馬蹄金中10種真菌毒素UPLC-MS/MS檢測方法的建立

覃冬杰，丘 瑩，王宏虹，李 萍，黃惠琳

(1.柳州市質(zhì)量檢驗檢測研究中心，廣西 柳州 545006；2.廣州市婦女兒童醫(yī)療中心柳州醫(yī)院，廣西 柳州 545616；3.廣西-東盟食品檢驗檢測中心，廣西 南寧 530022)

馬蹄金又被稱為黃疸草，為旋花科植物馬蹄金Dichondra micranthaUlb.的全草，具有清熱解毒，利濕通淋，散瘀消腫的功效，民間多用于治療急性黃疸、痢疾、膀胱結(jié)石、跌打損傷等癥[1-2]，收錄于《廣西瑤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》.現(xiàn)代研究表明，馬蹄金主要含有黃酮、有機酸、揮發(fā)油、糖類及微量元素等多種成分，藥理研究其含有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、保肝降酶等作用[3].由于管理技術(shù)的不夠科學(xué)，馬蹄金在種植過程中易受產(chǎn)毒真菌的污染.因此，檢測馬蹄金中真菌毒素的含量，是保證其安全的關(guān)鍵.

真菌毒素是由產(chǎn)毒真菌產(chǎn)生的一種小分子代謝產(chǎn)物，其主要的毒性作用包括致畸作用、致癌作用、基因毒性、肝毒性、腎毒性、生殖系統(tǒng)紊亂和免疫抑制等[4-8].目前液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法是一種比較可靠、快速、靈敏度高的多種真菌毒素檢測主流方法.特別是UPLC-MS/MS 技術(shù)，因為分離精度和靈敏度都比較高，可以同時檢測多種真菌毒素，因此被廣泛應(yīng)用于真菌毒素的檢測領(lǐng)域[9-11].QuEChERS 方法以多種凈化材料為基礎(chǔ)，能去除多種雜質(zhì)干擾，且操作簡便、快速，在中藥材真菌毒素的檢測中應(yīng)用愈加廣泛[12-15].本研究基于QuEChERS 方法的前處理技術(shù)，結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用法建立馬蹄金中10種真菌毒素檢測方法，為規(guī)范馬蹄金藥材的種植，控制其質(zhì)量及用藥安全性提供科學(xué)基礎(chǔ).

1 儀器與材料

1.1 儀器

超高效液相色譜儀(型號LC-30AD，日本島津公司)；三重四級桿質(zhì)譜儀(型號Triple Quad 4500，美國AB SCIEX 公司)；超聲波清洗器(型號SK8200HP，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；臺式高速離心機(型號3-3OK，德國Sigma 公司)；震蕩器(型號VIBRAX VXR，德國IKA 集團)；氮吹儀(型號TTL-DCII 型，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司)；電子分析天平(型號XP26，瑞士梅特勒托利多公司)；超純水器(型號24 UV，德國默克密理博公司).

1.2 材料

AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA、ZEN、FB1、FB2、T-2、DON 對照品，純度均大于95%，購于新加坡Pribolab 公司；流動相所用色譜純乙腈由美國Fisher Scientific 公司提供；GCB、PSA、C18 購自上海月旭科技股份有限公司；水為自制超純水.

1.3 樣品來源

共采集馬蹄金10 批，所有樣品的原植物經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)朱丹教授鑒定，其植物來源均為旋花科植物馬蹄金D.micranthaUlb..樣品干燥處理，各樣品采集區(qū)域見表1.

表1 馬蹄金樣品來源Table 1 Sample source of D.micrantha Ulb.

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱:Boltimate C18(2.1×100 mm，2.6 μm)；柱溫:30 ℃；流速:0.3 mL/min；梯度洗脫，流動相A:0.1%甲酸溶液，流動相B:乙腈；洗脫條件:初始90%A (0～1.5 min)，90%A～70%A(1.5～2.5 min)，70%A～50%A(2.5～6.0 min)，50%A～10%A(6.0～10.0 min)，10%A～90%A(10.0～10.5 min)，90%A(10.5～13.0 min)；進樣量:1 μL.

