藏藥甘青鐵線蓮黃酮誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及對腫瘤免疫抑制因子影響的實驗研究

楊彥文，張熙苓，王寶山，羅寶軍，陳朝喜，劉 群

(西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041)

1972年，細(xì)胞凋亡(Apoptosis)的概念首次由Kerr等人提出，細(xì)胞凋亡是一種在多重因素參與下的正常的、自動性程序死亡[1].誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡在腫瘤疾病治療和藥物篩選等方面?zhèn)涫荜P(guān)注[2-3].近年來，中藥誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡研究已由凋亡現(xiàn)象觀察深入到基因、分子水平的研究，如中藥提取物姜黃素、槲皮素、苦參堿、重樓皂苷、五味子多糖、丹皮酚等.這些中藥成分誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用途徑大致分為兩種:一是干擾腫瘤細(xì)胞凋亡信號通路上一些關(guān)鍵酶活性，從而干擾腫瘤細(xì)胞生長、代謝、增殖并觸發(fā)和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[4]；二是影響腫瘤細(xì)胞分泌免疫抑制因子，從而在腫瘤細(xì)胞附近形成免疫抑制環(huán)境可協(xié)助腫瘤細(xì)胞實現(xiàn)免疫逃逸[5].藏藥甘青鐵線蓮在臨床實踐過程中比較常用，例如在四川紅原等地區(qū)一直被人們用于輔助治療和預(yù)防肝硬化等疾病，但由于缺乏具體試驗數(shù)據(jù)支持，并未推廣開來.本研究旨在此基礎(chǔ)上，通過一些具體試驗，探究甘青鐵線蓮在抗腫瘤方面的具體作用機制，為其進一步開發(fā)提供一定數(shù)據(jù)參考.

1 材料

1.1 研究藥材

藏藥甘青鐵線蓮(Clematis tangutica(Maxim.)Korsh.)，采集于四川省甘孜州色達縣藥王神山，由西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)獸醫(yī)研究室陳朝喜副教授鑒定、提供；甘青鐵線蓮黃酮，參照楊彥文“藏藥甘青鐵線蓮黃酮提取工藝條件”提供的最優(yōu)工藝條件(提取時間90 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取溫度50 ℃、料液比1 ∶43 g/mL) 提取，黃酮實際得率7.18%，經(jīng)純化后4 ℃避光保存[6].

1.2 受試細(xì)胞

S180、Hepa1－6、L1210、B16-F10、SP2/0、LLC 小鼠瘤細(xì)胞株，均由武漢普諾賽生命科技有限公司提供，液氮保存(保存條件:50%基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋10% DMSO ＋40%FBS).

1.3 主要試劑及儀器設(shè)備

CCK-8 試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Annexin V-FITC/PI Kit 凋亡檢測試劑盒購自四正柏生物(FXP018-100)；乳酸脫氫酶(LDH)活性試劑盒購自南京建成生物工程研究所；Z-VAD-FMK、BAY11-708、LY294002、H-89 抑制劑購自派克生物；MDL-12330A 抑制劑購自西格瑪生物；小鼠TGF-β1、IL-6/8/10 、VEGF ELISA 試劑盒均購自四正柏生物公司；小鼠前列腺素E2 ELISA 試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；流式細(xì)胞儀(EXFLOW-206)購自常州必達科生物科技有限公司等.

2 方法

2.1 敏感瘤細(xì)胞選擇

S180 小鼠腹水瘤細(xì)胞株、Hepa1－6 小鼠肝癌細(xì)胞株、L1210 小鼠白血病細(xì)胞株、B16-F10 小鼠黑色素瘤細(xì)胞株、SP2/0 小鼠骨髓瘤細(xì)胞株、LLC 小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株，經(jīng)復(fù)蘇及傳代，選取生長良好、處于對數(shù)生長期細(xì)胞，采用CCK-8 法檢測甘青鐵線蓮黃酮(1 000.0、100.0、10.0、1.0、0.1 μg/mL)對腫瘤細(xì)胞的生長抑制作用，確定敏感瘤細(xì)胞.

2.2 瘤細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測

實驗分組及處理:陰性對照組為敏感瘤細(xì)胞懸液；陽性對照組為敏感瘤細(xì)胞懸液、凋亡誘導(dǎo)劑(5-Fu，濃度100.0 μg/mL)；受試藥物組為敏感瘤細(xì)胞懸液、受試藥物(甘青鐵線蓮黃酮，1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5 μg/mL).各分組加樣完畢后，統(tǒng)一進行AO/EB 染色，結(jié)合熒光顯微鏡，觀察敏感瘤細(xì)胞形態(tài).

