桃葉珊瑚苷在煙曲霉菌角膜炎中抗炎作用及其機(jī)制

刁瑋琳 尹敏 李翠

[摘要] 目的 探討桃葉珊瑚苷（AU）對煙曲霉菌角膜炎的抗炎作用及其機(jī)制。方法 采用CCK-8實驗檢測AU對人角膜上皮細(xì)胞（HCECs）的細(xì)胞毒性，裂隙燈拍照和臨床評分評估AU對煙曲霉菌角膜炎的治療效果，髓過氧化物酶（MPO）實驗和免疫熒光染色檢查中性粒細(xì)胞浸潤和活性，RT-PCR、Western blot和ELISA方法檢測重組與合成蛋白（Nrf2）、血紅素氧合酶-1（HO-1）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）以及白細(xì)胞介素-6（IL-6）的表達(dá)。結(jié)果AU降低了感染第3天的小鼠角膜臨床評分（F=35.714，P<0.001），抑制了中性粒細(xì)胞的募集和活性（t=9.882，P<0.001），同時也下調(diào)了IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)（F=59.356、110.224，P<0.001）。體外實驗顯示，AU明顯上調(diào)煙曲霉菌刺激的Nrf2、HO-1的mRNA和蛋白表達(dá)，下調(diào)IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)及IL-6的蛋白表達(dá)（F=17.569～146.436，P<0.001）。結(jié)論 AU能夠改善煙曲霉菌角膜炎嚴(yán)重程度，抑制中性粒細(xì)胞募集和活性，上調(diào)Nrf2和HO-1表達(dá)，抑制下游炎癥因子表達(dá)，在煙曲霉菌角膜炎中起抗炎作用。

[關(guān)鍵詞] 桃葉珊瑚苷；煙曲霉菌；炎癥；角膜炎

[中圖分類號] R772.22;R285.5

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2023）04-0501-06

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.118

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.r.20230920.0937.006;2023-09-21 16：17：53

ANTI-INFLAMMATORY EFFECT OF AUCUBIN IN ASPERGILLUS FUMIGATUS KERATITIS AND ITS MECHANISM OF ACTION DIAO Weilin， YIN Min， LI Cui （Department of Ophthalmology， TheAffiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）＼; [ABSTRACT] Objective To investigate the anti-inflammatory effect of aucubin （AU） in Aspergillus fumigatus keratitis and its mechanism of action. Methods The cytotoxicity of AU to human corneal epithelial cells （HCECs） was determined using Cell Counting Kit-8. The therapeutic effect of AU for Aspergillus fumigatus keratitis was assessed by slit lamp photography and clinical scoring. Neutrophil infiltration and activity were examined by myeloperoxidase assay and immunofluorescence staining. The expression of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）， heme oxygenase 1 （HO-1）， interleukin-1β （IL-1β）， and interleukin-6 （IL-6） was measured by RT-PCR， Western blot， and enzyme-linked immunosorbent assay. Results On the third day of infection， AU significantly decreased the clinical corneal score （F=35.714，P<0.001）， significantly inhibited neutrophil recruitment and activity （t=9.882，P<0.001）， and significantly downregulated the mRNA expression of IL-1β and IL-6 （F=59.356，110.224，P<0.001）. In-vitro experiments showed that AU significantly upregulated the mRNA and protein expression of Nrf2 and HO-1， and significantly downregulated the mRNA expression of IL-1β and IL-6 and the protein expression of IL-6 （F=17.569-146.436，P<0.001） in the presence of Aspergillus fumigatus stimulation. Conclusion AU can reduce the severity of Aspergillus fumigatus keratitis through anti-inflammatory mechanisms that inhibit the recruitment and activity of neutrophils， upregulate the expression of Nrf2 and HO-1， and suppress the expression of downstream inflammatory factors.

