抑制酸奶后酸化產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選及其產(chǎn)細(xì)菌素條件優(yōu)化

黃 倩，萬 倩，劉 爽，李啟明，朱成林，蔡自建，陳 娟，鄒立扣，朱鵬程，唐俊妮

(1.西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041；2.乳品營養(yǎng)與功能四川省重點實驗室，新希望乳業(yè)股份有限公司，四川 成都 610000；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，四川 成都 611830；4.四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，四川 成都 610021)

酸奶是指以原料乳為發(fā)酵底物，并以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌為主要菌種發(fā)酵而成的乳制品，因其具有營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特等優(yōu)點而廣受消費者的喜愛[1].然而，酸奶產(chǎn)品在儲存、運輸及銷售環(huán)節(jié)中并不能保證完全的冷鏈條件，即容易出現(xiàn)脫冷現(xiàn)象，進(jìn)而使得乳酸菌繼續(xù)發(fā)酵殘存乳糖產(chǎn)生乳酸，此過程稱為酸奶的后酸化.后酸化不僅會造成酸奶感官質(zhì)量嚴(yán)重降低，縮短酸奶的保質(zhì)期，同時也會影響益生菌的存活，使其失去保健益生的作用[2].過去，大量研究表明[3-6]酸奶后酸化的主要原因是保加利亞乳桿菌在后期繼續(xù)發(fā)酵代謝乳糖產(chǎn)生乳酸所造成.酸奶發(fā)酵結(jié)束后，保加利亞乳桿菌利用自身質(zhì)膜H＋-ATPase 形成跨膜pH 梯度差，維持胞內(nèi)中性環(huán)境，使β-半乳糖苷酶保持原有活性，代謝乳糖繼續(xù)產(chǎn)酸[4].目前，解決酸奶后酸化問題的方法主要包括以下三個方面:一是采用物理方法控制溫度，保持運輸過程中的冷鏈完整、控制溫度波動；二是采用化學(xué)方法，按照國標(biāo)添加適量化學(xué)防腐劑；三是通過誘變育種和基因工程篩選弱后酸化突變菌株.但上述三種辦法存在著大量能源消耗、存在健康隱患、消費者認(rèn)可度低等問題[7].如何通過綠色安全有效以及低成本的方式控制酸奶在儲運、銷售環(huán)節(jié)中的后酸化已經(jīng)成為目前奶制品行業(yè)學(xué)者研究的熱點.

細(xì)菌素是一種由細(xì)菌在生長代謝過程中通過核糖體合成而產(chǎn)生的抗菌肽，抑菌范圍的寬窄存在菌株特異性，并且多數(shù)細(xì)菌素是由乳酸菌這一種屬所產(chǎn)生的[8].長期以來，乳酸菌以其公認(rèn)的安全(Generally recognized as safe，GRAS)微生物的地位在世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵[9]，因此，乳酸菌細(xì)菌素被認(rèn)為是一種綠色、安全以及高效的天然抑菌物質(zhì)，并且由乳酸乳球菌乳酸亞種所產(chǎn)生乳酸鏈球菌素(Nisin)是目前唯一通過FDA/WHO 認(rèn)證的細(xì)菌素.不少學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)將這類天然抑菌物質(zhì)添加于食品中可以使其免受致病菌的污染[10-12]，還能改善酸奶的品質(zhì).尚楠[13]等人發(fā)現(xiàn)產(chǎn)細(xì)菌素的雙歧桿菌L-SN 在添加水平為(2×106～5×106)cfu/mL 時可以有效抑制酸奶后酸化；楊慧等[14]人發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌Q7 對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的生長有一定的抑制作用，不僅可以縮短酸奶發(fā)酵時間，還能延緩酸奶后酸化；細(xì)菌素bifidocin A 不僅能在28 d 貯藏期內(nèi)維持酸度小于110 °T，還能顯著提高酸奶的持水力和揮發(fā)性物質(zhì)成分[15].將其應(yīng)用于酸奶時還能達(dá)到緩解酸奶后酸化的效果[14].綜上可見，細(xì)菌素的引入不僅能很好地解決酸奶后酸化問題，還能縮短發(fā)酵時間，提高酸奶的持水力、改善其品質(zhì).

