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    219份茶樹資源1,2,6-三沒食子酰葡萄糖變異分析

    2023-10-17 02:36:48荀涵碩王留彬王麗鴛
    茶葉通訊 2023年3期
    關(guān)鍵詞:嵊州酰基兒茶素

    荀涵碩,王留彬,張 睿,王麗鴛,韋 康

    中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所,浙江 杭州 310008

    水解單寧1,2,6-三沒食子酰葡萄糖(1,2,6-tri-O-galloyl-β-D-glucopyranose,1,2,6-TGGP)是一種多酚化合物,具有抗菌、消炎、抗氧化等作用[1-2]。然而目前對(duì)多酚類物質(zhì)的研究主要集中在兒茶素類物質(zhì)上,對(duì)1,2,6-TGGP的關(guān)注較少。茶是世界最受歡迎的飲料之一[3],具有多種保?。ㄋ幚恚┕δ躘4]。茶葉中富含多酚類化合物,研究人員已從茶樹中鑒定到1,2,6-TGGP,但是茶葉中關(guān)于1,2,6-TGGP含量變異范圍的研究報(bào)道非常少。Zhang等[5]通過高效液相色譜結(jié)合二極管陣列和質(zhì)譜檢測(cè)了16個(gè)茶樣(6個(gè)綠茶、6個(gè)烏龍茶和4個(gè)白茶),結(jié)果發(fā)現(xiàn)茶葉中1,2,6-TGGP含量非常低,在0~6.6 mg/g。Song等[6]通過高效液相色譜結(jié)合二極管陣列和質(zhì)譜對(duì)13批龍井綠茶進(jìn)行分析,也得到了類似的結(jié)果。Wei等[2]對(duì)17個(gè)茶樹品種進(jìn)行1,2,6-TGGP含量測(cè)定,發(fā)現(xiàn)其變化范圍為1.96~43.20 mg/g。李強(qiáng)等[7]對(duì)‘中黃1號(hào)’‘中黃2號(hào)’‘白雞冠’與‘中白1號(hào)’進(jìn)行1,2,6-TGGP含量測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)含量在0~0.24 mg/g。

    茶樹種質(zhì)資源是茶樹種質(zhì)創(chuàng)新及品種遺傳改良的基礎(chǔ)[8-9]。目前對(duì)茶樹資源的分析多集中在水浸出物、兒茶素、氨基酸、咖啡堿等成分,尚無對(duì)1,2,6-TGGP優(yōu)異資源鑒定與篩選的研究報(bào)道。本研究擬對(duì)219份茶樹資源進(jìn)行1,2,6-TGGP含量測(cè)定,分析其變異特性并探尋其與兒茶素類物質(zhì)的相關(guān)性,從而篩選出高1,2,6-TGGP優(yōu)異茶樹資源,以期為高1,2,6-TGGP茶樹新品種選育及其形成機(jī)理研究提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    以53份種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所茶園(N 30°19′、E 120°10′)的茶樹資源、166份種植于浙江省嵊州市中茶所嵊州實(shí)驗(yàn)基地(N 30°15′、E 121°22′)的茶樹資源為材料。2019年、2020年和2021年3月在不同地塊采摘試驗(yàn)茶樹資源一芽二葉鮮葉樣。具體樣品名稱見表1。其中編號(hào)1~21是杭州2019年樣品,22~32是杭州2020年樣品,33~53是杭州2021年樣品;編號(hào)54~110是嵊州2019年樣品,111~152是嵊州2020年樣品,153~219是嵊州2021年樣品。共計(jì)219份。

    表1 219份茶樹資源名稱Table 1 The names of the 219 tea germplasms

    1.2 主要儀器和試劑

    儀器:Waters HPLC,Phenomenex色譜柱(Synergi 4 μ Polar-RP 80A, 4.6 mm×250 mm,5 μm);UV-2550紫外可見分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司);Waters alliance 2695-2498高效液相色譜儀(美國Waters公司)。

    試劑:甲醇、乙腈、甲酸(杭州碩科儀器設(shè)備有限公司),均為色譜純級(jí);1,2,6-TGGP,由上海源葉生物科技有限公司提??;沒食子酸(GA)、沒食子兒茶素(GC)、表沒食子兒茶素(EGC)、兒茶素(C)、表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG),上海源葉生物科技有限公司;抗壞血酸、EDTA(Disodiumethylendiaminetetrac etate,乙二胺四乙酸)鈉鹽。