[KEY WORDS] aucubin; Aspergillus fumigatus; inflammation; keratitis

真菌性角膜炎是最嚴(yán)重的感染性角膜病之一，其發(fā)病率持續(xù)上升^[1]。煙曲霉菌（AF）是角膜感染的主要真菌病原體，角膜上皮損傷是角膜炎的關(guān)鍵誘發(fā)因素^[2]。真菌侵入角膜基質(zhì)層時誘發(fā)的免疫反應(yīng)導(dǎo)致進(jìn)一步的組織損傷^[3]。桃葉珊瑚苷（AU）存在于許多天然植物中^[4]，具有廣泛的藥理學(xué)特性，如抗炎、抗菌、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)以及抗纖維化等作用^[5-9]。研究顯示，AU能夠降低干眼癥小鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）等炎癥因子表達(dá)預(yù)防角膜上皮損傷^[10]，AU通過TOLL樣受體4/髓樣分化因子88/人核因子κB抑制蛋白α/核因子κB信號通路抑制脊髓損傷模型中的炎癥，從而促進(jìn)神經(jīng)元功能恢復(fù)^[11]；AU通過抑制肌醇依賴酶1α/硫氧還蛋白互作蛋白信號通路緩解炎癥反應(yīng)，從而延緩2型糖尿病誘導(dǎo)的肝纖維化發(fā)展^[12]。因此，AU具有抗炎潛力并且可能成為治療真菌性角膜炎的藥物。本研究探討AU對AF誘導(dǎo)的真菌性角膜炎炎癥反應(yīng)的作用。

1 材料和方法

1.1 真菌制備

AF標(biāo)準(zhǔn)菌株（菌株3.0772，中國微生物中心）于固體瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，振蕩研磨后收集菌絲，以12 000 r/min離心15 min，用無菌PBS洗滌。將收集的活化菌絲用于動物實驗;用體積分?jǐn)?shù)0.70乙醇處理滅活菌絲，并將濃度調(diào)整為3×10¹¹CFU/L用于細(xì)胞實驗。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與刺激

人角膜上皮細(xì)胞（HCECs）由中國福建廈門大學(xué)實驗室提供。將HCECs接種于6孔板或者12孔板之中，在含有胎牛血清的F12細(xì)胞培養(yǎng)液中37 ℃培養(yǎng)，至細(xì)胞生長密度達(dá)到80%，將細(xì)胞分為DMSO組、AU組、AF+DMSO組、AF+AU組，其中DMSO組與AU組分別加入含有體積分?jǐn)?shù)0.005 DMSO和20 mg/L AU的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；AF+DMSO組與AF+AU組分別加入體積分?jǐn)?shù)0.005 DMSO和20 mg/L的AU預(yù)處理2 h后，加入滅活菌絲。收集菌絲刺激8 h后的細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR，收集刺激24 h的細(xì)胞進(jìn)行Western blot和ELISA檢測。

1.3 檢測指標(biāo)及方法

1.3.1 藥物細(xì)胞毒性評估 將HCECs接種于96孔板中，分別加入含有不同濃度AU（5、10、20、40、80、160、320 mg/L）細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃下培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8試劑（Solarbio，中國北京）后培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處吸光度值，以其評估各組細(xì)胞存活率。

1.3.2 小鼠AF角膜炎模型的建立及AU對其作用健康8周齡雌性C57BL/6小鼠購自濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司，所有治療均符合視覺與眼科研究協(xié)會關(guān)于在眼科和視覺研究中使用動物的聲明要求。在正常小鼠右眼中分別滴入體積分?jǐn)?shù)0.005的DMSO（DMSO組）以及20 mg/L的AU（AU組）5 μL，每天2次。選取小鼠的右眼作為實驗眼，80 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉后刮取小鼠右眼中央2 mm角膜上皮，在眼表面涂抹AF（5 μL，3×10¹¹CFU/L），放置軟接觸鏡后縫合眼瞼24 h以形成潰瘍。眼瞼縫線拆除后，分別將體積分?jǐn)?shù)0.005的DMSO及20 mg/L AU 5 μL滴入小鼠結(jié)膜囊，每天2次，分別作為AF+DMSO組及AF+AU組。感染后第1天和第3天，裂隙燈下觀察小鼠角膜炎嚴(yán)重程度，參考相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行臨床評分評估角膜炎嚴(yán)重程度^[13]，根據(jù)潰瘍面積、混濁程度和潰瘍形態(tài)分為Ⅰ～Ⅳ級，分別對應(yīng)1～4分。臨床評分總分為3項觀察指標(biāo)分?jǐn)?shù)相加，總分0～5為輕度感染，6～9為中度感染，10～12為嚴(yán)重感染。收集各組小鼠角膜用于實時熒光定量PCR（RT-PCR）、Western blot、ELISA和髓過氧化物酶（MPO）實驗，收集小鼠眼球用于免疫熒光染色。