因此，本研究擬從實驗室前期分離鑒定的16 株乳酸菌中，篩選出可以對酸奶后酸化起到抑制作用的菌株，同時對其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化以提高細(xì)菌素的產(chǎn)量.以期開發(fā)出一種能夠緩解酸奶后酸化，延長產(chǎn)品貨架期的天然防腐劑，同時為其大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源

試驗所用16 株乳酸菌、1 株嗜熱鏈球菌(Q019)由新希望乳業(yè)股份有限公司乳品營養(yǎng)與功能四川省重點實驗室所提供，從后酸化較為嚴(yán)重酸奶產(chǎn)品中分離鑒定的保加利亞乳桿菌(A0)作為指示菌.

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

胃蛋白酶，購自德國Biofroxx 公司；胰蛋白酶，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；碳酸鈣、蔗糖、硫酸銨，購自成都金山化學(xué)試劑有限公司；乳糖酶，購自帝斯曼(中國)有限公司；乳酸鏈球菌素(NISAPLIN)、Sephadex G-50 葡聚糖凝膠，購自丹尼斯克(中國)有限公司；MRS 肉湯，購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；濃縮乳清蛋白粉(E300)，購自戴緯林國際貿(mào)易(上海)有限公司；大豆蛋白胨，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；脫脂乳粉，購自伊利(內(nèi)蒙古)有限公司.

1.1.3 儀器與設(shè)備

INC821C 兩槽式恒溫培養(yǎng)箱，購自雅馬拓科技貿(mào)易(上海)有限公司；MLS-3020 電熱自動滅菌鍋，購自日本SANYO 公司；TGL-1650 高速冷凍離心機，四川蜀科儀器有限公司；PTC-200PCR 儀，購自美國Bio-Rad 公司；Bioscreen 全自動生長曲線分析儀，購自芬蘭Oy Growth Curves Ab Ltd 公司；FiveEasy PlusTM pH計，購自北京銘成基業(yè)科技有限公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 發(fā)酵上清液的制備

將(16 株乳酸菌)甘油菌按2% 接種量接種于MRS 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，將發(fā)酵菌液離心(10 000 rpm，10 min，4 ℃)獲上清液，再用0.22 μm水系濾器除菌得無菌上清液.

1.2.2 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的篩選

1.2.2.1 微孔板初篩

參考張明[16]等方法略作修改，以本試驗從發(fā)酵劑中分離鑒定的保加利亞乳桿菌(A0)為指示菌，將其接入MRS 肉湯培養(yǎng)基中活化兩代后，按3%接種量接入MRS 肉湯培養(yǎng)基中制成待用指示菌懸液(106CFU/mL).取250 μL 無菌發(fā)酵上清液與2.25 mL 指示菌菌懸液充分混合均勻后，加樣于100 孔板中，用全自動生長曲線分析儀測定不同樣品0～24 h 的OD600nm，每隔1 h 測定一次，同時作陰性對照與陽性對照.

1.2.2.2 瓊脂擴(kuò)散牛津杯法復(fù)篩

選取明顯抑制保加利亞乳桿菌生長的乳酸乳球菌進(jìn)一步復(fù)篩.采用瓊脂擴(kuò)散法[17]，吸取指示菌菌懸液(108CFU/mL)100 μL 于提前倒好的MRS 固體平板上，用涂布棒均勻涂布后，放入無菌牛津杯，往牛津杯中加入200 μL 發(fā)酵上清液，同時作陰性對照與陽性對照.

1.2.3 乳酸乳球菌發(fā)酵上清液抑菌特性

1.2.3.1 酸排除試驗

參照Fan 等[18]方法來排除有機酸干擾，取經(jīng)過初篩、復(fù)篩后仍有抑菌效果的菌株發(fā)酵上清液，用1M NaOH 溶液將其pH 值調(diào)至6.0 后，按1.2.2.2 步驟做抑菌試驗，以未調(diào)pH 的無菌發(fā)酵上清液作為陽性對照，以MRS 肉湯培養(yǎng)基作陰性對照.

1.2.3.2 過氧化氫排除試驗

采用劉書亮等[19]的方法來排除過氧化氫干擾，取經(jīng)過酸排除試驗的菌株發(fā)酵上清液，于80 ℃中水浴10 min，按1.2.2.2 步驟做抑菌試驗，以未調(diào)pH 的無菌發(fā)酵上清液作為陽性對照，以MRS 肉湯培養(yǎng)基作陰性對照.

