血根堿在小鼠煙曲霉菌性角膜炎中的抗炎作用

魯葉慧 欒軍杰 劉星 吳瑗 林靜

[摘要] 目的 探索血根堿（SAN）在小鼠煙曲霉菌感染角膜炎模型中的抗炎作用。方法 應(yīng)用CCK-8實驗檢測不同濃度SAN（0、62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 μg/L）對小鼠來源巨噬細(xì)胞（RAW264.7）增殖活力的影響；制備小鼠煙曲霉菌角膜炎模型，取感染第3天眼球，應(yīng)用蘇木精-伊紅（HE）染色檢測小鼠角膜組織炎癥細(xì)胞浸潤程度，ELISA法檢測小鼠角膜組織腫瘤壞死因子α（TNF-α）及環(huán)氧化酶2（COX-2）的蛋白表達(dá)水平；采用RT-PCR和ELISA方法檢測巨噬細(xì)胞中白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、TNF-α及單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP-1）的蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果 500.0 μg/L的SAN對RAW264.7細(xì)胞活性無影響（F=0.292，P>0.05）；HE染色顯示，500.0 μg/L SAN組小鼠角膜組織炎癥細(xì)胞浸潤相較于模型組明顯減少；500.0 μg/L SAN可顯著下調(diào)煙曲霉菌誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1的mRNA和蛋白表達(dá)及小鼠模型中TNF-α、COX-2的蛋白表達(dá)水平，差異均有顯著性（F=20.939～2 690.170，P<0.01）。結(jié)論 SAN通過抑制炎癥細(xì)胞浸潤和下調(diào)炎癥遞質(zhì)的表達(dá)在煙曲霉菌感染中發(fā)揮抗炎作用。

[關(guān)鍵詞] 血根堿；巨噬細(xì)胞；小鼠；炎癥；煙曲霉菌

[中圖分類號] R392;R379.6

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2023）04-0507-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.113

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20230918.1620.001;2023-09-20 10：53：36

ANTI-INFLAMMATORY EFFECT OF SANGUINARINE AGAINST MOUSE ASPERGILLUS FUMIGATUS KERATITIS LU Yehui， LUAN Junjie， LIU Xing， WU Yuan， LIN Jing （Department of Ophthalmology， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）＼; [ABSTRACT] Objective To explore the anti-inflammatory effect of sanguinarine （SAN） in a mouse model of Aspergillus （A.） fumigatus keratitis. Methods The effects of SAN at different concentrations （0， 62.5， 125.0， 250.0， 500.0， 1 000.0 μg/L） on the proliferative activity of mouse-derived macrophages （RAW264.7） were determined by using Cell Counting Kit-8. A mouse model of A.fumigatus keratitis was prepared. The eyes were taken on the third day of infection. The degree of inflammatory cell infiltration in the mouse cornea was determined with hematoxylin-eosin （HE） staining. The protein expression of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and cyclooxygenase-2 （COX-2） in the cornea was measured by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The mRNA and protein expression levels of interleukin 1β （IL-1β）， interleukin 6 （IL-6）， TNF-α， and monocyte chemotactic protein-1 （MCP-1） in macrophages were measured by RT-PCR and ELISA. Results SAN at 500.0 μg/L had no significant effect on the activity of RAW264.7 cells （F=0.292，P>0.05）. HE staining revealed a significant decrease in inflammatory cell infiltration in the cornea in the SAN （500.0 μg/L） group compared with the model group; SAN at 500.0 μg/L significantly down-regulated the mRNA and protein expression of IL-1β， IL-6， TNF-α， and MCP-1 in A.fumigatus-induced RAW264.7 cells and the protein le-vels of TNF-α and COX-2 in the mouse model （F=20.939-2 690.170，P<0.01）. Conclusion SAN exerted anti-inflammatory effects against A.fumigatus infection via inhibiting inflammatory cell infiltration and down-regulating the expression of inflammatory mediators.

