一種低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白在凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)抗弧菌感染中的功能研究*

謝 飛 于 洋 周海龍① 李富花

(1.海南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 海南?？?570228; 2.中國科學(xué)院海洋研究所實驗海洋生物學(xué)重點實驗室 山東青島 266071)

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)是我國重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟動物, 是對蝦養(yǎng)殖的主導(dǎo)品種(Luet al, 2017; Boydet al, 2021)。然而, 對蝦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展飽受病害問題困擾。近年, 急性肝胰腺壞死病(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease, AHPND)給對蝦產(chǎn)業(yè)造成嚴重損失(Wanget al, 2015), 該病致病力強、傳播速度快、死亡率高, 以肝胰腺萎縮變白為主要特征, 患病對蝦空腸, 空胃, 之后逐漸死亡(Joshiet al,2014)。該病最初于2009 年首次發(fā)現(xiàn), 隨后在全球主要對蝦養(yǎng)殖國家爆發(fā), 據(jù)估計因AHPND 造成的對蝦養(yǎng)殖業(yè)損失已達10 億美元(Lunet al, 2018)。有關(guān)AHPND 的致病源的研究, Lightner 等(2012)首先報道該病的病原是副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),隨后研究證實含有PirA、PirB毒素質(zhì)粒的副溶血弧菌是AHPND 的病因(Leeet al, 2015)。雖然AHPND可以通過益生菌、蛭弧菌等控制弧菌的方式進行防控(De Schryveret al, 2014; Gomez-Gilet al, 2014), 但是由于病原菌在養(yǎng)殖水體中已經(jīng)廣泛存在, 生物防控難度較大。

培育抗病對蝦良種是防控AHPND 暴發(fā)的根本方法, 然而抗病性狀由于存在測定困難、遺傳力低等問題, 采用傳統(tǒng)育種技術(shù)進行抗病育種難度較大。應(yīng)用精準、高效的分子育種技術(shù)能夠顯著加快抗AHPND遺傳選育, 而篩選抗病基因是開展分子育種的基礎(chǔ)。在水產(chǎn)動物中, 隨著水產(chǎn)動物基因組的相繼破譯, 多個抗病相關(guān)基因被發(fā)掘, 推動了水產(chǎn)動物抗病分子育種研究。在大西洋鮭(Salmo salar)中, 研究鑒定了抗IPN (Infectious pancreatic necrosis)相關(guān)QTL 和基因, 并篩選了兩個與抗IPN 性狀顯著相關(guān)的SNP 標記, 為抗病性狀的改良供了標記來源(Houstonet al,2008, 2012)。此外, 在貝類中分別鑒定了文蛤(Meretrix meretrix)抗副溶血弧菌和櫛孔扇貝(Chlamys farreri)抗鰻利斯頓氏菌(Listonella anguillarum)相關(guān)分子標記(Liet al, 2009; Nieet al, 2015, 2016)。前期在凡納濱對蝦研究中, 通過關(guān)聯(lián)分析技術(shù), 鑒定了多個抗AHPND 相關(guān)SNP 標記, 并鑒定到LvALF6、LvPI3K等抗弧菌候選基因(Zhanget al, 2019; 李碧瀚等,2021)。上述抗病分子標記和抗病基因的研究推動了水產(chǎn)動物抗病分子育種工作的開展。

除通過關(guān)聯(lián)分析鑒定抗病標記和基因, 轉(zhuǎn)錄組比較分析也是篩選抗病基因的重要方法。前期抗AHPND 家系和敏感家系的比較轉(zhuǎn)錄組分析鑒定了多個抗弧菌相關(guān)基因(Zhanget al, 2021), 其中一種低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白 1 (Litopenaeus vannameiprolow-density lipoprotein receptor-related protein 1-like,LvLRP1)基因在凡納濱對蝦抗性和敏感家系之間存在顯著差異, 提示其可能在對蝦抗弧菌中發(fā)揮重要作用。LRP1 隸屬于低密度脂蛋白受體(LDLR)家族, 家族成員基本都是跨膜蛋白, 包括胞外區(qū)域和胞內(nèi)區(qū)域。前期研究顯示LRP1 在內(nèi)吞和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用, 同時該基因也是炎癥反應(yīng)的一個重要調(diào)節(jié)器, 可以影響細胞因子的分泌、吞噬作用和免疫系統(tǒng)細胞的遷移等(May, 2013)。在櫛孔扇貝中, 低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白可以作為識別和清除病原體的受體, 這為該基因在無脊椎動物免疫中的功能提供了新的線索(Liuet al, 2014)。鑒于前期報道的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白在炎癥反應(yīng)和免疫識別中的作用, 結(jié)合抗性和敏感家系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù), 本研究對前期篩選的凡納濱對蝦低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1進行功能研究, 初步解析了其在抗弧菌感染中的功能, 為對蝦抗弧菌性狀的遺傳解析提供了新的線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗所用凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)購自日照星光海洋牧場漁業(yè)有限公司(山東日照), 用于弧菌感染實驗的對蝦平均體重2.33 g, 用于組織表達的對蝦平均體重10.66 g。在進行弧菌感染和組織表達取樣前, 所有實驗材料均在26 °C的海水中暫養(yǎng)48 h。組織表達分析分別取表皮、腸道、腹神經(jīng)、肝胰臟、肌肉、腦、淋巴、鰓、胃、心臟、血、眼柄共12個組織, 所有組織經(jīng)液氮速凍后置于–80 °C冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA 提取和cDNA 合成