1.2.3.3 蛋白酶敏感試驗

按照Amrita 等[20]的方法進(jìn)行蛋白酶酶解試驗，將排除酸、過氧化氫后仍有抑菌效果的發(fā)酵上清液分別加入總濃度為1 000 IU/mL 的胃蛋白酶和胰蛋白酶，并將pH 分別調(diào)至2.0 和8.1，充分混合均勻于37 ℃處理1 h 后，將pH 調(diào)至6.0，按1.2.2.2 步驟做抑菌試驗，以未調(diào)pH 的無菌發(fā)酵上清液為陽性對照，以MRS 肉湯培養(yǎng)基作陰性對照.

1.2.3.4 熱穩(wěn)定性

將乳酸乳球菌Q13 發(fā)酵上清液分別按40、50、60、70、80、90、100 ℃處理30 min，冷卻至室溫，同時以未經(jīng)處理Q13 上清液和經(jīng)過相同處理的無菌培養(yǎng)液作對照[21]，按照步驟1.2.2.2 對指示菌進(jìn)行抑菌試驗.

1.2.3.5 酸堿穩(wěn)定性

用1 M HCl 或NaOH 溶液將乳酸乳球菌Q13 上清液pH 分別調(diào)節(jié)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，于4 ℃作用12 h后，將所有組樣品pH 調(diào)至6.0.以未經(jīng)處理Q13 發(fā)酵上清液和經(jīng)過相同處理的無菌培養(yǎng)液為對照，按照步驟1.2.2.2 對指示菌進(jìn)行抑菌試驗.

1.2.4 乳酸乳球菌Q13 產(chǎn)細(xì)菌素培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.2.4.1 抑菌活性測定方法

取乳酸乳球菌Q13 發(fā)酵液，4 ℃，10 000 rpm 離心15 min，將上清液使用0.22 μm 濾器過濾得到無菌發(fā)酵上清液，利用微量稀釋法對其進(jìn)行稀釋[22].將活化兩代后的指示菌保加利亞乳桿菌按3%接種量接入MRS 肉湯培養(yǎng)基(106CFU/mL).取250 μL 無菌上清液與2.25 mL 指示菌菌懸液充分混勻后加樣于100孔板中，利用生長曲線分析儀培養(yǎng)6 h后測定OD600nm.根據(jù)Turcotte 等[23]的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)效價曲線，以保加利亞乳桿菌為指示菌，以乳酸鏈球菌素為陽性對照.將上述獲得的OD600nm代入效價回歸方程，計算出無菌上清液中細(xì)菌素的效價，本試驗測得回歸方程為:

y＝ 4.5323x－2.7247，y 表示相對抑菌效價(AU/mL)；x 表示OD600nm的負(fù)對數(shù)，R2＝0.9902.

1.2.4.2 單因素試驗

稱取79 g 乳清蛋白粉，21 g 大豆蛋白胨，加熱溶解于1 000 mL 去離子水中，105 ℃高壓滅菌10 min制得發(fā)酵培養(yǎng)基.選取接種量、發(fā)酵溫度、初始pH 和培養(yǎng)時間作為影響抑菌活性的主要因素進(jìn)行單因素試驗.

①不同接種量對抑菌活性的影響

以1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%和8%的接種量將乳酸乳球菌Q13 接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后，測定無菌上清液的抑菌效價.

②不同發(fā)酵溫度對抑菌活性的影響

將Q13 以3%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在20、25、30、35、37 和42 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)結(jié)束后，測定無菌上清液的抑菌活性.

③不同發(fā)酵初始pH 對抑菌活性的影響

將發(fā)酵培養(yǎng)基用1 M NaOH 或鹽酸溶液將初始pH 值調(diào)至5、6、7、8、9.以3%接種量接入乳酸乳球菌Q13，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，測定無菌上清液的抑菌活性.

④不同培養(yǎng)時間對抑菌活性的影響

以3%接種量在發(fā)酵培養(yǎng)基中接入乳酸乳球菌Q13，置于37 ℃分別培養(yǎng)8、12、16、20、24、28、36 和48 h，培養(yǎng)結(jié)束后，測定各時間點無菌上清液的抑菌效價.

