特發(fā)性癲癇患者外周血差異表達miRNA 分析

仲婷，景燕，陸明佳，黨輝，李紅燕

癲癇是大腦神經(jīng)元突發(fā)性異常放電，造成大腦功能短暫性障礙的一種慢性病。流行病學調查顯示，全球約有5 000萬癲癇患者，其中我國癲癇患者約占18%，且新發(fā)患者數(shù)量正以每年40萬～60萬的速度增長［1］。研究證實，癲癇長期反復發(fā)作可改變腦白質結構，造成不同類型及程度的認知功能損傷，尤其在記憶、語言、執(zhí)行、情緒等方面，而上述任何一種認知功能損傷均可對機體造成不可逆的影響［2］。目前，常規(guī)抗癲癇藥物只可控制2/3患者的病情，尚不能從根本上改變患者的病理生理狀態(tài)［3］。此外，雖然分子生物學及基因測序技術不斷進步，但特發(fā)性癲癇的致病基因尚未被明確［4］。miRNA是一種小型類似siRNA的分子，由高等真核生物基因組編碼，其可通過與靶基因mRNA堿基配對并引導沉默復合體降解mRNA或阻礙mRNA翻譯而發(fā)揮基因調控作用［5］。而通過分析特發(fā)性癲癇患者外周血中差異表達miRNA來尋找其生物標志物，對早期診斷和治療特發(fā)性癲癇十分重要。本研究旨在分析特發(fā)性癲癇患者外周血差異表達miRNA，以期為特發(fā)性癲癇治療靶點的選擇提供理論基礎。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2019年1月至2020年1月在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內科治療的特發(fā)性癲癇患者12例為病例組。納入標準：（1）符合特發(fā)性癲癇的診斷標準［6］：發(fā)作期間腦電波顯示全身性棘波活動，并伴有失神、肌肉震顫、陣發(fā)性強直等表現(xiàn)；（2）年齡18～36歲；（3）對本研究知情同意。排除標準：（1）顱腦MRI檢查顯示存在腦器質性、結構性病變者；（2）存在腦血管疾病、頭部創(chuàng)傷或顱腦手術史者；（3）合并其他神經(jīng)類、精神類疾病者；（4）合并其他內、外科疾病者。選取同期于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院門診進行體檢的健康者12例為對照組。納入標準：（1）體檢結果無明顯異常；（2）年齡18～36歲；（3）無癲癇家族史。兩組性別、年齡、受教育時間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。本研究已通過新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會審核批準（KY2019051562），所有受試者對本研究知情同意。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

表1 兩組一般資料比較Table 1 Comparison of general data between the two groups

1.2 研究方法

1.2.1 外周血采集 采集受試者清晨空腹靜脈血5 ml，1 000 r/min離心5 min（離心半徑124 mm）（離心機購自賽默飛世爾科技公司，型號：mySPINTM6 Mini Centrifuge），取血漿并低溫保存。

1.2.2 高通量測序 委托新疆康智睿生物醫(yī)學技術服務有限公司協(xié)助完成血漿高通量測序。采用Trizol法提取血漿樣本中的總RNA，在分光光度計230、260、280 nm波長下測定RNA吸光度，并計算RNA濃度；采用瓊脂糖凝膠電泳確定樣品RNA純度及完整性；采用NanoDrop ND-1000定量樣品中總RNA質量［7］。取1 μg總RNA并使用T4 RNA連接酶進行催化，使用連接酶分別連接3'端及5'端miRNA測序接頭，將隨機引物反轉為第一鏈cDNA；采用RT-PCR（PCR 11～12個循環(huán)）擴增，采用變性聚丙烯酰胺凝膠（1.0 mm，10孔，購自賽默飛世爾科技公司，貨號：EC68752BOX）進行電泳純化，生成sRNA文庫，采用Picogreen熒光染料法（微型熒光儀購自北京原平皓生物技術有限公司，型號：TBS380）對sRNA的質量進行定量分析；采用Illumina cBot簇生成系統(tǒng)進行橋式PCR擴增，生成克隆簇；采用Illumina HiSeq 2000測序儀按照TruSeq Rapid Small RNA cluster試劑盒說明書進行高通量測序，獲得原始序列數(shù)據(jù)和樣品待分析數(shù)據(jù)。除去sRNA序列接頭及低質量（原始序列中堿基的測序質量值＞30的堿基占總堿基的百分比＞80%、接頭污染比例≤1%、有效序列長度≥50 bp、數(shù)據(jù)的有效比對率＞70%）的序列，保留長度≥18 nt的序列讀數(shù)。

1.2.3 差異表達miRNA篩選 采用Off-LineBasecaller軟件分析并讀取堿基序列，將原始序列數(shù)據(jù)處理后，獲取高通量測序發(fā)現(xiàn)的miRNA的豐度信息。采用edgeR軟件篩選差異表達miRNA，其篩選條件為|log2FC|≥1且P＜0.05；選取差異倍數(shù)最大的5位差異表達miRNA。