[KEY WORDS] sanguinarine; macrophages; mice; inflammation; Aspergillus fumigatus

真菌性角膜炎是一種嚴(yán)重的角膜感染性疾病，在亞洲和非洲等發(fā)展中國家發(fā)病率高^[1]。絲狀真菌如煙曲霉菌和鐮刀菌是誘發(fā)真菌性角膜炎的主要原因，一旦其分生孢子透過角膜上皮進(jìn)入到基質(zhì)，孢子會迅速萌發(fā)，誘發(fā)癥狀。目前，真菌性角膜炎的一線治療是局部使用那他霉素、伏立康唑、兩性霉素B等藥物^[2]，但這些藥物存在水溶性差、滲透性差及嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此亟待開發(fā)可用于臨床的低毒高效的治療藥物。血根堿（SAN）為一種季銨鹽類苯并菲啶生物堿，是來源于血根草、大白屈菜和博落回的一類重要的天然異喹啉生物堿^[3-4]。 SAN具有多種藥理活性，包括抗腫瘤、抗菌、抗炎和改善心血管功能等^[5-9]。最近的研究顯示，在大鼠的神經(jīng)源性疼痛模型中，SAN可以通過抑制白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等炎癥因子的表達(dá)來減輕疼痛^[10-12]。SAN在急、慢性炎癥中發(fā)揮抗炎作用。但是SAN能否在真菌性角膜炎中發(fā)揮抗炎作用尚未見報道。本研究旨在探討SAN對煙曲霉菌感染的巨噬細(xì)胞及小鼠角膜炎癥的調(diào)節(jié)作用，為治療真菌性角膜炎提供一種新思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

小鼠來源的RAW264.7巨噬細(xì)胞系購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海）。實驗所用40只8周大小健康的C57BL/6雌鼠購于山東濟南朋悅有限公司，體質(zhì)量20～30 g，按照青島大學(xué)附屬醫(yī)院動物委員會批準(zhǔn)的方案飼養(yǎng)。SAN（100 mg，純度98%）由麥克林試劑公司提供，用體積分?jǐn)?shù)0.001的DMSO溶解后以2 g/L儲備液-20 ℃儲存；RNAex pro reagent裂解液（艾科瑞生物工程有限公司）；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（Biolegend公司）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（碧云天，中國）；煙曲霉菌（CPCC 3.0772，中國普通微生物菌種保藏管理中心（北京））。

1.2 研究方法

1.2.1 煙曲霉菌絲制備 煙曲霉菌絲及滅活煙曲霉菌絲制備方法基于本實驗室原有步驟，進(jìn)行優(yōu)化^[13]。將煙曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于酵母膏胨葡萄糖培養(yǎng)液（葡萄糖10 g、蛋白胨100 g、酵母5 g溶解于雙蒸水中定容1 L），置35 ℃培養(yǎng)箱孵育4～7 d后于超凈工作臺研磨菌絲至20～30 μm大小，一半經(jīng)3次離心后重懸，用DMEM稀釋至1×10¹¹CFU/L；另一半浸泡于體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇中，24 h后重復(fù)前述步驟，獲得滅活煙曲霉菌用于后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8實驗檢測SAN對RAW264.7細(xì)胞活力的影響 RAW264.7細(xì)胞以4×10⁸CFU/L接種于96孔板中，孵育12 h至細(xì)胞密度約70%更換含SAN（濃度分別為0、62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 μg/L）培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24 h后，以無菌PBS洗滌3次，更換含CCK-8的培養(yǎng)液繼續(xù)孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀（PerkinElimer， 美國）測各孔450、600 nm波長處的吸光度值。每個樣本設(shè)5個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.3 小鼠分組及處理 32只健康小鼠隨機分為N組、500.0 μg/L SAN處理組（SAN組）、AF處理組及AF+500.0 μg/L SAN處理組（AS組），每組8只，每只小鼠的右眼為實驗眼，左眼為空白對照眼。建模：AF組和AS組小鼠腹腔注射80 g/L水合氯醛約0.08 mL后，用手術(shù)無菌刀片刮除中央角膜上皮形成約2 mm×2 mm缺損區(qū)域，做井字劃痕、涂抹煙曲霉菌、覆蓋光滑的角膜接觸鏡并縫合眼瞼，24 h后拆除縫線。N組和AF組小鼠以雙蒸水點眼治療，每次5 μL，每天4次；SAN組和AS組小鼠以500.0 μg/L SAN點眼治療，每次5 μL，每天4次。治療第3天，以頸椎脫臼法處死小鼠，獲得小鼠角膜組織。6只健康小鼠隨機分為AF處理組和AS處理組，建模后分別以雙蒸水和500.0 μg/L SAN點眼治療，每次5 μL，每天4次，治療第3天以頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠眼球。