1.2.4.3 響應(yīng)面優(yōu)化乳酸乳球菌代謝產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取接種量(A)、初始pH值(B)、培養(yǎng)溫度(C)3 個主要因素，每個因素設(shè)置3個水平，響應(yīng)面因素及水平設(shè)計見表1，用Design Expert 12 中的Box-Behnken 法進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計與分析，以抑菌效價為響應(yīng)值，利用多元回歸擬合試驗數(shù)據(jù)，分析影響菌株抑菌活性的主效應(yīng)和交互效應(yīng)，確定乳酸乳球菌Q13 最佳產(chǎn)細(xì)菌素條件.以最優(yōu)條件進(jìn)行試驗驗證模型是否有效.

表1 響應(yīng)面試驗因素及水平設(shè)計Table 1 Factors and levelsin for Box-Behnken design

1.2.5 乳酸乳球菌Q13 所產(chǎn)細(xì)菌素的提取

參照萬倩等[24]的方法對乳酸乳球菌Q13 所產(chǎn)的細(xì)菌素進(jìn)行分離抽提，并冷凍干燥制成干粉備用.

1.2.6 乳酸乳球菌Q13 所產(chǎn)細(xì)菌素對發(fā)酵酸奶酸度和pH 的影響

1.2.6.1 發(fā)酵菌株制備

發(fā)酵菌株制備:將保加利亞乳桿菌(A0)、嗜熱鏈球菌(Q019)接入MRS 肉湯培養(yǎng)基中活化兩代后，分別按10%的接種量接入滅菌脫脂乳中，于42 ℃靜置發(fā)酵直至凝乳，并調(diào)節(jié)菌液濃度為5×106CFU/mL.

1.2.6.2 酸奶基料樣品制備

去離子水加熱至60 ℃→在水中添加12%的脫脂乳粉和7%的蔗糖，水合30 min→均質(zhì)2 次(60 ℃，20 MPa)→巴氏殺菌(95 ℃，5 min)→冷卻至37 ℃～42 ℃后接入10%(v/v)的發(fā)酵菌種(A0∶Q019 為1∶1)→于42 ℃發(fā)酵至滴定酸度為70°T→破乳(于冰水浴中每隔10 min 攪拌1 次至溫度降低為4 ℃左右)→后熟(2 ℃～6 ℃冰箱中過夜).

含乳酸乳球菌Q13 所產(chǎn)細(xì)菌素酸奶樣品制備:在酸奶基料樣品中添加1.2.5 中純化后的細(xì)菌素，使其濃度為8 mg/mL(W1)、17 mg/mL(W2)、33 mg/mL(W3)、50 mg/mL(W4)，同時以未添加細(xì)菌素的酸奶基料為空白對照(W0)，將各組樣品分裝至50 mL 滅菌的離心管中以便后續(xù)試驗取樣.

1.2.6.3 酸度和pH 值的測定

參照GB5009.239-2016 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測定中的電位滴定法來測定酸度[25]；利用Five Easy Plus TM pH 計檢測酸奶樣品pH 值.

1.2.7 數(shù)據(jù)分析與處理

數(shù)據(jù)錄入、整理和分析釆用Excel 2022，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 26.0，使用Origin 2022 軟件繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)細(xì)菌素乳酸乳球菌的篩選

從16 株乳酸菌中初步篩選出對保加利亞乳桿菌生長有抑制作用的菌株13 株(見圖1)，其中以Q13 無菌上清液和乳酸鏈球菌素對指示菌的生長起到完全抑制的作用.對13 株菌發(fā)酵上清液利用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)一步復(fù)篩，結(jié)果顯示僅有Q13 上清液和乳酸鏈球菌素在含保加利亞乳桿菌固體平板上產(chǎn)生較大抑菌圈(見圖2)，最后選擇乳酸乳球菌Q13 進(jìn)行后續(xù)試驗研究.