1.2.4 差異表達miRNA表達水平檢測 采用qPCR檢測差異表達miRNA表達水平。采用PrimerPremier 5.0軟件并根據(jù)目標miRNA或基因進行引物設計（見表1）。將混合液（反轉錄buffer 2.0 μl+上游引物0.2 μl+下游引物0.2 μl+脫氧核糖核苷酸三磷酸 0.1 μl）置于70 ℃干熱浴器中3 min，取出后立刻進行冰水浴，冷卻至室溫；加入莫洛尼鼠白血病病毒反轉錄酶0.5 μl，37 ℃水浴60 min；隨后立即95 ℃干熱浴3 min，置于-80 ℃冰箱待測。配置PCR溶液：SYBR Green 1染料10 μl+上游引物1 μl+下游引物1 μl+dNTP 1 μl+Taq聚合酶2 μl+待測樣品cDNA 5 μl+雙蒸水30 μl，將上述試劑混合后以6 000 r/min離心10 min（離心半徑6 cm）。將配置好的PCR溶液置于RT-PCR儀上進行PCR擴增。PCR條件：93 ℃預變性2 min，后按照93 ℃ 1 min、55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min進行40個循環(huán)，72 ℃延伸7 min。同時繪制目標miRNA或基因的擴增曲線和熔解曲線以檢驗差異表達miRNA的引物特異性。使用2-ΔΔCt法計算差異表達miRNA表達水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)采用Excel錄入，采用GraphPad Prism 7.00軟件包進行數(shù)據(jù)分析及制圖。計量資料以（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以相對數(shù)表示。雙側檢驗水準：α=0.05。

2 結果

2.1 高通量測序結果 共完成2 4 個樣本測序。各樣本原始序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結果顯示，原始序列數(shù)據(jù)為10 811 542～14 865 039個，原始測序量（堿基數(shù)目）為810 865 650～1 094 213 755個，誤差率為0.026 1%～0.0 3 5 1%，原始序列中堿基的測序質量值＞2 0 的堿基占總堿基的百分比為9 2.5 6%～9 7.3 2%，原始序列中堿基的測序質量值＞3 0 的堿基占總堿基的百分比為8 8.0 1%～9 3.5 0%，堿基G 和C 的數(shù)量總和占總堿基數(shù)量的百分比為4 5.2 9%～5 2.0 9%。各樣本樣品待分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結果顯示，樣品待分析數(shù)據(jù)為10 714 978～14 226 434個，過濾后得到的測序量（堿基數(shù)目）為231 280 458～305 545 866個，誤差率為0.022 5%～0.032 0%，原始序列中堿基的測序質量值＞20的堿基占總堿基的百分比為95.87%～98.85%，原始序列中堿基的測序質量值＞30的堿基占總堿基的百分比為95.30%～96.85%，堿基G和C的數(shù)量總和占總堿基數(shù)量的百分比為40.38%～47.58%，見表2。

表2 兩組原始序列數(shù)據(jù)、樣品待分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析Table 2 Statistical analysis of raw reads and clean reads of the two groups

2.2 差異表達miRNA篩選結果 共檢測出146個差異表達miRNA，與對照組相比，研究組共有98個miRNA表達上調，48個miRNA表達下調；其中差異倍數(shù)最大的5個差異表達miRNA分別為hsa-let-7b-3p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-6810-3p，見表3。

表3 5位差異倍數(shù)最大的差異表達miRNATable 3 Five differentially expressed miRNA with the largest multiples of difference

2.3 差異表達miRNA表達水平檢測結果 擴增曲線分析結果顯示，樣本均經(jīng)歷了良好的擴增過程，見圖1。熔解曲線分析結果顯示，大多數(shù)曲線為單峰，見圖2。病例組hsa-let-7b-3p、hsa-miR-92a-1-5p表達水平低于對照組，hsa-miR-6810-3p表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；兩組hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-219a-2-3p表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表4。

圖1 差異表達miRNA的擴增曲線Figure 1 Amplification curve of differentially expressed miRNA

圖2 差異表達miRNA的熔解曲線Figure 2 Fusion curve of differentially expressed miRNA

表4 兩組差異表達miRNA表達水平比較（±s）Table 4 Comparison of expression levels of differentially expressed miRNA between the two groups

表4 兩組差異表達miRNA表達水平比較（±s）Table 4 Comparison of expression levels of differentially expressed miRNA between the two groups

組別 例數(shù)hsa-let-7b-3p hsa-let-7f-1-3p hsa-miR-92a-1-5p hsa-miR-219a-2-3p hsa-miR-6810-3p對照組 121.08±0.341.02±0.20 1.02±0.19 1.03±0.31 1.12±0.21病例組 120.39±0.191.08±0.26 0.49±0.31 0.96±0.46 2.03±0.92 t值6.2750.7435.7120.4764.280 P值＜0.0010.465＜0.0010.639＜0.001