1.2.4 細(xì)胞刺激 RAW264.7細(xì)胞接種于12孔板，孵育至細(xì)胞密度約80%后換液。將細(xì)胞分為N組、SAN組、AF組、AS組，AF組及AS組每孔加入60 μL滅活煙曲霉菌絲，2 h后SAN組及AS組加入SAN溶液使SAN終濃度為500.0 μg/L，8 h后收集細(xì)胞樣本用于細(xì)胞RT-PCR實驗（每組6孔）； 24 h后收集細(xì)胞上清液，離心后取上清液用于細(xì)胞ELISA檢測（每組8孔）。

1.2.5 HE染色檢測小鼠角膜中炎癥細(xì)胞的浸潤AS處理組（n=3）和AF處理組（n=3）的眼球分別在含OCT包埋劑的EP管（2 mL）中調(diào)整至合適位置后迅速液氮凍存，使用Leica冷凍切片機切取角膜中央最大截面處8 μm厚的角膜切片。應(yīng)用HE染色試劑盒染色，按說明書方法進(jìn)行操作，自然晾干后中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠角膜中炎癥細(xì)胞浸潤情況。

1.2.6 實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測細(xì)胞因子的mRNA表達(dá) 細(xì)胞中加入RNAex pro reagent裂解液后，在冰上裂解0.5 h，用無菌的200 μL黃槍頭刮取細(xì)胞收集至2 mL的 EP管中，根據(jù)RNAex pro reagent試劑說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，建立2 μg逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。使用RT-PCR儀進(jìn)行擴增反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參，檢測巨噬細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α及單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP-1）的mRNA表達(dá)。引物及其序列來自GenBank，由艾科瑞生物有限公司設(shè)計及合成。見表1。

1.2.7 相關(guān)蛋白表達(dá)檢測 應(yīng)用ELISA試劑盒檢測小鼠RAW264.7細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α以及MCP-1及小鼠角膜組織中TNF-α和COX-2的蛋白表達(dá)，根據(jù)試劑盒說明書方法進(jìn)行實驗。使用酶標(biāo)儀檢測450 nm及570 nm波長處吸光度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 26.0、Graph Pad Prism 9.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料結(jié)果以±s表示，多組比較采用單因素方差分析及雙因素析因方差分析，組間兩兩比較采用Tukey法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度SAN溶液對巨噬細(xì)胞活力的影響

不同濃度的SAN（0、62.5、125.0、250.0、500.0、1 000.0 μg/L）與RAW264.7細(xì)胞共孵育24 h后，1 000.0 μg/L SAN溶液處理組巨噬細(xì)胞的存活率低于其他各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.272，P<0.05）。500.0 μg/L濃度以內(nèi)的SAN處理組的細(xì)胞存活率與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見圖1。后續(xù)實驗選擇500.0 μg/L作為研究濃度。

2.2 煙曲霉菌對小鼠角膜組織中炎癥細(xì)胞浸潤的影響

HE染色觀察結(jié)果顯示，感染煙曲霉菌3 d后，500.0 μg/L SAN組和AF組相比，小鼠角膜基質(zhì)層水腫明顯減輕，炎癥細(xì)胞數(shù)量顯著減少，組織病理結(jié)構(gòu)更為有序（圖2）。

2.3 各組細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α以及MCP-1 mRNA 表達(dá)水平比較