圖1 不同處理條件下保加利亞乳桿菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of Lactobacillus bulgaricus under different treatment conditions

圖2 瓊脂擴(kuò)散法篩選結(jié)果Fig.2 Screening results of agar diffusion method

2.2 乳酸乳球菌Q13 發(fā)酵上清液生物學(xué)特性

2.2.1 酸和過氧化氫的排除及蛋白酶敏感性

如圖3所示，用NaOH 溶液將乳酸菌Q13 發(fā)酵上清液pH 調(diào)節(jié)為6，排出乳酸等有機酸對抑菌效果的干擾.研究結(jié)果顯示，酸中和處理過的乳酸菌Q13 發(fā)酵上清液抑菌圈直徑仍能達(dá)到14.25 mm，陽性對照(未經(jīng)任何處理)的抑菌直徑為14.50 mm，二者間無顯著性差異(P＞0.05)，這說明發(fā)酵液中除了有機酸還存在著其他抑菌物質(zhì).排除有機酸的干擾后，利用過氧化氫的熱不穩(wěn)定性對Q13 發(fā)酵上清液進(jìn)行過氧化氫排除試驗.研究結(jié)果顯示，與陽性對照相比，80 ℃處理過的發(fā)酵上清液抑菌圈直徑為14.50 mm，與陽性對照組無顯著性差異(P＞0.05).乳酸菌Q13發(fā)酵上清液對保加利亞乳桿菌有一定的抑菌作用，但與其所產(chǎn)的有機酸無顯著相關(guān)性，該乳酸菌所產(chǎn)的過氧化氫對保加利亞乳桿菌的抑制作用可以忽略不計，該菌株的上清液中存在著其他有機抑菌化合物.

圖3 發(fā)酵上清液在不同處理條件下的抑菌活性Fig.3 Antibacterial activity of fermentation supernatant under different treatment conditions

使用胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解Q13 發(fā)酵上清液，發(fā)現(xiàn)胃蛋白酶對上清液的抑菌效果沒有顯著降低(P＞0.05)，而經(jīng)過胰蛋白酶處理的上清液并沒有檢測到抑菌活性，說明Q13 產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)是一種肽或蛋白質(zhì)，即可能是細(xì)菌素或類似物，該抑菌物質(zhì)對胃蛋白酶不敏感，但遇到胰蛋白酶時抑菌活性消失.

2.2.2 熱穩(wěn)定性

菌株Q13 發(fā)酵上清液經(jīng)過不同溫度處理后的抑菌活性和陽性對照相比并無明顯區(qū)別(圖4)，即使在100 ℃高溫條件下處理30 min 后仍具有較好抑菌效果，溫度對乳酸乳球菌Q13 上清液的抑菌活性影響并不顯著(P＞0.05).這可能主要與兩種因素有關(guān)，其一是該菌株產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)本身具有良好的熱穩(wěn)定性；其二是與發(fā)酵上清液低pH 值(4.5)有關(guān)，而在酸性條件下乳酸鏈球菌素(Nisin)對溫度較為穩(wěn)定[26].

圖4 不同溫度條件處理對Q13 抑菌活性影響Fig.4 The influence of different temperature conditions on the antibacterial activity of Q13

2.2.3 酸堿穩(wěn)定性

乳酸乳球菌Q13 發(fā)酵上清液經(jīng)過不同pH 條件下處理后，再將pH 值調(diào)至6.0，利用瓊脂擴(kuò)散法檢測各處理組的抑菌圈直徑，如圖5所示，在pH 3.0～10.0 范圍內(nèi)處理后上清液抑菌效果并未受到影響.pH為7 時，抑菌活性最強，抑菌圈直徑可達(dá)20.87 mm，與pH 為3 的抑菌圈直徑18.38 mm 相比抑菌能力提升了13.55%，有顯著性差異(P＜0.05).該發(fā)酵液在中性偏堿(pH 5～11)的環(huán)境中能夠保持較好的抑菌活性，在偏酸的環(huán)境中的抑菌活性會有所下降，但總體而言該菌株所產(chǎn)生的抗菌肽具有較好的酸堿穩(wěn)定性，該結(jié)果與Yu 等[27]所研究的新型細(xì)菌素Pediocin Z-1抑菌特性相似.

圖5 不同pH 條件處理對Q13 抑菌活性影響Fig.5 The influence of different pH conditions on the antibacterial activity of Q13