1.2.1 總RNA提取 在液氮中研磨不同組織, 組織粉末使用RNAiso Plus (TaKaRa, 日本)試劑提取總RNA, 具體操作參照說明書。使用1.5%瓊脂糖檢測總RNA的完整性, 使用Nanodrop1000檢測總RNA濃度。

1.2.2 cDNA合成 使用PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa, 日本)合成cDNA, 具體方法參照說明書。首先用gDNA Eraser Buffer在42 °C下除去基因組DNA, 然后用PrimeScript RT Enzyme Mix在37 °C下合成cDNA。PCR反應(yīng)條件為: 37 °C, 60 min; 85 °C, 5 s;4 °C, 5 min。反應(yīng)結(jié)束后凍存在–20 °C冰箱。

1.3 凡納濱對蝦低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1 的序列分析

前期在抗副溶血弧菌家系和敏感家系的比較轉(zhuǎn)錄組中篩選到一個差異基因, 注釋為低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1 (Litopenaeus vannameiprolow-density lipoprotein receptor-related protein 1-like,LvLRP1)(Zhanget al, 2021)。經(jīng)與轉(zhuǎn)錄組比對發(fā)現(xiàn)該基因存在兩個轉(zhuǎn)錄本, 分別命名為LvLRP1-1和LvLRP1-2。設(shè)計引物L(fēng)vLRP1-F 和LvLRP1-R 同時擴增兩個轉(zhuǎn)錄本(表1), 使用頭胸部組織cDNA 作為模板進行PCR 擴增, 電泳顯示擴增出兩條帶。將兩條帶分別膠回收后進行連接轉(zhuǎn)化, 之后挑取單克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司進行一代測序, 測序結(jié)果顯示兩條帶分別與LvLRP1-1和LvLRP1-2序列相同, 證實兩個轉(zhuǎn)錄本均表達且序列準確。

表1 核苷酸引物序列Tab.1 Oligonucleotide primer sequences

使用ORFfinder 預(yù)測LvLRP1-1和LvLRP1-2的CDS 區(qū)域, 使用 SignaIP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)進行信號肽預(yù)測, 使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)和Interproscan (https://www.ebi.ac.uk/interpro/about/ interproscan/)進行基因的功能域預(yù)測。

1.4 組織表達分析

使用熒光定量PCR 檢測LvLRP1-1和LvLRP1-2在不同組織中的表達水平。用于組織表達的引物如表1 所示, 通過將引物設(shè)計在LvLRP1-1和LvLRP1-2的差異區(qū)域?qū)崿F(xiàn)表達量的分別檢測, 使用18S 作為內(nèi)參基因, 分別擴增目的基因和內(nèi)參基因。qRT-PCR 退火溫度設(shè)置為55 °C, 目的基因相對表達量的計算使用2–ΔΔCt法(Goniet al, 2009)。

1.5 弧菌感染過程中的基因表達變化

通過浸泡方式進行對蝦的副溶血弧菌感染實驗,將凍存于–80 °C 的菌液接種至含有2% NaCl 的TSB液體培養(yǎng)基中進行活化, 之后轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中過夜擴培, 培養(yǎng)溫度為30 °C, 搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min。在副溶血弧菌生長至對數(shù)期后, 使用顯微鏡和血球計數(shù)板進行細菌定量, 并通過PCR 擴增檢測PirA、PirB質(zhì)粒的存在(Hanet al, 2015), PCR 擴增引物如表1 所示, 通過前期預(yù)實驗確定出半數(shù)致死濃度為5×106CFU/mL。