析因設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示，滅活菌絲處理產(chǎn)生的單獨效應(yīng)（F_AF=131.211～253.824，P<0.01）、SAN處理產(chǎn)生的單獨效應(yīng)（F_SAN=28.794～119.300，P<0.01）、不同滅活菌絲處理組間（F=141.468～360.577，P<0.01）和不同SAN處理組間（F=10.373～18.560，P<0.01）差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，滅活菌絲處理與SAN處理之間存在交互作用（F_AF×SAN=10.566～18.536，P<0.01）。與N組和SAN組相比較，AF組細(xì)胞炎癥遞質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的mRNA表達(dá)水平明顯升高；與AF組相比，AS組炎癥遞質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的mRNA表達(dá)水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=20.939～37.097，P<0.01）。見表2。

2.4 各組細(xì)胞中IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1 蛋白表達(dá)水平比較

析因設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示，滅活菌絲處理產(chǎn)生的單獨效應(yīng)（F_AF=1 765.400～6 636.850，P<0.01）、SAN處理產(chǎn)生的單獨效應(yīng)（F_SAN=98.002～3 070.111，P<0.01）、不同滅活菌絲處理組間（F=1 490.936～9 367.445，P<0.01）和不同SAN處理組間（F=63.775～1 347.574，P<0.01）差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義，滅活菌絲處理與SAN處理存在交互作用（F_AF×SAN=61.187～1 342.599，P<0.01）。與N組和SAN組相比，AF組中炎癥遞質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)；AS組與AF組相比，炎癥遞質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=124.949～2 690.170，P<0.01）。見表3。

2.5 各組小鼠角膜中TNF-α和COX-2 蛋白表達(dá)水平比較

析因設(shè)計的方差分析顯示，滅活菌絲處理產(chǎn)生的單獨效應(yīng)（F_AF=1 207.798、1 569.370，P<0.01）、SAN處理產(chǎn)生的單獨效應(yīng)（F_SAN=75.086、260.364，P<0.01）、不同滅活菌絲處理組間（F=942.588、1 554.091，P<0.01）和不同SAN處理組間（F=295.009、356.222，P<0.01）的差異均有顯著性，滅活菌絲處理與SAN處理有交互作用（F_AF×SAN=275.643、340.296，P<0.01）。與N組和SAN組相比較，AF組小鼠感染煙曲霉菌3 d后，炎癥遞質(zhì)TNF-α和COX-2蛋白表達(dá)水平明顯升高；AS組與AF組相比，小鼠感染煙曲霉菌3 d后，炎癥遞質(zhì)TNF-α和COX-2的蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有顯著性（F=570.488、696.427，P<0.01）。見表4。

3 討論

真菌性角膜炎是由致病真菌誘導(dǎo)的嚴(yán)重眼部感染性疾病，其致病因素中植物劃傷引起的角膜損傷約占40%～60%^[14]，另外隱形眼鏡的使用^[15]、長期使用抗生素或類固醇^[16]、既往眼部手術(shù)史^[17]都是重要的致病因素。當(dāng)煙曲霉菌首次攻擊宿主時，其毒力決定簇誘發(fā)宿主發(fā)生強烈的固有免疫反應(yīng)^[10]，固有免疫系統(tǒng)包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等，是抵御真菌感染的第一道防線；它能夠快速啟動并消除入侵的煙曲霉菌^[11]。這種防御機制涉及特異性受體的識別、指示信號通路的激活和多種炎癥遞質(zhì)的產(chǎn)生，從而加強炎癥反應(yīng)。但是大量的炎癥遞質(zhì)可引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，會加重感染組織的損傷，使真菌感染的病程延長，產(chǎn)生一系列危險的并發(fā)癥如角膜穿孔甚至患眼失明^[12]。真菌性角膜炎的發(fā)病率逐漸增高，且臨床缺乏有效治療藥物，迫切需要找到新的高效低毒治療藥物。