1.3.3 RT-PCR檢測相關(guān)受體與炎癥因子mRNA表達(dá) 使用RNAiso Plus試劑盒（Takara，大連，中國）從滅活A(yù)F菌絲刺激8 h后的HCECs或小鼠角膜中提取總RNA，使用Prime Script RT試劑盒（Takara，大連，中國）將RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用RT-PCR儀器（Eppendorf公司，德國）進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系：目的基因上、下游引物各0.5 μL，SYBR 10.0 μL，樣本cDNA 2.0 μL，滅菌DEPC水7.0 μL。根據(jù)循環(huán)數(shù)計算基因的相對表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)參照，分別檢測重組與合成蛋白（Nrf2）、血紅素氧合酶-1（HO-1）、IL-1β以及白細(xì)胞介素-6（IL-6）mRNA表達(dá)。PCR引物及其序列見表1。

1.3.4 Western blot檢測Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)用比例為98∶1∶1的RIPA緩沖液、PMSF和磷酸酶抑制劑的混合液裂解細(xì)胞蛋白，BCA蛋白濃度測定試劑盒（Solarbio，中國北京）測定蛋白質(zhì)的濃度后，應(yīng)用體積分?jǐn)?shù)0.10 SDS-PAGE分離總蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用封閉液（beyotime，中國北京）封閉膜，并將膜分別浸泡于一抗Nrf2（1∶1 000， CST）、HO-1（1∶20 000， Abcam）、β-actin（1∶1 000， Elabscience）和 β-tubulin（1∶1 000， Elabscience）中4 ℃孵育過夜，用PBST洗滌3次后，將膜與相應(yīng)的二抗（1∶1 000， Elabscience）37 ℃下孵育1 h，于UVP（VILBER LOURM，美國）下顯像并拍照。應(yīng)用Image J軟件分析各組蛋白條帶的灰度值，以其表示蛋白表達(dá)水平。

1.3.5 ELISA方法檢測IL-1β、IL-6蛋白表達(dá) 滅活A(yù)F菌絲刺激HCECs 24 h，離心并收集細(xì)胞上清液，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測IL-1β、IL-6蛋白表達(dá)水平，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。使用酶標(biāo)儀檢測450 nm和570 nm波長處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線計算各組樣本蛋白表達(dá)濃度。

1.3.6 免疫熒光染色檢測AU對中性粒細(xì)胞募集的影響 收集小鼠感染第3天的眼球置于OCT包埋劑中液氮冷凍，-25 ℃下切成8 μm厚的連續(xù)切片，4 ℃下用丙酮固定5 min。加入山羊血清（1∶100，Solarbio）封閉30 min后，在4 ℃下用NIMP-R14（1∶100，Santa Cruz Biotechnology Company）孵育樣本過夜。加入相應(yīng)的二抗（1∶200，Elabscience）避光孵育1 h，DAPI染色10 min。熒光顯微鏡（Zeiss Axio Vert，放大倍數(shù)400倍）觀察并拍照，觀察樣本中性粒細(xì)胞的定位。

1.3.7 MPO實驗檢測中性粒細(xì)胞MPO活性 收集小鼠感染第3天角膜，應(yīng)用MPO試劑盒（南京建成生物工程研究所，中國江蘇）檢測各組樣本MPO活性，按試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。在37 ℃下用酶標(biāo)儀測量460 nm處吸光度值，以其作為MPO活性結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料數(shù)據(jù)以±s表示，多組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析、雙因素析因方差分析或重復(fù)測量設(shè)計方差分析，兩兩比較采用Bonferroni檢驗；兩組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AU對細(xì)胞的毒性評估

CCK-8實驗顯示，各處理組之間HCECs存活率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=11.696，P<0.05）。濃度為80、160、320 mg/L的AU處理降低了HCECs存活率（P<0.05），濃度≤40 mg/L的AU處理對HCECs存活率無影響（P>0.05）。見表2。

