA的酶學(xué)性質(zhì)測定

在30～40 ℃時(shí),pelA+CBM 和pelA的相對酶活力均呈現(xiàn)上升趨勢。當(dāng)溫度>40 ℃時(shí),pelA的相對酶活力呈下降趨勢,而pelA+CBM相對酶活力在溫度>50 ℃時(shí)開始下降;反應(yīng)溫度>70 ℃時(shí),相對酶活力<40%,此時(shí)pelA+CBM的相對酶活力驟降,當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí),相對酶活力低至40%以下(圖5-a)。以上結(jié)果說明40 ℃為pelA的最適反應(yīng)溫度,而pelA+CBM的最適溫度為50 ℃。

a-不同溫度下酶的催化活性;b-不同溫度處理2 h的剩余酶活力;c-不同pH下酶的催化活性;d-不同pH處理2 h的剩余酶活力

將pelA+CBM和pelA分別置于不同溫度(30～80 ℃)孵育2 h后測定殘余酶活力。當(dāng)在溫度為30～50 ℃時(shí)孵育2 h,pelA的相對酶活力保持在80%以上,說明該重組酶在30～50 ℃熱穩(wěn)定性較好。但當(dāng)該重組酶在溫度60 ℃時(shí)孵育2 h后,相對酶活力下降至40%以下。pelA+CBM在孵育溫度為30～70 ℃時(shí)均呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性,但當(dāng)溫度上升至80 ℃時(shí),相對酶活力驟降,低于40%(圖5-b)。上述結(jié)果表明,CBM對pelA的熱穩(wěn)定性有積極影響,這與研究表明的CBM具有提高酶穩(wěn)定性的能力相契合[30]。

當(dāng)反應(yīng)體系在pH 4.0～6.0,pelA的相對酶活力均高于70%。在pH 5.0時(shí)測得最高酶活力,而當(dāng)pH>6.0,酶活力下降至60%以下。pelA+CBM在pH 3.0～7.0均有60%以上的相對酶活力,且在pH 6.0時(shí)達(dá)到最高(圖5-c)。由此可知,重組酶pelA和pelA+CBM在酸性條件下均具有較好的酶活力。然而,當(dāng)融合CBM時(shí),pelA的最適pH從5.0升至6.0,推測與CBM具有提高酶的穩(wěn)定性能力有關(guān)。

為測定pelA和pelA+CBM在不同pH條件下的耐受性,將其分別置于不同pH(3.0～7.0)的緩沖液中,40 ℃下孵育2 h后測定殘余酶活力。當(dāng)pH 4.0～5.0時(shí),pelA孵育2 h后相對酶活力保持在60%以上(圖5-d),該重組酶在酸性條件下具有較好的穩(wěn)定性;而當(dāng)pH>5.0時(shí),相對酶活力開始下降,在pH為7.0時(shí)相對酶活力<35%。相反,pelA+CBM在pH為4.0～7.0時(shí)均有80%以上的相對酶活力,這個(gè)結(jié)果說明,CBM對pelA在中性或堿性環(huán)境下的穩(wěn)定性有影響[30]。

3 結(jié)論

酸性果膠裂解酶作為一種能在酸性環(huán)境下裂解高酯化果膠的果膠酶,在果蔬汁食品產(chǎn)業(yè)、醫(yī)藥與天然產(chǎn)物的提取等方面有著重要的應(yīng)用。E.coli作為常用的原核表達(dá)系統(tǒng),擁有生長周期短、成本低、操作簡便等優(yōu)勢,常被用來異源表達(dá)蛋白酶。然而酸性果膠裂解酶在E.coli中多以包涵體形式存在,雖然可以通過包涵體復(fù)性的方式提高其溶解度,但操作繁瑣,酶蛋白制作效率低,使E.coli無法作為酸性果膠裂解酶的分子改造平臺。對此,有研究者將酸性果膠裂解酶的分子改造在真菌或酵母中進(jìn)行。但存在宿主生長緩慢,實(shí)驗(yàn)操作步驟繁瑣以及改造周期長等問題。本研究成功構(gòu)建了重組pelA在E.coli中的表達(dá)系統(tǒng),通過N端融合蛋白標(biāo)簽減少pelA包涵體的形成。該方法有效提高了蛋白溶解性,使pelA的表達(dá)量從0.79 U/mL提升至3.25 U/mL,便于對pelA進(jìn)行純化及性質(zhì)測定,同時(shí)降低酶蛋白制備成本,提高分子改造效率。此外,對E.coli產(chǎn)pelA的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行測定,結(jié)果表示該酶在pH 4.0～6.0、30～50 ℃均有較好的穩(wěn)定性,其最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH分別為40 ℃和5.0。為了滿足實(shí)際生產(chǎn)時(shí)對耐酸性和熱穩(wěn)定性的要求,可通過定向進(jìn)化或理性設(shè)計(jì)對酶分子進(jìn)行改造。本研究構(gòu)建的酸性果膠裂解酶表達(dá)菌株成功使A.niger酸性果膠裂解酶在E.coli中表達(dá),這為后續(xù)重組pelA的分子改造提供了重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。