SAN是一種以苯并菲啶結(jié)構(gòu)為特征的生物堿類天然小分子，具有高效抗炎^[18-19]、抗菌^{[4，7，20]}、抗腫瘤^[21]等藥理活性。已有研究表明，在大鼠LPS介導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，SAN可以通過抑制大鼠H9c2心肌細(xì)胞釋放炎癥遞質(zhì)IL-1β、IL-6和TNF-α發(fā)揮抗炎作用^[22]。此外有研究顯示，在LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)毒性休克模型中，SAN通過抑制小鼠巨噬細(xì)胞釋放TNF-α及NO發(fā)揮抗炎作用^[18]。然而，SAN在真菌性角膜炎中是否發(fā)揮抗炎作用尚未有報道。炎癥從本質(zhì)上說是機體的防御反應(yīng)，在初期往往起到積極作用，例如炎性充血可增加局部組織血流量，使組織得到更多的氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)等，增加組織代謝和抗擊力^[23]。但持續(xù)的炎癥反應(yīng)使得巨噬細(xì)胞產(chǎn)生過量的炎癥遞質(zhì)，可能加重角膜損傷；還會導(dǎo)致角膜蛋白沉積，造成角膜水腫甚至角膜穿孔。本研究首先探究SAN在小鼠巨噬細(xì)胞中的安全濃度，結(jié)果表明500.0 μg/L SAN對小鼠巨噬細(xì)胞沒有影響，可作為安全濃度用于后續(xù)實驗。本文研究感染第3天的小鼠角膜組織HE染色結(jié)果顯示，500.0 μg/L SAN組和AF組相比，小鼠角膜基質(zhì)層水腫明顯減輕，炎癥細(xì)胞數(shù)量顯著減少，組織病理結(jié)構(gòu)更為有序。ZHENG等^[24]研究顯示，在LPS誘導(dǎo)的小鼠乳腺炎模型中，SAN通過顯著減少LPS引起的中性粒細(xì)胞浸潤、減輕腺泡結(jié)構(gòu)的破壞，進(jìn)而修復(fù)血-乳屏障發(fā)揮抗炎功能。本文研究結(jié)果與其一致。因此，SAN可能通過抑制炎癥反應(yīng)中的免疫細(xì)胞過度激活，對煙曲霉菌性角膜炎起到治療作用。

在真菌性角膜炎中，炎癥細(xì)胞過度激活會導(dǎo)致大量的炎癥遞質(zhì)釋放加重炎癥反應(yīng)^[25]。已有研究證實，IL-1β是參與角膜抗真菌免疫應(yīng)答的重要炎癥因子，主要由激活的單核細(xì)胞產(chǎn)生，介導(dǎo)急性炎癥應(yīng)答^[26]。在右旋糖酐硫酸鈉誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中，SAN通過阻斷NLRP3-（Caspase-1）/IL-1β通路，降低炎癥因子IL-1β的表達(dá)，對小鼠結(jié)腸炎具有治療作用^[27]。本研究結(jié)果顯示，SAN能夠明顯抑制小鼠RAW264.7細(xì)胞中煙曲霉菌刺激引起的IL-1β基因及蛋白表達(dá)升高。提示SAN可能通過抑制IL-1β的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。炎癥因子TNF-α、IL-6及趨化因子MCP-1為反映角膜炎癥的重要指標(biāo)，TNF-α、IL-6和MCP-1的表達(dá)升高可以介導(dǎo)白細(xì)胞募集和巨噬細(xì)胞遷移及浸潤^[28]。LIN等^[29]研究顯示，在吲哚美辛誘導(dǎo)的大鼠腸道炎癥模型中，SAN可以通過降低大鼠腸道組織中TNF-α和IL-6的水平發(fā)揮抑炎作用。有研究顯示，在LPS刺激的人單核細(xì)胞白血病THP-1細(xì)胞系中，SAN可以通過下調(diào)炎癥遞質(zhì)IL-1β、MCP-1和IL-6的基因表達(dá)發(fā)揮保護(hù)作用^[30]。本文實驗結(jié)果顯示，SAN能顯著減少煙曲霉菌刺激的小鼠巨噬細(xì)胞中IL-6、TNF-α和MCP-1的表達(dá)。另有研究顯示，在真菌感染宿主后，宿主體內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞等會迅速誘導(dǎo)COX-2的表達(dá)增加，導(dǎo)致下游的抑炎因子表達(dá)被抑制，對角膜炎的預(yù)后造成不利影響^[31]。本文對真菌性角膜炎小鼠模型研究顯示，SAN能顯著下調(diào)COX-2及TNF-α的表達(dá)。LI等^[19]研究顯示，在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型中，SAN通過抑制COX-2的表達(dá)抑制炎癥細(xì)胞因子的釋放，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)，降低急性肺損傷小鼠的致死率。本文研究結(jié)果與其相一致。因此，應(yīng)用SAN治療也可以通過減輕真菌性角膜炎中炎癥遞質(zhì)的過度表達(dá)，從而改善真菌性角膜炎的預(yù)后。