2.2 AU對AF性角膜炎的嚴(yán)重程度和中性粒細(xì)胞的影響

裂隙燈觀察顯示，與AF+DMSO組相比，感染第3天AF+AU組小鼠角膜潰瘍面積減少，混濁程度減輕（圖1A～D）。重復(fù)測量設(shè)計方差分析顯示，時間、組別、時間與組別的交互作用對臨床評分均有影響（F_時間=91.207，F(xiàn)_分組=16.200，F(xiàn)_{時間×分組}=20.862，P<0.01）。單獨效應(yīng)分析顯示，感染第1天AF+AU組與AF+DMSO組臨床評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.385，P>0.05）；感染第3天AF+AU組臨床評分較AF+DMSO組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=35.714，P<0.001）；感染第3天AF+DMSO組、AF+AU組小鼠臨床評分與第1天相比均明顯提高（F=99.655、12.414，P<0.01）。見表3。免疫熒光染色檢測顯示，AF+AU組小鼠角膜中性粒細(xì)胞浸潤少于AF+DMSO組（圖1E～J）。MPO實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過AU處理后小鼠角膜中性粒細(xì)胞活性小于AF+DMSO組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.882，P<0.001）。見表3。

2.3 AU對小鼠AF角膜炎中炎癥相關(guān)因子IL-1β、IL-6 mRNA表達(dá)的影響

析因設(shè)計方差分析顯示，AU處理、AF處理、AU與AF處理的交互作用對IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)均有影響（F_AU=23.154、34.673，F(xiàn)_AF=41.883、82.697，F(xiàn)_AU×AF=23.173、34.942，P均<0.001）。單獨效應(yīng)分析顯示，不用AF處理時，AU處理與不處理的小鼠炎癥因子IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；不用AU處理時，AF處理與不處理相比IL-1β和IL-6mRNA表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=57.595、128.336，P<0.001）；用AF處理時，感染第3天時AU處理與不處理相比小鼠角膜IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)明顯下降，差異有顯著性（F=59.356、110.224，P<0.001）；用AU處理時，AF處理與不處理相比小鼠IL-1β mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=4.511，P<0.05），IL-6 mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表4。

2.4 AU對HCECs中AF誘導(dǎo)的炎癥的影響

析因設(shè)計方差分析顯示，AU處理、AF處理、AU與AF處理的交互作用對Nrf2、HO-1、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)均有影響（F_AU=9.111～60.965，F(xiàn)_AF=84.676～673.934，F(xiàn)_AU×AF=9.295～47.024，P<0.01）。單獨效應(yīng)分析顯示，不用AF處理時，AU處理與不處理Nrf2、HO-1、IL-1β和IL-6 mRNA差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；不用AU處理時，AF處理與不處理相比上述受體和炎癥因子的mRNA表達(dá)明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=19.877～538.499，P<0.001）；用AF處理時，AU處理與不處理相比Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)明顯上升，IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平明顯下降（F=17.569～103.117，P<0.001）；用AU處理時，AF處理與不處理相比Nrf2、HO-1、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=71.630～431.986，P<0.001）。見表5。

析因設(shè)計方差分析顯示，AU處理、AF處理、AU與AF處理的交互作用對Nrf2、HO-1和IL-6蛋白表達(dá)均有影響（F_AU=61.030～95.257，F(xiàn)_AF=106.921～663.812，F(xiàn)_AU×AF=48.953～69.333，P<0.01）。單獨效應(yīng)分析顯示，不用AF處理時，AU處理與不處理相比Nrf2、HO-1和IL-6蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；不用AU處理時， AF處理與不處理相比上述受體和炎癥因子蛋白表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=69.637～169.483，P<0.001）；用AF處理時，AU處理與不處理相比，AU處理上調(diào)了Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)，下調(diào)了IL-6蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=109.650～146.436，P<0.001）；用AU處理時，AF處理與不處理相比Nrf2、HO-1、IL-6蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=5.590～548.402，P<0.05）。見表6。