利用培養(yǎng)的帶有PirA、PirB質(zhì)粒的副溶血弧菌進行浸泡感染實驗, 實驗水體中副溶血弧菌濃度為5×106CFU/mL, 根據(jù)兩個轉(zhuǎn)錄本的組織表達情況,取表皮作為分析的靶組織。分別在浸泡感染前(0 h),浸泡感染后3、6、12 h 取對蝦表皮組織, 3 尾蝦混合作為1 個樣品, 每個時間點設(shè)置3 個重復(fù)。提取表皮組織RNA 并合成cDNA, 使用qPCR 檢測不同時間點表皮組織中LvLRP1-1和LvLRP1-2的表達變化, qPCR程序和相對表達量計算方法與1.4 一致。

1.6 dsRNA 合成與最佳干擾劑量的確定

由于LvLRP1-1和LvLRP1-2的序列相似性高, 其差異部分無法單獨設(shè)計dsRNA, 因此使用其共同部分設(shè)計dsRNA 進行RNA 干擾實驗。使用Primer3 設(shè)計dsRNA 引物, 并在引物序列前添加T7 啟動子序列,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成, 同時合成EGFP 基因的dsRNA 作為對照, 引物如表1 所示。使用TranscriptAid T7 高產(chǎn)率轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo Fisher Science)合成目的基因和 EGFP 的dsRNA。

為確定最佳干擾劑量, 分別使用1 μg/尾、2 μg/尾和4 μg/尾劑量進行干擾預(yù)實驗, 同時注射同等劑量的dsEGFP 和PBS 作為對照, 注射后48 h 取表皮組織進行RNA 提取和LvLRP1-1和LvLRP1-2的定量檢測, 分析不同劑量的干擾效率, 確定最佳干擾劑量。

1.7 RNA 干擾與細菌感染

使用預(yù)實驗獲得的最佳干擾劑量同時敲降LvLRP1-1和LvLRP1-2, 并在基因干擾后進行弧菌感染。分別設(shè)置PBS 未感染組、PBS 組、dsEGFP 組和dsLRP1 組, 每組三個平行, 每個平行30 尾蝦。PBS組每尾蝦注射10 μL 1×PBS, dsEGFP 組每尾蝦注射10 μL 的dsEGFP (2 μg dsEGFP), dsLRP1 組每尾蝦注射10 μL 的目的基因雙鏈RNA (2 μg dsLRP1)。

注射雙鏈后 48 h, 對 PBS 組、dsEGFP 組和dsLRP1 組的樣品通過浸泡方式進行弧菌感染, 水體中弧菌濃度設(shè)置為5×106CFU/mL, PBS 未感染組不進行弧菌感染。感染后 3 h 分別從 dsEGFP 組和dsLRP1 組隨機挑選9 尾個體, 取表皮組織, 3 尾個體混合作為一個樣品, 提取樣品的RNA 并通過qPCR檢測弧菌PirA基因的相對表達量, qPCR 擴增引物如表1 所示。同時記錄感染各個時間點對蝦的死亡率,繪制死亡率曲線。

1.8 統(tǒng)計分析

使用SPSS 軟件對獲得的基因表達數(shù)據(jù)和不同組的死亡率數(shù)據(jù)進行T 檢驗, 計算對照組和實驗組間的顯著性差異,P<0.05 表示顯著性差異(用*標記),P<0.01 表示極顯著性差異(用**標記)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LvLRP1-1 和LvLRP1-2 的cDNA 序列分析

LvLRP1-1和LvLRP1-2兩個轉(zhuǎn)錄本的cDNA 序列高度一致, 唯一的差別在于LvLRP1-1的cDNA 比LvLRP1-2多129 bp, 多編碼43 個氨基酸(圖1)。LvLRP1-1的cDNA序列全長916 bp, 開放閱讀框681 bp,編碼226 個氨基酸, 蛋白質(zhì)分子量為24 334.69 Da, 等電點pI 為5.45。LvLRP1-2的cDNA 序列全長787 bp,開放閱讀框552 bp, 編碼183 個氨基酸, 預(yù)測蛋白質(zhì)分子量為19 646.52 Da, 等電點pI 為6.55。兩者僅ORF 區(qū)存在差異,LvLRP1-1比LvLRP1-2多編碼43個氨基酸(圖1), 結(jié)構(gòu)域預(yù)測顯示LvLRP1-1和LvLRP1-2都含有信號肽和低密度脂蛋白受體結(jié)構(gòu)域,且均含有兩個內(nèi)部重復(fù)片段(RPT 1)結(jié)構(gòu)域(圖2)。