    1.3 方法

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

    分別精密稱取1,2,6-TGGP、GA、GC、EGC、C、EC、EGCG、GCG、ECG標(biāo)準(zhǔn)品2.000 mg置于10 mL離心管中,加入70%甲醇(色譜純級(jí))溶液2 mL超聲溶解,配成1 000 μg/mL的母液,再用70%甲醇溶液將對(duì)照品母液稀釋成系列梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)各代謝物進(jìn)行定量。

    1.3.2 HPLC檢測(cè)

    流動(dòng)相A為1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B為100%乙腈。流速為1 mL/min,檢測(cè)波長280 nm,柱溫40℃,進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫程序詳見表2。

    1.3.3 樣品制備

    于2019、2020、2021年春季按一芽二葉的標(biāo)準(zhǔn)采摘鮮葉原料,置于電熱式碧螺春烘干機(jī)中120℃烘30 min左右,烘干至恒重。

    1.3.4 茶多酚提取與鑒定

    多酚類物質(zhì)提取和鑒定在課題組前期建立的方法上略有改進(jìn):取茶樣0.1 g(0.999~0.100 3 g)精密稱定,置于10 mL離心管中,準(zhǔn)確加70%甲醇溶液5 mL,于70℃水浴鍋水浴浸提20 min(每隔5 min上下?lián)u動(dòng)一次),待冷卻至室溫后轉(zhuǎn)入離心機(jī)(3500 r/min,10 min)。吸取0.5 mL上清液至5 mL離心管中,加2 mL穩(wěn)定液(10 mg/mL EDTA-Na 2、10 mg/mL抗壞血酸、純乙腈、超純水的質(zhì)量比或體積比為1∶1∶2∶16混勻,使用0.45 μm有機(jī)微孔濾膜過濾,取濾液到進(jìn)樣瓶中,放至HPLC儀器中進(jìn)行1,2,6-TGGP鑒定與含量測(cè)定。

    1.3.5 數(shù)據(jù)處理

    數(shù)據(jù)采用Excel 2108軟件進(jìn)行整理,數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS 24數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。變異系數(shù)的計(jì)算公式為:變異系數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)差/均值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 兒茶素組分含量

    1,2,6-TGGP(峰9)含量的鑒定情況見圖1,1,2,6-TGGP含量較高(> 5.00 mg/g)的茶樹資源兒茶素組分及1,2,6-TGGP的具體含量測(cè)定結(jié)果見表3。

    圖1 茶葉中主要成分液相色譜圖Figure 1 High performance liquid chromatogram of the main components in tea

    表3 1,2,6-TGGP含量較高的茶樹資源兒茶素及1,2,6-TGGP含量Table 3 Catechin and 1,2,6-TGGP content of tea germplasms with high content of 1,2,6-TGGP mg/g

    對(duì)219份茶樹資源9個(gè)組分含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表4)后發(fā)現(xiàn),1,2,6-TGGP含量為0.34~53.63 mg/g,平均為9.53 mg/g;GA含量為0.16~1.32 mg/g,平均為0.48 mg/g;GC含量為0.46~7.88 mg/g,平均為2.00 mg/g;EGC含量為3.03~27.41 mg/g,平均為12.36 mg/g;C含量為0.47~22.72 mg/g,平均為2.16 mg/g;EC含量為2.96~13.86 mg/g,平均為7.07 mg/g;EGCG含量為12.25~114.10 mg/g,平均為67.39 mg/g;GCG含量為0.29~4.50 mg/g,平均為1.80 mg/g;ECG含量為3.46~53.87 mg/g,平均為25.24 mg/g。219份茶樹資源中9個(gè)成分變異系數(shù)從大到小排序?yàn)?,2,6-TGGP、C、GC、GA、GCG、EGC、ECG、EC、EGCG;變異系數(shù)最大的是1,2,6-TGGP,為101.45%。以上結(jié)果表明,219份茶樹資源表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。

    表4 219份茶樹資源9個(gè)組分含量統(tǒng)計(jì)Table 4 Content statistics of 9 components in 219 tea germplasms

    對(duì)219份茶樹資源1,2,6-TGGP含量的分布進(jìn)行分析(圖2)可以看到,1,2,6-TGGP含量低于1%的資源材料最多,有149份,占比68.03%;1%~3%的有57份,占比26.03%;高于3%的最少,有13份材料,分別是‘中茗6號(hào)’(5.36%)、‘中茗6號(hào)’(4.92%)、‘恩施5號(hào)’(4.20%)、‘中茗6號(hào)’(4.11%)、‘4201’(4.02%)、‘ESN-5’(4.02%)、‘中茗6號(hào)’(3.82%)、‘中茗66號(hào)’(3.57%)、‘1118’(3.41%)、‘Z9’(3.30%)、‘4511’(3.23%)、‘ESN-8’(3.21%)和‘0401’(3.12%),占比5.94%。其中1,2,6-TGGP含量最高的‘中茗6號(hào)’在不同年份、不同地點(diǎn)均有較高含量,說明該品種受環(huán)境影響較小。