2.3 乳酸乳球菌Q13 產(chǎn)細(xì)菌素單因素試驗

2.3.1 接種量對乳酸乳球菌Q13 產(chǎn)細(xì)菌素影響

接種量的大小決定乳酸乳球菌的生長周期，較大的接種量可以使菌體快速進(jìn)入穩(wěn)定期，縮短生產(chǎn)時間，迅速積累大量代謝物.但較大的接種量同樣也會造成培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)被迅速消耗、限制菌體后期生長等問題.此外，還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌素的結(jié)構(gòu)本身就是一種信息素，可高水平誘導(dǎo)其自身產(chǎn)生[28]，不同接種量即往下一代培養(yǎng)液中添加不同濃度的自誘導(dǎo)劑(細(xì)菌素)以誘導(dǎo)細(xì)菌素的產(chǎn)生.本研究中接種量對Q13 細(xì)菌素效價影響如圖6所示，隨著接種量的增加，發(fā)酵液的相對抑菌效價呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當(dāng)接種量為2%時發(fā)酵液中相對抑菌效價達(dá)到最大值(213.33 AU/mL)，隨后開始緩慢下降；當(dāng)接種量增加至6%時，相對抑菌效價最低，為147.05 AU/mL，抑菌能力下降了45.07%，相對抑菌效價下降顯著(P＜0.05).因此選擇接種量為2%進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗設(shè)計.

圖6 接種量對乳酸乳球菌Q13 產(chǎn)細(xì)菌素影響Fig.6 Effects of inoculation amount on bacteriocin production by Lactococcuslactis Q13

2.3.2 發(fā)酵溫度對乳酸乳球菌Q13 產(chǎn)細(xì)菌素的影響

細(xì)菌素屬于蛋白質(zhì)類似物，培養(yǎng)溫度對于微生物的生長和細(xì)菌素的合成來說是至關(guān)重要的.培養(yǎng)溫度過低，乳酸菌會生長緩慢甚至停止生長；培養(yǎng)溫度過高，細(xì)菌素易變性失活.如圖7所示，溫度為25 ℃時，發(fā)酵液抑菌活性達(dá)到最大值(519.97 AU/mL)，這與匡珍[29]等的研究結(jié)果相類似，并且隨著溫度升高(25 ℃～42 ℃)，細(xì)菌素效價和菌落數(shù)量均呈現(xiàn)逐漸下降趨勢.溫度上升至30 ℃和35 ℃時，相對抑菌效價分別為443.62 AU/mL 和286.61 AU/mL，在此溫度范圍內(nèi)還能保持較高的抑菌活性；溫度進(jìn)一步上升至37 ℃時，相對抑菌效價只有83.82 AU/mL，與25 ℃相比，相對抑菌效價下降了429.25%，有顯著性差異(P＜0.05)；當(dāng)溫度到達(dá)42 ℃時，細(xì)菌素相對效價為1.11 AU/mL，此時基本喪失抑菌活性.乳酸乳球菌Q13 在25 ℃時相對抑菌活性最高，因此選擇溫度為25 ℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗.

2.3.3 培養(yǎng)基初始pH 對乳酸乳球菌Q13 產(chǎn)細(xì)菌素的影響

作為一種產(chǎn)酸菌株，乳酸乳球菌在不同pH 條件下的生長情況不相同，因此培養(yǎng)液的初始pH 對于菌株細(xì)菌素的合成影響較大.如圖8所示，當(dāng)初始pH 在5～8 時，抑菌活性呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，pH 為8 時，乳酸乳球菌Q13 的相對抑菌效價最高，為533.23 AU/mL；而pH 超過8.0 時，細(xì)菌素合成受到抑制，當(dāng)pH 為9時，相對抑菌效價降至334.81 AU/mL，與pH 為8 相比，相對抑菌效價下降了59.26%，有顯著性差異(P＜0.05).本試驗選擇pH 8.0 進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗設(shè)計.

2.3.4 培養(yǎng)時間對乳酸乳球菌Q13 產(chǎn)細(xì)菌素的影響

先前文獻(xiàn)[29]報道細(xì)菌素合成與細(xì)菌所處生長階段存在一定聯(lián)系，有的菌株在生長遲緩期就開始產(chǎn)生細(xì)菌素，而有的菌株則在對數(shù)生長期和穩(wěn)定期才會大量產(chǎn)生和積累細(xì)菌素.如圖9所示，在8～20 h 內(nèi)細(xì)菌素效價并沒有明顯差異(P＞0.05)，發(fā)酵時間為20 h時，發(fā)酵液的相對抑菌效價可達(dá)491.59 AU/mL；當(dāng)時間超過20 h 時(24～48 h)，抑菌活性出現(xiàn)下降趨勢，這可能是因為前期產(chǎn)生的細(xì)菌素被吸附至產(chǎn)生菌株細(xì)胞表面，發(fā)酵液中細(xì)菌素含量減少，相對抑菌效價下降[30].考慮到工業(yè)化操作的方便性，因此后期不以發(fā)酵時間作為響應(yīng)面優(yōu)化的影響因素.