圖1 凡納濱對蝦低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1 基因兩種轉(zhuǎn)錄本的核苷酸和氨基酸序列Fig.1 The nucleotide and amino acid sequences of two low-density lipoprotein receptor-related protein 1 gene in L. vannamei

圖2 凡納濱對蝦低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1 基因兩種轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.2 Prediction of low density lipoprotein receptor-related protein 1 domains in L. vannamei

2.2 組織表達分布

通過熒光定量PCR 檢測LvLRP1-1和LvLRP1-2在不同組織中的表達量, 結(jié)果顯示LvLRP1-1在表皮、眼柄、腦和心臟中高表達,LvLRP1-2僅在表皮和眼柄中高表達。表皮和眼柄是LvLRP1-1和LvLRP1-2共同高表達的組織(圖3)。

圖3 LvLRP1-1 和LvLRP1-2 的組織表達分布Fig.3 Tissue expression distribution of LvLRP1-1 and LvLRP1-2

2.3 副溶血弧菌感染后的基因表達變化

在副溶血弧菌感染對蝦后,LvLRP1-1和LvLRP1-2的轉(zhuǎn)錄表達變化趨勢一致, 均在感染后3 h 其轉(zhuǎn)錄水平明顯升高, 上調(diào)倍數(shù)均在10 倍以上, 在感染后6 h之后, 其轉(zhuǎn)錄表達又恢復(fù)到正常水平(圖4)。

圖4 副溶血弧菌感染后表皮組織LvLRP1-1 和LvLRP1-2 表達變化Fig.4 Changes of the LvLRP1-1 and LvLRP1-2 expression in epidermal tissue after V. parahaemolyticus infection

2.4 最佳干擾劑量的確定

在注射1、2 和4 μg 雙鏈后LvLRP1-1和LvLRP1-2的表達變化如圖5 所示, 在2 和4 μg 時兩個轉(zhuǎn)錄本的干擾效率均達98% (圖5), 為了兼顧干擾效率和經(jīng)濟性, 最終確定以2 μg/尾的干擾劑量進行正式實驗。

圖5 注射不同劑量dsRNA 后LvLRP1-1 和LvLRP1-2 的相對表達量Fig.5 Relative expression of LvLRP1-1 and LvLRP1-2 after injection with different doses of dsRNA

2.5 基因干擾對機體抗副溶血弧菌能力的影響

在LvLRP1-1和LvLRP1-2被敲降后進行副溶血弧菌感染, 感染后3 h 后檢測表皮中PirA的相對表達量來代表弧菌感染和增殖速度, 結(jié)果顯示目的基因被干擾后表皮中PirA基因的相對表達量顯著升高(圖6)。同時, 在基因干擾后, 對蝦的死亡速度顯著加快。在感染后6 h 干擾組死亡率為對照組的3 倍, 在感染后12 h 干擾組死亡率已達75%, 而對照組的死亡率僅為35%。在感染后24 h, 感染組死亡率達90%, 對照組死亡率為50%。感染后36 h和48 h, 干擾組死亡率為100%,對照組逐漸趨近平穩(wěn), 最終死亡率為60% (圖7)。

圖6 LvLRP1-1 和LvLRP1-2 同時干擾組和對照組在副溶血弧菌感染3 h 后表皮組織PirA 基因的相對含量Fig.6 Relative content of PirA gene in epidermal tissue of LvLRP1-1 and LvLRP1-2 gene interference group and control group after 3 h of V. parahaemolyticus infection

圖7 LvLRP1-1 和LvLRP1-2 基因同時干擾后凡納濱對蝦弧菌感染后死亡率Fig.7 Mortality following Vibrio infection in L. vannamei after interference of LvLRP1-1 and LvLRP1-2 gene

3 討論

抗弧菌相關(guān)基因的篩選是開展對蝦抗病分子育種的基礎(chǔ)。本研究針對前期篩選的抗弧菌相關(guān)基因LvLRP1的兩個轉(zhuǎn)錄本進行了基因序列、組織表達和功能研究, 證實了凡納濱對蝦低密度脂蛋白受體1 基因在對蝦抵抗弧菌感染的過程中發(fā)揮著重要作用。