2.3 瘤細(xì)胞膜損傷檢測

采用乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒檢測敏感瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清中乳酸脫氫酶含量(活性).實驗分組及處理同“2.2 瘤細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測”.

2.4 瘤細(xì)胞凋亡檢測

采用Annexin-V/PI 雙染法，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，檢測敏感瘤細(xì)胞凋亡(率).實驗分組及處理同“2.2 瘤細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測”.

2.5 瘤細(xì)胞凋亡信號通路檢測

根據(jù)與腫瘤細(xì)胞凋亡關(guān)系較為密切的Caspase、NF-кB、PI3K、CAMP、PKA 信號通路[7-11]，并選取該5種信號通路的特異性酶抑制劑，采用CCK-8 法，計算細(xì)胞存活率.

實驗分組及處理:陰性組為敏感瘤細(xì)胞懸液；對照組為敏感瘤細(xì)胞懸液、信號通路抑制劑；受試藥物A 組為敏感瘤細(xì)胞懸液、受試藥物；受試藥物B 組為敏感瘤細(xì)胞懸液、信號通路抑制劑、受試藥物.各分組加樣完畢后，分別加入CCK-8 試劑，即刻在酶標(biāo)儀測各樣本孔OD 值.(受試藥物為濃度為1 000.0、500.0、250.0 μg/mL 的甘青鐵線蓮黃酮，抑制劑的安全有效濃度為20 μmoL/L.)

2.6 瘤細(xì)胞分泌免疫抑制因子含量檢測

采用ELISA 法檢測敏感瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TGF-β1、IL-6/8/10、VEGF、PGE2 的含量.實驗分組及處理同“2.2 瘤細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測”.

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果與分析

3.1 瘤細(xì)胞生長抑制作用檢測

甘青鐵線蓮黃酮在0.1～1 000.0 μg/mL 范圍內(nèi)，對六種瘤細(xì)胞生長均具有一定的抑制作用并呈濃度依賴性增強；且當(dāng)濃度為1 000.0 μg/mL 時，對S180 瘤細(xì)胞的抑制作用均極顯著強于其它5 種瘤細(xì)胞(P＜0.01).選擇S180 瘤細(xì)胞作為甘青鐵線蓮黃酮的相對敏感瘤細(xì)胞進行后續(xù)研究.結(jié)果見表1.

表1 腫瘤細(xì)胞株生長抑制率Table 1 Growth inhibition rate of tumor cell lines

3.2 S180 瘤細(xì)胞凋亡形態(tài)觀察

甘青鐵線蓮黃酮在62.5～1 000.0 μg/mL 范圍內(nèi)，S180 瘤細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞橙染現(xiàn)象，并隨著黃酮濃度的增加橙染現(xiàn)象增多，細(xì)胞皺縮、核裂解等；陰性對照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，核染色質(zhì)綠染，無明顯凋亡細(xì)胞；陽性藥物組中有明顯的凋亡細(xì)胞，細(xì)胞皺縮、核染色質(zhì)黃綠染或橙染，多數(shù)細(xì)胞染成紅色，出現(xiàn)染色體凝集、核固縮、凋亡小體等.結(jié)果見圖1.

圖1 各組瘤細(xì)胞凋亡形態(tài)(S180)Fig.1 Apoptosis morphology of tumor cell in each group(S180)

3.3 S180 瘤細(xì)胞膜損傷檢測

甘青鐵線蓮黃酮在62.5～1 000.0 μg/mL 范圍內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 活性顯著高于陰性對照組(P＜0.05)，總體呈上升趨勢；濃度在1 000.0 μg/mL時，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 活性與陽性對照組相當(dāng)(P＞0.05)；隨著加藥培養(yǎng)時間的延長12～48 h，各濃度組細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 活性呈上升趨勢.結(jié)果見圖2.

圖2 不同濃度藥物誘導(dǎo)S180 細(xì)胞釋放乳酸脫氫酶Fig.2 Different concentrations of drug induced S180 cells release of LDH

3.4 S180 瘤細(xì)胞凋亡率檢測

甘青鐵線蓮黃酮在62.5～1 000.0 μg/mL 范圍內(nèi)均具有誘導(dǎo)S180 瘤細(xì)胞凋亡的作用，且在62.5～125.0 μg/mL 范圍內(nèi)誘導(dǎo)早期細(xì)胞凋亡作用優(yōu)于晚期細(xì)胞凋亡作用，在250.0～1 000.0 μg/mL 范圍內(nèi)誘導(dǎo)晚期細(xì)胞凋亡作用優(yōu)于早期細(xì)胞凋亡作用.甘青鐵線蓮黃酮濃度在62.5～1 000.0 μg/mL 范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的增加誘導(dǎo)S180 瘤細(xì)胞凋亡的作用明顯增強并呈濃度依賴性.結(jié)果見表2，圖3A～G.