圖9 培養(yǎng)時間對乳酸乳球菌Q13 產(chǎn)細(xì)菌素影響Fig.9 Effects of culture time on bacteriocin production by Lactococcuslactis Q13

2.4 響應(yīng)面試驗優(yōu)化乳酸乳球菌Q13 產(chǎn)細(xì)菌素條件

響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表2.利用Design Expert 12.1 軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得相對抑菌效價(Y)與自變量A(接種量)、B(初始pH)和C(培養(yǎng)溫度)的二次多項式回歸模型方程(見表4):

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及試驗結(jié)果Table 2 Design and results of response surface tests

Y＝540.83－26.65A ＋82.02B-171.23C－24.7AB-26.83AC－14.23BC－32.19A2-49.93B2－170.66C2.

回歸模型方差分析結(jié)果見表3，模型是顯著的(P＜0.05)，失擬項不顯著(P＝0.153 4)，回歸模型的決定系數(shù)R2＝0.965 3，說明該模型能夠解釋96.53%的變化，僅有3.47%不能用該模型來解釋，自變量與因變量線性關(guān)系顯著，該模型擬合程度良好.因此可用此模型對乳酸乳球菌產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵條件進(jìn)行分析和預(yù)測.

表3 回歸模型的方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance results of the regression model

回歸模型顯著性分析見表4，模型一次項C 極顯著，B 顯著，A 不顯著；二次項C2顯著，A2、B2不顯著；交互項均不顯著.通過回歸模型系數(shù)絕對值大小分析各個因素的改變對乳酸乳球菌Q13 代謝產(chǎn)細(xì)菌素的影響程度.回歸方程一次項的回歸系數(shù)絕對值依次為C、B、A，結(jié)果表明:3 個因素對菌株Q13 代謝產(chǎn)細(xì)菌素的影響大小依次是發(fā)酵溫度、初始pH、接種量.

表4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗表Table 4 Significance test for regression coefficients

利用響應(yīng)面軟件對表2 試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，所得到二次回歸方程的響應(yīng)面分別見圖10～12.圖10～12 表示了影響乳酸乳球菌Q13 產(chǎn)細(xì)菌素的接種量、初始pH 和培養(yǎng)溫度3 個因素兩兩交互作用，由圖可知，對細(xì)菌素合成影響最為顯著的是培養(yǎng)溫度，培養(yǎng)液初始pH 對細(xì)菌素產(chǎn)量有一定影響，而接種量在1%～3%范圍內(nèi)對細(xì)菌素合成沒有顯著影響.Design Expert12.0 根據(jù)試驗結(jié)果給出了最優(yōu)培養(yǎng)條件:接種量為1.4%，初始pH 為8.0，培養(yǎng)溫度為27.5 ℃.為進(jìn)一步驗證模型的可靠性，對給出優(yōu)化條件進(jìn)行兩次重復(fù)性驗證試驗，得到實際抑菌效價平均值為618.51 AU/mL，與預(yù)測值(634.16 AU/mL)的相對誤差為2.5%，即擬合程度良好，該模型可靠.同時優(yōu)化后細(xì)菌素抑菌效價(618.51 AU/mL)比優(yōu)化前(200 AU/mL)提高了3 倍左右，說明本試驗所設(shè)計試驗方案合理，得到試驗條件能夠明顯提高細(xì)菌素產(chǎn)量.但是本研究對細(xì)菌素產(chǎn)量進(jìn)行優(yōu)化提高時只考慮了發(fā)酵條件，未把培養(yǎng)基成分作為考慮對象，在一定程度上未達(dá)到最優(yōu)效果，后續(xù)試驗中還應(yīng)進(jìn)一步加強發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化工作，為實際應(yīng)用提供更可靠的科學(xué)依據(jù).