2.1.2 質(zhì)譜條件

離子源:ESI(電化學(xué)噴霧離子源)；電離模式:正、負(fù)離子同時電離；監(jiān)測采集模式:MRM(多反應(yīng)監(jiān)測模式)；離子源溫度:550 ℃；氣簾壓力:25 psi；霧化器壓力45 psi；輔助加熱器壓力:55 psi.各組分質(zhì)譜參數(shù)見表2，MRM 色譜圖見圖1.

圖1 10 種真菌毒素MRM 色譜圖Fig.1 The MRM chromatograms of 10 mycotoxins

表2 10 種真菌毒素質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters of 10 mycotoxins

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品適量，加甲醇分別制成濃度為5 μg/mL的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、OTA、ZEN、FB1、FB2、T-2 單標(biāo)儲備液和濃度為500 μg/mL 的DON 單標(biāo)儲備液，置于－20 ℃的冰箱中，備用.

2.3 樣品溶液的制備

將樣品粉碎并過二號篩后，精密稱取2 g，置50 mL離心管，精密加入15 mL 含1%乙酸的乙腈溶液，渦旋1 min，超聲處理10 min，加入2 g 無水MgSO4和0.5 g NaCl，立即渦旋2 min，離心5 min(4 000 r/min)，精密量取上清液5 mL 置10 mL 離心管中，加入300 mg PSA、100 mg C18和500 mg 無水MgSO4，渦旋2 min，離心5 min(4 000 r/min)，取上清液，40 ℃氮氣吹至近干，加入初始流動相定容至1 mL，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得.

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

當(dāng)SSE(空白基質(zhì)溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率與純?nèi)軇┡渲频臉?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率的比值)在80%～120%范圍之外時，表明存在基質(zhì)抑制或基質(zhì)增強作用，而如果SSE 在此范圍之內(nèi)，則基質(zhì)效應(yīng)所帶來的影響可以忽略不計.結(jié)果:AFB1、AFB2、AFG1、ZEN、T-2、DON 存在基質(zhì)抑制作用，F(xiàn)B1、FB2存在基質(zhì)增強作用，為補償基質(zhì)效應(yīng)的影響，選用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進行定量分析，見表3.

表3 10 種真菌毒素線性方程及檢出限、定量限Table 3 Linear equations and limits of detection and quantification of 10 mycotoxins

2.5 線性方程與檢出限、定量限

取空白樣品，按樣品溶液的制備方法進行處理，直至氮吹至近干時，精密加入系列混合對照品溶液1 mL，渦旋混勻，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，配制成系列基質(zhì)混合對照品溶液.以各組分定量子離子峰面積為垂直坐標(biāo)(Y)，相應(yīng)濃度為水平坐標(biāo)(X)，繪制建立線性方程.結(jié)果:10 種真菌毒素在各自的線性范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.998.檢出限和定量限由每種組分定性子離子3 倍和10 倍信噪比確定，結(jié)果見表3.

2.6 精密度與回收率

取空白樣品，分別添加一定量的混合對照品溶液，按2.3 項方法制備3 個濃度水平加標(biāo)樣試液，每個水平平行6 次試驗，進樣測定，計算回收率及RSD.結(jié)果:10 種真菌毒素的回收率范圍為82.5%～109.2%，RSD 范圍為1.1%～5.8%，見表4.

表4 10 種真菌毒素精密度與回收率(n＝6)Table 4 The precisions and recoveries of 10 mycotoxins(n＝6)

2.7 樣品的測定

分別取10 批樣品，以建立的方法測定10 種真菌毒素的含量，測定結(jié)果見表5.