圖3 瘤細(xì)胞凋亡流式散點圖Fig.3 Tumor cell apoptosis streaming scatter plot

表2 S180 瘤細(xì)胞凋亡率Table 2 The apoptosis rate of S180 tumor cells

3.5 S180 瘤細(xì)胞凋亡信號通路檢測

安全有效濃度的5 種信號通路抑制劑作用于S180 細(xì)胞后，與對照組相比，細(xì)胞存活率差異不大(P＞0.05)；其中，在cAMP、PI3k 信號通路檢測試驗中，3 個藥物濃度受試藥物A 組與受試藥物B 組比較，細(xì)胞存活率差異不大(P＞0.05)；NF-κB 信號通路檢測試驗中，3 個藥物濃度的受試藥物B 組與受試藥物A 組比較，細(xì)胞存活率均極顯著低于受試藥物A組(P＜0.01)；PKA 信號通路檢測試驗中， 500.0、1 000 μg/mL濃度組受試藥物B 組細(xì)胞存活率均顯著低于受試藥物A 組(P＜0.05).Caspase 信號通路檢測試驗中，3 個藥物濃度的受試藥物B 組與受試藥物A 組比較， 細(xì)胞存活率均有所增加， 1 000.0、250.0 μg/mL藥物濃度組細(xì)胞存活率達到極顯著差異(P＜0.01)，結(jié)果表明，甘青鐵線蓮誘導(dǎo)S180 腫瘤細(xì)胞凋亡與cAMP、PI3k 信號通路關(guān)系不大，而與抑制NF-κB 信號通路、激活PKA 信號通路、激活Caspase信號通路有一定關(guān)系.結(jié)果見圖4～圖8.

圖4 cAMP 信號通路對S180 細(xì)胞存活率的影響Fig.4 The influence of cAMP signaling pathway on S180 cells survival rate

圖5 NF-κB 信號通路對S180 細(xì)胞存活率的影響Fig.5 The influence of NF-κB signaling pathway on S180 cells survival rate

圖6 PKA 信號通路對S180 細(xì)胞存活率的影響Fig.6 The influence of PKA signaling pathway on S180 cells survival rate

圖7 Caspase 信號通路對S180 細(xì)胞存活率的影響Fig.7 The influence of Caspase signaling pathway on S180 cells survival rate

圖8 PI3k 信號通路對S180 細(xì)胞存活率的影響Fig.8 The influence of PI3k signaling pathway on S180 cells survival rate

3.6 S180 瘤細(xì)胞分泌免疫抑制因子含量檢測

不同濃度藥物組62.5～1 000.0 μg/mL S180 瘤細(xì)胞TGF-β1、IL-6 、IL-8 、IL-10、VEGF、PGE2 分泌量均顯著低于空白對照組(P＜0.05)并且呈濃度依賴性降低.其中在1 000.0 μg/mL 組中， S180 瘤細(xì)胞IL-6、VEGF 的分泌量顯著低于陽性對照組(P＜0.05)， PGE2 分泌量與陽性對照組相當(dāng)(P＞0.05).結(jié)果見表3.

表3 甘青鐵線蓮黃酮對S180 瘤細(xì)胞分泌免疫抑制因子的影響Table 3 Influence of flavonoids of Clematis glycyrrhiza on secretion of immunosuppressive factors by S180 tumor cells