圖10 接種量和初始pH 值對乳酸乳球菌Q13所產(chǎn)細(xì)菌素抑菌效果影響的響應(yīng)面Fig.10 Response surface of the influence of inoculation amount and initial pH value on the antibacterial effect ofbacteriocin produced by Lactococcuslactis Q13

圖12 初始pH 和培養(yǎng)溫度對乳酸乳球菌Q13所產(chǎn)細(xì)菌素抑菌效果影響的響應(yīng)面Fig.12 Response surface of the influence of initial pH and culture temperature on the antibacterial effect of bacteriocin produced by Lactococcuslactis Q13

2.5 乳酸乳球菌Q13 所產(chǎn)細(xì)菌素對酸奶后酸化的影響

2.5.1 乳酸乳球菌Q13 所產(chǎn)細(xì)菌素對貯藏期酸奶樣品酸度影響

本試驗為驗證乳酸乳球菌Q13 所產(chǎn)細(xì)菌素是否具有防止酸奶酸度增加以及延緩酸奶后酸化的應(yīng)用潛力，在酸奶中添加不同濃度純化后的細(xì)菌素，將所有樣品置于15 ℃條件下儲存21 d，每隔3 d 取樣，檢測樣品酸度增加情況.如圖13所示.隨著貯藏時間的延長，5 組樣品的可滴定酸度都呈現(xiàn)上升趨勢，且在第12 d 酸度到達(dá)峰值，隨后緩慢下降并趨于穩(wěn)定.隨著乳酸乳球菌Q13 所產(chǎn)細(xì)菌素添加量的增加，酸度增加值逐漸下降.當(dāng)添加量為50 mg/mL(W4)時，第12 d時可滴定酸度僅增加6.2 °T，而未添加細(xì)菌素的空白組(W0)，在第12 d 可滴定酸度增加了16.4 °T，與W4 相比增長率為164.52%，差異顯著(P＜0.05).結(jié)果顯示，Q13 所產(chǎn)細(xì)菌素的加入可以抑制酸奶后酸化、延緩酸奶酸度的增加，且隨著添加劑量的增加，抑制效果逐漸增強.

圖13 貯藏期間樣品酸度的變化Fig.13 Changes in acidity of samples during storage

2.5.2 乳酸乳球菌Q13 所產(chǎn)細(xì)菌素對貯藏期酸奶樣品pH 的影響

5 組發(fā)酵酸奶在21 d 貯藏期內(nèi)的pH 變化如圖14所示.在貯藏的前6 d，pH 下降明顯，且在之后的貯藏期內(nèi)趨于穩(wěn)定.當(dāng)乳酸乳球菌Q13 所產(chǎn)細(xì)菌素的添加量為50 mg/mL(W4)時，pH 在21 d 達(dá)到最低值，從最初的4.38 下降為4.30，下降率僅為1.83%，無顯著差異(P＞0.05)；而未添加Q13 所產(chǎn)細(xì)菌素的發(fā)酵酸奶(W0)在21 d 貯藏期內(nèi)pH 由最初的4.28 降至4.02，下降率為6.07%.相關(guān)研究表明，商業(yè)酸奶的pH 應(yīng)該控制在4.20 至4.50 之間，這樣才能保證酸奶在貯藏過程中不會出現(xiàn)刺激性酸味[31].本研究中添加了Q13 所產(chǎn)細(xì)菌素的酸奶，pH 下降緩慢，在一定程度上緩解了酸奶的后酸化.

圖14 貯藏期內(nèi)樣品pH 值變化Fig.14 Changes in pH value of samples during storage

3 結(jié)論

本研究以實驗室前期從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中所分離鑒定的16 株乳酸菌作為研究對象，并將其作用于酸奶產(chǎn)品中的保加利亞乳桿菌，篩選出一株具有明顯抑菌效果的乳酸乳球菌Q13.經(jīng)過排酸及排除過氧化氫實驗、胃蛋白酶處理、以及耐熱和耐酸堿實驗，確定該抑菌成分為一種蛋白類物質(zhì).通過單因素實驗和響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳發(fā)酵條件，且在該條件下模型預(yù)測值和真實值基本吻合.將乳酸乳球菌Q13 所產(chǎn)的細(xì)菌素添加于發(fā)酵酸奶中，能顯著影響酸奶貯藏期的酸度變化.乳酸菌所產(chǎn)的細(xì)菌素應(yīng)用價值較高，可作生物防腐劑、抗生素替代品，本研究分離的細(xì)菌素有望被開發(fā)為一種新型天然綠色安全抑菌劑，應(yīng)用于發(fā)酵乳制品行業(yè)，打破酸奶后酸化技術(shù)瓶頸，改善發(fā)酵乳品質(zhì).