3 討論

真菌性角膜炎是一種具有高致盲率的嚴(yán)重角膜感染性疾病^[14]。宿主炎癥反應(yīng)是角膜病變破壞的重要原因之一^[15]。過度免疫反應(yīng)會導(dǎo)致角膜混濁，甚至發(fā)生角膜穿孔威脅視力^[3]。AU是一種來源于傳統(tǒng)草藥的環(huán)烯醚萜苷，是一種具有豐富潛在來源、良好安全性和眾多有益生物活性的化合物，具有很高的潛在應(yīng)用價值。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過AU處理的感染第3天小鼠角膜潰瘍面積減小，角膜透明度提高，臨床評分降低，提示AU對真菌性角膜炎起到保護(hù)作用。炎癥細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞浸潤角膜是角膜炎結(jié)局的主要決定因素^[16]。MPO是一種含陽離子血紅素的酶，存在于中性粒細(xì)胞中，炎癥激活的中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥因子和MPO的釋放，進(jìn)一步引起炎癥部位組織損傷，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的視力損害^[17-18]。既往研究表明，中性粒細(xì)胞增多會導(dǎo)致銅綠假單胞菌角膜炎不可逆的角膜組織破壞^[19]。本研究結(jié)果顯示，AU顯著減輕了AF角膜炎中性粒細(xì)胞浸潤程度，抑制了MPO的活性。既往研究顯示，AU能夠使LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷的肺組織病理損傷評分和中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著降低，從而減輕炎癥反應(yīng)^[20]。本文研究結(jié)果與其一致。推斷AU通過抑制中性粒細(xì)胞募集從而在AF角膜炎中發(fā)揮抗炎作用。

本文研究還探究了AU對AF誘導(dǎo)的小鼠角膜和HCECs炎癥中炎癥因子表達(dá)的影響。白細(xì)胞介素-1家族（IL-1家族）的細(xì)胞因子和受體在炎癥中的作用是眾所周知的。其中IL-1β的產(chǎn)生與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，其在自身免疫性和慢性炎癥中發(fā)揮作用^[21]。IL-6是先天免疫的關(guān)鍵細(xì)胞因子，其具有與宿主防御、免疫細(xì)胞調(diào)節(jié)、增殖和分化相關(guān)的廣泛的生理功能^[22]。本文研究結(jié)果顯示，AF刺激能夠使HCECs和小鼠角膜中的IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達(dá)上升，而AU能夠下調(diào)這些炎癥因子表達(dá)。有研究結(jié)果顯示，AU能夠降低LPS誘導(dǎo)的牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞炎癥中IL-1β、IL-6的表達(dá)^[23]。本文研究結(jié)果與其相一致。真菌細(xì)胞壁的主要組成部分葡聚糖是宿主細(xì)胞識別的主要病原相關(guān)分子模式^[24]。研究表明，真菌β-葡聚糖通過Nrf2途徑誘導(dǎo)口腔角質(zhì)細(xì)胞中HO-1的表達(dá)，在宿主防御口腔上皮念珠菌感染引起的應(yīng)激方面發(fā)揮重要作用^[25]。另有研究結(jié)果表明，在高葡萄糖誘導(dǎo)的糖尿病視網(wǎng)膜病變的細(xì)胞模型中，Nrf2/HO-1通路的激活可以保護(hù)人視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞免受高葡萄糖誘導(dǎo)的炎癥損傷^[26]。Nrf2和HO-1的激活能夠下調(diào)炎癥因子水平，從而抑制真菌性角膜炎的炎癥反應(yīng)。本文研究結(jié)果顯示，AU能夠顯著上調(diào)AF誘導(dǎo)的HCECs中Nrf2和HO-1的表達(dá)，提示AU可能通過Nrf2/HO-1通路下調(diào)炎癥因子的表達(dá)，從而在AF誘導(dǎo)的炎癥中發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，AU能夠抑制中性粒細(xì)胞募集，減輕AF角膜炎小鼠病情嚴(yán)重程度，下調(diào)體內(nèi)外炎癥因子IL-1β、IL-6的表達(dá)水平，并且AU預(yù)處理能夠激活模式識別受體Nrf2和HO-1表達(dá)，提示AU可能通過Nrf2/HO-1通路在AF誘導(dǎo)的炎癥過程中發(fā)揮抗炎作用。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）