4 討論與結(jié)論

近年來，中藥成分誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡研究已由凋亡現(xiàn)象觀察深入到具體凋亡機制的探究，如凋亡信號通路機制及腫瘤分泌功能的影響等方面.如cAMP/PKA 信號通路的激活，能夠降低細(xì)胞生長速度、抑制細(xì)胞增殖并促進細(xì)胞凋亡[12].NF-κB 是調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要信號通路，NF-κB 通路激活能夠抑制細(xì)胞凋亡、促進細(xì)胞生長、惡性轉(zhuǎn)化、耐藥、腫瘤轉(zhuǎn)移等[13-15].而Caspase 信號通路的激活放大細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)途徑，促進腫瘤細(xì)胞凋亡[16-18].PI3K 信號通路通過抑制多種刺激誘發(fā)的細(xì)胞凋亡、促進細(xì)胞周期進展、參與血管形成、參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等[19-20].研究表明，腫瘤組織中TGF-β1 的高表達在腫瘤微環(huán)境血管形成、腫瘤細(xì)胞胞外基質(zhì)合成、免疫抑制、浸潤轉(zhuǎn)移中起著重要作用[21-25]；VEGF 是促進血管新生中效力最強、特異性最高的細(xì)胞因子，可促進腫瘤血管、淋巴管、腫瘤基質(zhì)的生成，同時提高腫瘤血管的通透性，對腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移有促進作用[26]；腫瘤組織自分泌IL-6 因子直接作用于腫瘤組織，誘導(dǎo)惡病質(zhì)和新生血管生成等間接促進腫瘤細(xì)胞的生長[27]；腫瘤組織自分泌IL-8 不僅作為腫瘤組織的血管發(fā)生因子，還可作為趨化因子誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞的移動[28-29]；腫瘤組織自分泌IL-10 因子促進腫瘤生長，并抑制細(xì)胞程序死亡，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移[30-31]；PGE2 在多種類型的腫瘤組織中含量較高，參與加速腫瘤細(xì)胞增殖、抗腫瘤細(xì)胞凋亡、增強腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移、抑制宿主抗腫瘤免疫功能等[32-35].

本研究采用CCK-8 法、AO/EB 染色法、Annexin V/PI 雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)研究藏藥甘青鐵線蓮黃酮對敏感瘤細(xì)胞(小鼠腹水瘤S180)的影響，CCK-8結(jié)果表明，不同濃度甘青鐵線蓮黃酮對S180 瘤細(xì)胞生長均有一定的抑制作用并具有濃度依賴性，1 000.0 μg/mL濃度時，對S180 瘤細(xì)胞生長抑制率為49.08%，與陽性藥物5-Fu 相當(dāng)；AO/EB 染色結(jié)果表明，甘青鐵線蓮黃酮1 000.0 μg/mL 時，大量S180 瘤細(xì)胞形變，細(xì)胞體積變小、呈皺縮狀、被染成橙色，細(xì)胞核裂，出現(xiàn)凋亡小體等，與凋亡誘導(dǎo)劑5-Fu 一致；LDH 活性檢測結(jié)果表明，隨著甘青鐵線蓮黃酮濃度的上升，S180 瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 活性上升，濃度在1 000.0 μg/mL時，細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 活性與5-Fu相當(dāng)；凋亡檢測結(jié)果表明，甘青鐵線蓮黃酮在62.5～125.0 μg/mL 誘導(dǎo)早期細(xì)胞凋亡作用強于晚期細(xì)胞凋亡作用，250.0～1 000.0 μg/mL 誘導(dǎo)晚期細(xì)胞凋亡作用強于早期細(xì)胞凋亡作用，且與甘青鐵線蓮黃酮濃度密切相關(guān)；信號通路研究表明，甘青鐵線蓮黃酮通過增強cAMP-PKA 信號通路中PKA 酶活性、活化Caspase 信號通路中caspase 活性、抑制NF-κB 信號通路中NF-κB 酶活性有效誘導(dǎo)S180 瘤細(xì)胞凋亡.S180瘤細(xì)胞在其生長過程中，能夠分泌免疫抑制因子TGF-β1、IL-6、IL-8、IL-10、VEGF、PGE2 等，且分泌水平各異，有利于腫瘤微環(huán)境的形成、促進腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)機體免疫抑制、實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，不同濃度甘青鐵線蓮黃酮作用于S180 瘤細(xì)胞，TGF-β1、IL-6/8/10、VEGF、PGE2 分泌量明顯降低并呈濃度依賴性；且當(dāng)藥物濃度為1 000.0 μg/mL 時，對S180 瘤細(xì)胞分泌IL-6、VEGF、PGE2 的抑制作用強于凋亡誘導(dǎo)劑5-Fu.

綜合上述分析，藏藥甘青鐵線蓮黃酮通過對S180 瘤細(xì)胞膜的損傷、增強瘤細(xì)胞cAMP-PKA 信號通路中PKA 酶活性、活化Caspase 信號通路中caspase活性、抑制NF-κB 信號通路中NF-κB 酶活性的作用達到抑制小鼠S180 瘤細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡發(fā)生并具有濃度依賴性，且具有與凋亡誘導(dǎo)劑5-Fu 相似的抑制S180 瘤細(xì)胞分泌TGF-β1、IL-6、IL-8、IL-10、VEGF、PGE2 細(xì)胞因子的作用并具良好量效關(guān)系.研究結(jié)果可為藏藥甘青鐵線蓮的藥理學(xué)研究提供數(shù)據(jù)參考.