3 討論

研究指出，＞80%的人類基因在轉錄時會產(chǎn)生大量的miRNA等多種非編碼RNA，并通過影響靶基因轉錄、翻譯及蛋白質修飾等過程而影響后生動物的生物學過程［8-9］。其中miRNA在腦發(fā)育和神經(jīng)可塑性等方面發(fā)揮的作用已得到充分證實［10-12］。本研究旨在分析特發(fā)性癲癇患者外周血差異表達miRNA。

本研究各樣本原始序列數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結果顯示，原始序列中堿基的測序質量值＞20的堿基占總堿基的百分比為92.56%～97.32%，原始序列中堿基的測序質量值＞30的堿基占總堿基的百分比為88.01%～93.50%，堿基G和C的數(shù)量總和占總堿基數(shù)量的百分比為45.29%～52.09%；各樣本樣品待分析數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結果顯示，原始序列中堿基的測序質量值＞20的堿基占總堿基的百分比為95.87%～98.85%，原始序列中堿基的測序質量值＞30的堿基占總堿基的百分比為95.30%～96.85%，堿基G和C的數(shù)量總和占總堿基數(shù)量的百分比為40.38%～47.58%，提示測序樣本堿基分布比較均勻，可用于后續(xù)分析。

本研究結果顯示，共檢測出146個差異表達miRNA，與對照組相比，研究組共有98個miRNA表達上調，48個miRNA表達下調；其中差異倍數(shù)最大的5個差異表達miRNA分別為hsalet-7b-3p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-6810-3p。擴增曲線分析結果顯示，樣本均經(jīng)歷了良好的擴增過程；熔解曲線分析結果顯示，大多數(shù)曲線為單峰；說明檢測樣本的特異性和穩(wěn)定性比較好，且擴增產(chǎn)物純度和可靠性比較高。

文獻指出，cAMP反應元件結合蛋白（cAMP response element bindingprotein，CREB）對癲癇發(fā)生及持續(xù)狀態(tài)的調節(jié)作用可能與has-let-7b-3p有關；CREB可通過磷酸化轉為活性結構，進而啟動多種基因的轉錄，并通過多條途徑調控神經(jīng)元功能，從而促進神經(jīng)元興奮、發(fā)育和重塑［13-16］。本研究結果顯示，病例組has-let-7b-3p表達水平低于對照組，提示has-let-7b-3p在特發(fā)性癲癇患者中表達下調，且其可能在特發(fā)性癲癇的發(fā)病機制中發(fā)揮作用。has-miR-92a-1-5p是腦特異性miRNA，其可參與N-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受體信號傳導，調控哺乳動物腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其酪氨酸激酶的表達水平，從而影響大腦功能［17-18］。本研究結果顯示，病例組hsa-miR-92a-1-5p表達水平低于對照組，其原因尚不清楚，需要進一步研究分析。一項基因分型分析研究指出，miR-6810-3p可能參與突觸信號發(fā)生及傳導、神經(jīng)元分化及投射過程，且其與黃斑變性及神經(jīng)退行性疾病直接相關［19］。

本研究結果顯示，病例組hsa-miR-6810-3p表達水平高于對照組，提示hsa-miR-6810-3p表達水平升高可能與特發(fā)性癲癇有關，其有可能作為特發(fā)性癲癇的生物標志物。本研究結果還顯示，兩組hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-219a-2-3p表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義，分析原因可能與受試者的個體差異和本研究樣本量較小等因素有關，后期需設計同質化的前瞻性研究以進一步評估hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-219a-2-3p在特發(fā)性癲癇中的意義。

綜上所述，與健康人相比，特發(fā)性癲癇患者外周血共有98個miRNA表達上調，48個miRNA表達下調；其中差異倍數(shù)最大的5個差異表達miRNA分別為hsa-let-7b-3p、hsa-let-7f-1-3p、hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-219a-2-3p、hsa-miR-6810-3p，且可能只有hsa-let-7b-3p、hsa-miR-92a-1-5p、hsa-miR-6810-3p參與了特發(fā)性癲癇的發(fā)生發(fā)展。但本研究在發(fā)現(xiàn)差異表達miRNA后，并未做針對性的小鼠敲低實驗，不能提供其調控機制的完整證據(jù)鏈，期待后續(xù)研究增加基礎實驗以進一步深入探討。

作者貢獻：仲婷進行文章的構思與設計、文章的可行性分析、文獻/資料收集，撰寫論文；仲婷、景燕、陸明佳進行論文的修訂；黨輝、李紅燕負責文章的質量控制和審校；李紅燕對文章整體負責，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。