低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)是低密度脂蛋白受體家族的一員, 是一種細胞表面蛋白(Audersetet al, 2020)。本研究中發(fā)現(xiàn)的LvLRP1-1和LvLRP1-2結(jié)構(gòu)預(yù)測是位于胞外區(qū)的膜結(jié)合蛋白, 符合低密度脂蛋白受體的結(jié)構(gòu)特征, 推測可能發(fā)揮細胞表面受體的作用。前期研究表明, LRP1 可能是以模式識別受體形式發(fā)揮免疫作用, 在扇貝中的研究顯示低密度脂蛋白受體可以作為識別和清除病原的受體, 并證實其對弧菌有較強的抑菌活性(Liuet al, 2014)。除了作為模式識別受體, LRP1 也是重要的免疫和炎癥調(diào)節(jié)因子。在凡納濱對蝦中鑒定了一種含有低密度脂蛋白受體結(jié)構(gòu)域的凝集素, 免疫刺激后該基因表達上調(diào), 沉默該基因顯著提高了對蝦在感染副溶血弧菌后的死亡率, 且鰓中細菌載量顯著升高, 推測該基因具有細菌凝集活性, 并能增強血細胞的吞噬作用, 進一步研究顯示該基因低密度脂蛋白受體結(jié)構(gòu)域的缺失突變體對血細胞的吞噬能力降低, 說明低密度脂蛋白結(jié)構(gòu)域與該基因的免疫活性有關(guān)(Lianget al,2019)。在日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)的研究中, 氨氮脅迫后LRP1基因顯著上調(diào), 提示LRP1基因可能作為重要的免疫及炎癥反應(yīng)因子, 在日本沼蝦抗氨氮脅迫中發(fā)揮作用(Sunet al, 2020)。

本研究鑒定的LvLRP1-1和LvLRP1-2序列高度相似, 眼柄和表皮是兩個轉(zhuǎn)錄本共同高表達的組織。表皮是機體免疫的第一道防線, 在浸泡感染中, 表皮組織首先接觸弧菌, 并啟動弧菌的識別和免疫防御機制。LvLRP1-1和LvLRP1-2均在弧菌感染后快速上調(diào)表達, 而在6 h 后降至正常水平, 說明該基因在弧菌的早期識別中發(fā)揮作用。值得說明的是, 該基因除了含有低密度脂蛋白受體的結(jié)構(gòu)域外, Interproscan 的預(yù)測結(jié)果顯示兩個轉(zhuǎn)錄本編碼的109～147 氨基酸與WAP 結(jié)構(gòu)域具有相似性, WAP 結(jié)構(gòu)域是對蝦抗菌肽的主要功能域, 其發(fā)揮重要的抗菌作用(Lvet al,2020), 因此LvLRP1在表皮中可能發(fā)揮識別和抑菌的雙重作用。同時, 該基因在眼柄、心臟和腦中的高表達可能與發(fā)揮膽固醇或脂蛋白受體的作用有關(guān), 進一步證實其功能的多樣性。

LvLRP1-1和LvLRP1-2序列相似性高, 難以設(shè)計雙鏈分別敲降, 鑒于兩個轉(zhuǎn)錄本在弧菌感染過程中的表達變化一致, 我們推測其在抵抗弧菌感染中的功能相似, 所以本研究采取了對LvLRP1-1和LvLRP1-2同時干擾的方案, 以研究LvLRP1在抗弧菌感染過程中的功能。結(jié)果顯示, 注射LvLRP1的dsRNA 可以顯著降低LvLRP1-1和LvLRP1-2的表達量?；【腥緦嶒灲Y(jié)果顯示,LvLRP1基因被沉默后, 對蝦死亡率顯著上升, 一種原因是該基因的沉默影響了機體對弧菌的識別, 進而影響了機體免疫防御的啟動, 另外一種原因是該基因的敲降影響了該基因其對表皮組織中弧菌的清除, 從而使弧菌快速通過表皮進入體內(nèi),該基因的沉默導(dǎo)致其無法發(fā)揮免疫效應(yīng)分子作用, 機體清除弧菌能力減弱, 從而使弧菌快速通過表皮進入體內(nèi), 使得死亡率升高。研究結(jié)果進一步證實了LvLRP1-1和LvLRP1-2在對蝦抗弧菌中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié)論

本研究詳細分析了LvLRP1-1和LvLRP1-2兩個轉(zhuǎn)錄本的序列、結(jié)構(gòu)域、組織表達分布和在對蝦抗弧菌感染中的功能, 證實LvLRP1基因在弧菌感染過程中發(fā)揮重要的免疫和抗病作用, 為對蝦抗弧菌性狀的遺傳解析提供了新的線索, 也為對蝦抗弧菌性狀的遺傳育種提供了理論指導(dǎo)。