    圖2 219份茶樹資源的1,2,6-TGGP含量分布Figure 2 Distribution of 1,2,6-TGGP content in 219 tea germplasms

    2.2 兒茶素各組分的相關(guān)性

    對(duì)219份茶樹資源的9個(gè)組分進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果(表5)可看出,9個(gè)組分中有2/3的組分間存在顯著性的相關(guān)關(guān)系。除GC外,EC與所有的組分存在顯著性的相關(guān)關(guān)系,其中與EGC、C、EGCG、GCG、ECG呈極顯著正相關(guān),與GA、1,2,6-TGGP呈極顯著負(fù)相關(guān)。除C外,1,2,6-TGGP也與所有的組分存在顯著性的相關(guān)關(guān)系,其中與GA、EGCG、ECG呈極顯著正相關(guān),與GC、GCG呈顯著正相關(guān),與EGC、EC呈極顯著負(fù)相關(guān)。1,2,6-TGGP與GA呈極顯著正相關(guān),結(jié)果與Wei等[2]研究結(jié)果一致。

    表5 219份茶樹資源生化成分含量相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of the content of biochemical components in 219 tea germplasms

    3 討論

    茶多酚是茶樹中酚類物質(zhì)及其衍生物的總稱。茶多酚包括兒茶素(黃烷醇類),黃酮、黃酮醇類,花青素、花白素類,酚酸及縮酚酸等,是茶葉的重要品質(zhì)成分和構(gòu)成茶湯滋味的主要物質(zhì)[10]。目前大多數(shù)研究主要圍繞兒茶素類物質(zhì),很少有酚酸衍生物的報(bào)道。1,2,6-TGGP作為酚酸衍生物的一種,具有抗菌、消炎等作用。本研究測(cè)定了219份浙江杭州和嵊州茶樹資源中兒茶素和1,2,6-TGGP含量并對(duì)其進(jìn)行了含量變異分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)9個(gè)組分的變異系數(shù)從大到小依次為1,2,6-TGGP、C、GC、GA、GCG、EGC、ECG、EC、EGCG,表明1,2,6-TGGP有巨大改良潛力。進(jìn)而分析了1,2,6-TGGP的含量分布情況,從中篩選出13份高含量茶樹資源。最后分析了1,2,6-TGGP與兒茶素的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)與其呈極顯著正相關(guān)的GA、EGCG、ECG和呈極顯著負(fù)相的EGC、EC。

    前期研究表明,1,2,6-TGGP是UDP葡萄糖和沒食子酸經(jīng)過一系列嚴(yán)格位置的沒食子酰基化步驟合成的。具體過程為UDP葡萄糖先與第一個(gè)沒食子酸反應(yīng)合成葡萄糖沒食子鞣甙(β-glucogallin),后者再與第二個(gè)沒食子酸反應(yīng)合成1,6-二醛酰葡萄糖(1,6-digalloylglucose),1,6-二醛酰葡萄糖再與第三個(gè)沒食子酸反應(yīng)合成1,2,6-TGGP[11]。本研究發(fā)現(xiàn)1,2,6-TGGP與沒食子酸有極顯著的相關(guān)關(guān)系,這與李強(qiáng)等[7]的研究結(jié)果一致。有趣的是,EGC和EC都與1,2,6-TGGP呈極顯著負(fù)相關(guān),EGCG和ECG均與1,2,6-TGGP呈極顯著正相關(guān),EGC和EC經(jīng)過酰基化后可形成EGCG和ECG,而1,2,6-TGGP中存在三個(gè)?;?,可能可以充當(dāng)?;w。初步推測(cè)這5種物質(zhì)間可能存在某種相關(guān)性關(guān)系??赡艿倪^程是1,2,6-TGGP給EGC提供沒食子?;蒃GCG,給EC提供沒食子?;蒃CG。但具體的反應(yīng)過程需要進(jìn)行深入研究。

    綜上,我們篩選到富含1,2,6-TGGP的優(yōu)異茶樹種質(zhì)資源并且對(duì)1,2,6-TGGP的變異范圍、與兒茶素的相關(guān)性有了較為清晰的認(rèn)識(shí),這為后期1,2,6-TGGP合成機(jī)理研究及品種選育奠定了一定的基礎(chǔ)。

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