綜上所述，SAN可以通過減少炎癥細(xì)胞的浸潤和下調(diào)炎癥遞質(zhì)的表達(dá)，減輕小鼠角膜煙曲霉菌感染后的炎癥反應(yīng)，有望成為治療真菌性角膜炎的新型藥物。但SAN在真菌性角膜炎中的具體抗炎機制還需要進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1]RATITONG B， PEARLMAN E. Pathogenic Aspergillus and Fusarium as important causes of blinding corneal infections-the role of neutrophils in fungal killing， tissue damage and cytokine production[J]. Current Opinion in Microbiology， 2021，63：195-203.

[2]SAHAY P， SINGHAL D， NAGPAL R， et al. Pharmacologic therapy of mycotic keratitis[J]. Survey of Ophthalmology， 2019，64（3）：380-400.

[3]GAZIANO R， MORONI G， BU C， et al. Antitumor effects of the benzophenanthridine alkaloid sanguinarine： evidence and perspectives[J]. World Journal of Gastrointestinal Oncology， 2016，8（1）：30-39.

[4]ZHONG H， HU D D， HU G H， et al. Activity of sanguinarine against Candida albicans biofilms[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy， 2017，61（5）：e02259-e02216.

[5]LI B， LUO Y B， ZHOU Y X， et al. Role of sanguinarine in regulating immunosuppression in a Lewis lung cancer mouse model[J]. International Immunopharmacology， 2022，110：108964.

[6]MESSEHA S S， ZARMOUH N O， ANTONIE L， et al. Sanguinarine inhibition of TNF-α-induced CCL2， IKBKE/NF-κB/ERK1/2 signaling pathway， and cell migration in human triple-negative breast cancer cells[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23（15）：8329.

[7]ANJAGO W M， ZENG W L， CHEN Y X， et al. The molecular mechanism underlying pathogenicity inhibition by sanguinarine in Magnaporthe oryzae[J]. Pest Management Science， 2021，77（10）：4669-4679.

[8]FU Y T， LIU W T， LIU M， et al. In vitro anti-biofilm efficacy of sanguinarine against carbapenem-resistant Serratia mar-cescens[J]. Biofouling， 2021，37（3）：341-351.

[9]YU C， LI P， WANG Y X， et al. Sanguinarine attenuates neuropathic pain by inhibiting P38 MAPK activated neuroinflammation in rat model[J]. Drug Design， Development and The-rapy， 2020，14：4725-4733.

[10]LIU X， YOU J， PENG X D， et al. Mammalian Ste20-like kinase 4 inhibits the inflammatory response in Aspergillus fumigatus keratitis[J]. International Immunopharmacology， 2020，88：107021.

[11]TONG J B， DUAN Z M， ZENG R， et al. miR-146a negatively regulates Aspergillus fumigatus-induced TNF-α and IL-6 secretion in THP-1 macrophages[J]. Mycopathologia， 2021，186（3）：341-354.

[12]LUAN J J， PENG X D， LIN J， et al. The therapeutic potential of chondroitin sulfate in Aspergillus fumigatus keratitis[J]. Molecular Immunology， 2022，147：50-61.

[13]MA S Q， WANG Q， XU Q， HE M T， LIN J. Protective effect of hinokitiol against aspergillus fumigatus keratitis and related mechanism[J]. Journal of Precision Medicine， 2022，37（6）：490-498.

[14]MAHMOUDI S， MASOOMI A， AHMADIKIA K， et al. Fungal keratitis： an overview of clinical and laboratory aspects[J]. Mycoses， 2018，61（12）：916-930.

[15]CHEUNG N N， CHENG Y Y Y， VAN DUINEN S G， et al. Contact lens-related fungal keratitis[J]. The Lancet Infectious Diseases， 2020， 20（9）：1100.