3 討論

3.1 前處理的優(yōu)化

3.1.1 提取條件的優(yōu)化

比較甲醇和乙腈作為提取溶劑，發(fā)現(xiàn)乙腈的提取效率更高，選擇性更好，可避免提取色素及脂肪等雜質(zhì)，故選擇乙腈作為提取溶劑；進一步比較加入不同乙酸的濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙酸濃度為1%時，各真菌毒素的回收率均大于80%.

3.1.2 凈化方式的優(yōu)化

比較GCB、PSA 和C18粉末作為凈化材料，發(fā)現(xiàn)，GCB 吸附能力較強，能去除較多的色素干擾，但對AFB1和ZEN 的回收率影響較大，而PSA 能去除脂肪酸等雜質(zhì)，但用量過大時，會影響FB1、FB2的回收率，C18不足或過量時，也會影響OTA 的回收率.最終采用300 mg PSA、100 mg C18和500 mg 無水MgSO4作為凈化材料時，各真菌毒素的回收率均大于80%.

3.2 儀器條件的優(yōu)化

3.2.1 色譜條件的優(yōu)化

比較了甲醇和乙腈作為有機相，發(fā)現(xiàn)乙腈系統(tǒng)各組分出峰時間適宜，分離度良好，響應(yīng)值較高，故選擇乙腈作為有機相.比較水相中加入甲酸、乙酸、甲酸銨和乙酸銨四種改進劑，發(fā)現(xiàn)乙酸和乙酸銨的效果不如甲酸和甲酸銨.而加入甲酸銨時，會抑制正離子組分的電離，致使靈敏度下降.加入甲酸時，正負(fù)離子組分響應(yīng)值均較高，能達(dá)到預(yù)期效果，故優(yōu)化后最終采用0.1%甲酸作為水相.

3.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取10 種真菌毒素單標(biāo)溶液進行一級質(zhì)譜全掃描，發(fā)現(xiàn)AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、FB1、FB2、T-2 和DON 在正離子模式下響應(yīng)值較高，而OTA 和ZEN 在負(fù)離子模式下響應(yīng)值較高，故采用正負(fù)離子同時電離的模式.二級質(zhì)譜采集時，選擇響應(yīng)值高且穩(wěn)定的子離子組建MRM 離子對，進一步優(yōu)化DP 及CE 值，使各組分響應(yīng)值最高.

3.3 樣品污染狀況分析

通過對10 批樣品進行測定，結(jié)果有7 批檢出真菌毒素，檢出率為70%，檢出率較高.在檢測的10 種真菌毒素中，有6 種真菌毒素被檢出，污染值分別為AFB1(0.8～3.9 μg/kg)、AFG1(0.9 μg/kg)、OTA(2.0～7.5 μg/kg)、ZEN(11.6～58.7 μg/kg)、FB1(28.6～43.0 μg/kg)、DON(79.4～139.3 μg/kg).目前，只有少數(shù)品種的藥材對真菌毒素進行限量規(guī)定，而馬蹄金并未有限量規(guī)定，參考《中國藥典》2020年版中限量規(guī)定，本次樣品測定結(jié)果均未超標(biāo).多種真菌毒素在混合污染的情況下，對人體的毒性會產(chǎn)生累積效應(yīng)，本次樣品所受污染的真菌毒素種類較多，且部分真菌毒素并未制定限量標(biāo)準(zhǔn)，故存在一定的安全風(fēng)險.提示藥材生產(chǎn)基地及相關(guān)監(jiān)管部門應(yīng)加強真菌毒素的監(jiān)控工作，起草并建立安全合理的儲藏規(guī)范并進行真菌毒素污染的風(fēng)險評估，才能更好地保證其質(zhì)量及安全性.

4 結(jié)論

本研究建立了基于QuEChERS 方法的前處理技術(shù)，并結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用法對馬蹄金中10種真菌毒素進行測定，該方法操作簡便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，適用于馬蹄金中10種真菌毒素的快速測定.研究結(jié)果顯示，馬蹄金受一定程度的真菌毒素的污染，存在安全風(fēng)險，應(yīng)加強其在種植及儲存環(huán)節(jié)的監(jiān)控.