1 例COL4A4 基因5 號外顯子c.274G>T：p.G92*無義突變的薄基底膜腎病患者家系遺傳分析

李靜，朱井俊，2，邵坤，段子才，王飛

1 阜陽市第六人民醫(yī)院檢驗科，安徽阜陽 236001；2 阜陽市第二人民醫(yī)院腎臟內(nèi)科；3 阜陽師范大學(xué)體育學(xué)院；4 安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗系

薄基底膜腎病，也稱為良性家族性血尿，是一種常見的遺傳性腎臟疾病，其發(fā)病率較高。該疾病是兒童和成人持續(xù)性鏡下血尿的最常見原因之一，臨床特征主要表現(xiàn)為持續(xù)性血尿和輕度蛋白尿，通常不會出現(xiàn)眼耳等其他器官的受累，并且預(yù)后較好［1-2］?；颊咄ǔ＞哂姓５哪I功能，其惟一或主要的病理表現(xiàn)是彌漫性腎小球基底膜變?。?-3］。1996年，LEMMINK 等［1］報道，薄基底膜腎病的主要致病原 因 與 編 碼Ⅳ型 膠 原α3、α4 鏈 的COL4A3 和COL4A4 的基因突變相關(guān)，該基因突變導(dǎo)致膠原蛋白結(jié)構(gòu)或數(shù)量改變，進而影響基底膜的正常功能和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。同時，在其他家系研究中，也報道了編碼Ⅳ型膠原α3、α4和α5鏈的基因COL4A3、COL4A4和COL4A5 可能為致病原因，其中，一些常見的COL4A4 基因突變位點包括c.4001A>G：p.G1334E錯義突變位點、c.5044C>G：p.R1682G 錯義突變位點和c.871-1G>A：splicing 剪切突變位點等。上述這些結(jié)果提示薄基底膜腎病與Alport綜合征（AS）有較為密切的關(guān)系，具有遺傳異質(zhì)性。一般認(rèn)為，多數(shù)薄基底膜腎病患者不會發(fā)展為慢性腎功能衰竭或終末期腎病，但10%～20%的薄基底膜腎病患者會在平均年齡60 歲時發(fā)展為終末期腎病［4］。目前，由于沒有明確的循證治療方案可用于薄基底膜腎病，因此，了解COL4A4 基因突變引起的薄基底膜腎病的臨床表型特征及遺傳特點對于該疾病預(yù)后、治療策略和監(jiān)測方案的制定非常重要。我們發(fā)現(xiàn)1 例由COL4A4 基因5 號外顯子c.274G>T：p.G92*無義突變所致的薄基底膜腎病，現(xiàn)將其家系遺傳特點報道如下。

1 資料分析

患者女，64歲。于2016年無明顯誘因下出現(xiàn)雙下肢輕度水腫，活動后水腫癥狀加重，休息后稍緩解，無腰疼，無肉眼血尿，無胸悶、氣喘，未重視。半年后患者因水腫癥狀加重，呈凹陷性，伴有腰酸、乏力、夜尿增多等不適癥狀，至當(dāng)?shù)匦l(wèi)生院就診。查尿常規(guī)提示潛血陽性（+++）、蛋白尿陽性（++），血肌酐203 μmol/L，腎臟彩超提示雙腎大小尚可，臨床診斷“慢性腎炎、腎功能不全”。為進一步明確病因，就診于本院，征得患者同意后給予行腎穿刺活檢術(shù)。腎活檢病理提示腎小球基底膜厚度變薄，符合薄基底膜腎病，建議行基因檢測進一步明確診斷。經(jīng)與患者及其家屬溝通后，患者未同意行基因檢測。給予護腎、排毒、降壓、減少尿蛋白等藥物治療延緩腎功能進展，并囑其注意休息、避免勞累、慎用腎毒性藥物，出院后患者沒有進行規(guī)律門診復(fù)查隨訪、也未按時服用藥物。

2021 年6 月患者因惡心、嘔吐、胸悶就診本院。實驗室檢查尿常規(guī)提示潛血陽性（+++）、尿蛋白陽性（++++），血 肌 酐1 008.8 μmol/L，尿 素 氮23.94 mmol/L，血紅蛋白74 g/L，腎臟超聲提示雙腎縮小、呈慢性損害性聲像圖。結(jié)合薄基底膜腎病史，臨床明確診斷為慢性腎衰竭—尿毒癥期；薄基底膜腎病。給予維持性血液透析治療，2～3 次/周，病情總體尚平穩(wěn)。