[16]FAN Y Q， LI C， PENG X D， et al. Perillaldehyde ameliorates Aspergillus fumigatus keratitis by activating the Nrf2/HO-1 signaling pathway and inhibiting dectin-1-mediated inflammation[J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science， 2020，61（6）：51.

[17]BROWN L， LECK A K， GICHANGI M， et al. The global incidence and diagnosis of fungal keratitis[J]. The Lancet Infectious Diseases， 2021， 21（3）：e49-e57.

[18]NIU X F， FAN T， LI W F， et al. The anti-inflammatory effects of sanguinarine and its modulation of inflammatory mediators from peritoneal macrophages[J]. European Journal of Pharmacology， 2012，689（1-3）：262-269.

[19]LI W F， LI H N， MU Q L， et al. Protective effect of sanguinarine on LPS-induced endotoxic shock in mice and its effect on LPS-induced COX-2 expression and COX-2 associated PGE2 release from peritoneal macrophages[J]. International Immunopharmacology， 2014， 22（2）：311-317.

[20]HUANG H B， YAO J Y， LIU K， et al. Sanguinarine has anthelmintic activity against the enteral and parenteral phases of trichinella infection in experimentally infected mice[J]. Acta Tropica， 2020， 201：105226.

[21]CUI Y J， LUO Y B， QIAN Q H， et al. Sanguinarine regulates tumor-associated macrophages to prevent lung cancer angiogenesis through the WNT/β-catenin pathway[J]. Frontiers in Oncology， 2022，12：732860.

[22]MENG Y Y， LIU Y， HU Z F， et al. Sanguinarine attenuates lipopolysaccharide-induced inflammation and apoptosis by inhibiting the TLR4/NF-κB pathway in H9c2 cardiomyocytes[J]. Current Medical Science， 2018，38（2）：204-211.

[23]ZHU Y N， PENG X D， ZHANG Y X， et al. Baicalein protects against Aspergillus fumigatus keratitis by reducing fungal load and inhibiting TSLP-induced inflammatory response[J]. Investigative Ophthalmology & Visual Science， 2021，62（6）：26.

[24]ZHENG Z J， ZHENG Y H， LIANG X B， et al. Sanguinarine enhances the integrity of the blood-milk barrier and inhibits oxidative stress in lipopolysaccharide-stimulated mastitis[J]. Cells， 2022，11（22）：3658.

[25]YANG H， WANG Q， HAN L， et al. Nerolidol inhibits the LOX-1/IL-1β signaling to protect against the Aspergillus fumigatus keratitis inflammation damage to the cornea[J]. International Immunopharmacology， 2020，80：106118.

[26]THWE P M， FRITZ D I， SNYDER J P， et al. Syk-dependent glycolytic reprogramming in dendritic cells regulates IL-1β production to β-glucan ligands in a TLR-independent manner[J]. Journal of Leukocyte Biology， 2019，106（6）：1325-1335.

[27]LI X D， WU X， WANG Q， et al. Sanguinarine ameliorates DSS induced ulcerative colitis by inhibiting NLRP3 inflammasome activation and modulating intestinal microbiota in C57BL/6 mice[J]. Phytomedicine： International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology， 2022，106：154394.

[28]TACKE F. Targeting hepatic macrophages to treat liver diseases[J]. Journal of Hepatology， 2017，66（6）：1300-1312.

[29]LIN X L， SHI Y N， CAO Y L， et al. Sanguinarine protects against indomethacin-induced small intestine injury in rats by regulating the Nrf2/NF-κB pathways[J]. Frontiers in Pharmacology， 2022，13：960140.

[30]P?N??KOV?K， KOLL?R P， M?LLER Z?VALOV? V， et al. Investigation of sanguinarine and chelerythrine effects on LPS-induced inflammatory gene expression in THP-1 cell line[J]. Phytomedicine： International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology， 2012，19（10）：890-895.

[31]LI N， CHE C Y， HU L T， et al. Effects of COX-2 inhibitor NS-398 on IL-10 expression in rat fungal keratitis[J]. International Journal of Ophthalmology， 2011，4（2）：165-169.

（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）