同時因為家系中有多人腎臟相關(guān)疾病出現(xiàn)，對患者3 代以內(nèi)的家庭成員進行調(diào)查，該家系成員兒子（Ⅱ1、Ⅱ4）、女兒（Ⅱ2、Ⅱ3）均有血尿和蛋白尿，先證者的孫女Ⅲ2、孫子Ⅲ4和外甥女Ⅲ5均有血尿，其他家庭成員尿檢無異常。為了進一步明確該病的病因以及是否存在遺傳性腎病，征得患者及其家人同意后，我們采集了先證者和其家系成員的外周靜脈血2 mL，使用Illumina Hiseq2500 測序儀對其進行全外顯子組測序，最后通過Sanger 測序?qū)z測到的變異位點進行了家系驗證。

全外顯子組測序發(fā)現(xiàn)，先證者（Ⅰ1）COL4A4 基因5 號外顯子存在c.274G>T：p.G92*無義突變。Sanger 測序結(jié)果（見圖1）顯示該突變遺傳符合家系共分離，在患者與家族成員中攜帶者遵循一致的遺傳模式，均符合常染色體顯性遺傳，提示該突變位點可能是致病位點。先證者兒子（Ⅱ4）、女兒（Ⅱ2、Ⅱ3）、孫女（Ⅲ2）、孫子（Ⅲ4）、外甥女（Ⅲ5）COL4A4 基因5 號外顯子均存在c.274G>T：p.G92*無義突變。其中先證者兒子（II1）因外出務(wù)工未進行血樣采集化驗，其女兒（Ⅲ2）和兒子（Ⅲ4）均攜帶該突變，再結(jié)合Ⅱ1 有血尿、蛋白尿癥狀，推測出家庭成員（Ⅱ1）攜帶該突變。對檢測出的COL4A4 基因突變進行數(shù)據(jù)庫檢索，發(fā)現(xiàn)其為新發(fā)突變位點。

圖1 薄基底膜腎病家系中家庭成員COL4A4基因突變位點Sanger測序結(jié)果

按照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會（ACMG）的遺傳突變分析指南，對先證者家系成員進行遺傳分析，并參考遺傳病致病數(shù)據(jù)庫在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）、人類基因突變數(shù)據(jù)庫（HGMD）以及PubMed 等相關(guān)文獻進行分析。通過綜合遺傳方式和先證者的突變基因分析確定該遺傳病的遺傳方式，并鑒定出家系共分離的突變位點。最終根據(jù)先證者的臨床特征篩選出與先證者臨床特征最匹配的致病突變?yōu)?號外顯子.274G>T：p.G92*突變。

在Uniprot和Ensembl數(shù)據(jù)庫中篩選人類和其他物種COL4A4 基因同源蛋白序列，用DNAman 軟件進行蛋白序列同源比對，發(fā)現(xiàn)p.G92*位點甘基酸在人類和其他物種相同位置上高度保守（見圖2）。應(yīng)用Swiss-model 同源建模軟件對新發(fā)現(xiàn)的變異進行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)同源建模分析比對，變異c.274G>T：p.G92*導(dǎo)致編碼產(chǎn)物由甘氨酸替換成終止密碼子，與野生型蛋白相比有顯著差異（見圖3），說明該突變可能會導(dǎo)致COL4A4 蛋白的形態(tài)異常和功能障礙。以上結(jié)果均顯示該突變?yōu)楸』啄つI病的潛在致病突變位點。

圖3 Swiss-model同源建模構(gòu)建的COL4A4蛋白三維結(jié)構(gòu)

2 討論

薄基底膜腎病的遺傳方式是一種常染色體顯性遺傳疾病，其發(fā)病通常與COL4A3/COL4A4 基因的突變有關(guān)。該疾病的主要臨床表現(xiàn)是血尿，多數(shù)患者表現(xiàn)為持續(xù)的鏡下血尿，也可能出呼吸道感染或劇烈活動后的發(fā)作性肉眼血尿。該疾病可以在任何年齡發(fā)生，但多數(shù)患者的預(yù)后良好［5］。

在GBM 中，Ⅳ型膠原作為含量最豐富的分子之一，它與基底膜中的層黏連蛋白、巢蛋白等相互作用，共同參與組成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)［6］。目前已鑒定出六種不同的IV 型膠原蛋白鏈，分別被命名為α1至α6，這些蛋白鏈由COL4A1 至COL4A6 基因進行編碼。隨著腎臟的發(fā)育，α1α2 鏈逐漸被α3α4α5 鏈取代，因此α 3α4α5鏈?zhǔn)浅錾驡BM的主要成分，其交聯(lián)度更高，更耐蛋白質(zhì)降解，這可能對腎小球選擇性屏障特性的建立和維持至關(guān)重要［7］。COL4A3和COL4A4位于2q36.3 上，COL4A3 包含52 個外顯子并編碼α3 鏈（1 670 個氨基酸），而COL4A4包含48個外顯子并編碼α4 鏈（1 690 個氨基酸）［8］。薄基底膜腎病中COLA43 和COL4A4 突變可能影響阻礙GBM 中α3α4α5交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成，并最終降低GBM 的厚度和穩(wěn)定性，導(dǎo)致薄基底膜腎病或AS的發(fā)生。

AS 的臨床表現(xiàn)比薄基底膜腎病復(fù)雜，主要表現(xiàn)為腎功能進行性惡化、高頻感音神經(jīng)性耳聾和眼部病變，有些AS患者早期或者不典型的情況下只有血尿一種表現(xiàn)，需要與薄基底膜腎病進行區(qū)分。AS的遺傳模式有多種，其中X連鎖顯性遺傳型占大多數(shù)，約85%，通常由COL4A5 基因發(fā)生突變導(dǎo)致，其余15%左右是常染色體顯性遺傳或隱性遺傳，由COL4A3 或COL4A4 基因發(fā)生突變引起［9］。當(dāng)存在持續(xù)性腎小球血尿、少量蛋白尿（500 mg/d）、腎功能正常（大部分）且無其他明顯腎外異常時，臨床上可診斷薄基底膜腎?。?0］。大約40%的薄基底膜腎病家庭成員有血尿，血尿與COL4A3/COL4A4 基因座的突變分離，約三分之二的薄基底膜腎病患者中，至少有一名其他家庭成員患有常染色體顯性遺傳模式的血尿［11］。

以往研究認(rèn)為薄基底膜腎病是良性的，在健康人群中可出現(xiàn)，其腎臟超聲、腎功能、血壓等均正常。本研究中，先證者64 歲，病情逐漸發(fā)展到加重階段，并開始進行透析治療，該家系成員II1、II2（38歲）、II3（36 歲）、II4（35 歲）均有血尿、蛋白尿，病情較先證者輕。先證者孫女III2（12 歲），孫子III4（7歲）以及外甥女III5（13 歲）均有血尿，無其他癥狀。有研究［12］發(fā)現(xiàn)，薄基底膜腎病的癥狀與年齡有相關(guān)性，患者會隨著年齡增長而漸漸發(fā)展到更加嚴(yán)重的臨床階段，出現(xiàn)蛋白尿、局灶階段性腎小球硬化、腎功能下降等臨床表現(xiàn)，這也表明薄基底膜腎病并不如之前所認(rèn)為的那樣良性。

薄基底膜腎病的遺傳模式是常染色體顯性遺傳，即只要一個等位基因上出現(xiàn)有害的突變，就可能引起疾病的發(fā)生。全外顯子組測序發(fā)現(xiàn)先證者（I1）COL4A4 基因5 號外顯子存在c.274G>T：p.G92*無義突變，使92 號甘氨酸突變成終止密碼子，進而腎小球基底膜三聚體組裝異常，這破壞了Ⅳ型膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和柔韌性，最終影響到基底膜網(wǎng)絡(luò)的功能。該突變經(jīng)Sanger測序結(jié)果證實與家系共分離相符合，在蛋白序列同源比對中發(fā)現(xiàn)，該變異位點在人類和其他物種之間具有高度的保守性，利用Swiss-model同源建模軟件構(gòu)建出的COL4A4蛋白野生型和變異型的三維結(jié)構(gòu)，可以清楚地看到變異體p.G92*無法形成完整的蛋白結(jié)構(gòu)，這種無義突變導(dǎo)致翻譯過程提前結(jié)束，所編碼的蛋白質(zhì)無法正常表達，對蛋白質(zhì)功能的影響很大。

總之，COL4A4 基因5 號外顯子c.274G>T：p.G92*無義突變致薄基底膜腎病臨床表現(xiàn)為血尿，病理表現(xiàn)為基底膜變薄，晚期可能會發(fā)展為終末期腎??；該突變引起的遺傳模式為常染色體顯性遺傳。根據(jù)ACMG 指南，其突變類型可能為致病性突變。此突變位點目前在國內(nèi)外未見報道，補充了人類薄基底膜腎病基因突變數(shù)據(jù)庫，對進一步研究中國人群薄基底膜腎病的發(fā)病機制、遺傳咨詢等提供了依據(jù)。