胃癌預(yù)后及免疫治療反應(yīng)預(yù)測(cè)基底膜相關(guān)基因標(biāo)簽的構(gòu)建

李文倩,宮宇紅,邱文生

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科,山東 青島 266031; 2 海軍青島特勤療養(yǎng)中心中醫(yī)科)

胃癌是全球發(fā)病率排第5、死亡率排第3的惡性腫瘤[1]。在過(guò)去的幾年中,免疫療法在提高胃癌病人的總生存期(OS)方面被證明是有效的[2]。然而,由于胃癌的高度異質(zhì)性,免疫療法并不適用于所有胃癌病人[3]。因此,開發(fā)能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)胃癌腫瘤免疫微環(huán)境的基因標(biāo)簽,以識(shí)別不同的胃癌免疫亞型,確定最有可能從免疫治療中獲益的人群,是目前亟待解決的問(wèn)題。在腫瘤組織中,免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的程度受腫瘤周圍毛細(xì)血管通透性、腫瘤刺激產(chǎn)生的細(xì)胞因子和趨化因子以及腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞外基質(zhì)的影響[4]。作為細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分,基底膜(BM)在免疫細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)程中充當(dāng)重要屏障[5]。然而,BM相關(guān)分子是否能夠影響免疫細(xì)胞浸潤(rùn)從而調(diào)節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境仍然未知。此外,BM作為浸潤(rùn)性癌和原位癌區(qū)分的關(guān)鍵結(jié)構(gòu),在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[6]。目前尚無(wú)研究探討B(tài)M相關(guān)分子對(duì)胃癌預(yù)后的影響。本研究基于生物信息學(xué)方法對(duì)以上問(wèn)題進(jìn)行了初步探討。

1 材料和方法

1.1 BM相關(guān)基因表達(dá)數(shù)據(jù)的采集

從癌癥基因組圖譜(TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取32例正常樣本及375例胃癌樣本的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床信息作為訓(xùn)練集,再?gòu)幕虮磉_(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(GEO)GSE84437數(shù)據(jù)集中獲取433例胃癌樣本的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)和臨床信息作為驗(yàn)證集。從基因集富集分析(GSEA)分子特征數(shù)據(jù)庫(kù)(v7.5.1版本)中獲取61個(gè)BM相關(guān)基因。

1.2 與胃癌預(yù)后相關(guān)的BM相關(guān)基因標(biāo)簽的構(gòu)建及驗(yàn)證

用“l(fā)imma”R包分析腫瘤和正常組織間差異表達(dá)的BM相關(guān)基因(BMDEGs),將|log2FC|>1和偽發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05作為閾值。訓(xùn)練集采用單變量比例風(fēng)險(xiǎn)回歸(Cox回歸)分析篩選胃癌預(yù)后相關(guān)的BM相關(guān)候選基因,進(jìn)一步使用最小絕對(duì)值選擇與收縮算子(LASSO)回歸建立提示胃癌預(yù)后的BM相關(guān)基因標(biāo)簽。根據(jù)標(biāo)簽中每個(gè)BM相關(guān)基因的標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平與其相應(yīng)回歸系數(shù)的乘積再總和來(lái)計(jì)算每例病人的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將訓(xùn)練集和驗(yàn)證集的病人分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組,采用生存曲線(Kaplan-Meier曲線)分析評(píng)估兩組生存差異,Cox回歸及受試者工作特征(ROC)曲線分析進(jìn)一步驗(yàn)證標(biāo)簽的可靠性和穩(wěn)定性。用“rms”R包構(gòu)建列線圖,預(yù)測(cè)胃癌病人1、3、5年的OS。建立校準(zhǔn)曲線以評(píng)估使用列線圖預(yù)測(cè)的OS與實(shí)際觀察到的OS之間的一致性,采用ROC曲線分析比較各預(yù)測(cè)變量的預(yù)后價(jià)值,采用決策曲線分析(DCA)評(píng)估列線圖模型的臨床適用性。

1.3 腫瘤免疫微環(huán)境及免疫治療反應(yīng)分析

采用不同算法評(píng)估高、低風(fēng)險(xiǎn)組胃癌病人腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的豐度,同時(shí)分析兩組間免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因表達(dá)、免疫功能、基質(zhì)評(píng)分、免疫評(píng)分以及腫瘤微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)的差異。從腫瘤免疫功能障礙和排斥(TIDE)在線網(wǎng)站(http://tide.dfci.harvard.edu/)下載胃癌免疫治療反應(yīng)相關(guān)數(shù)據(jù)信息,計(jì)算高、低風(fēng)險(xiǎn)組病人的TIDE評(píng)分,并利用GSE78220和PRJEB25780數(shù)據(jù)集信息分析風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與免疫治療反應(yīng)的關(guān)系。然后用“pRRophetic”R包分析風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與胃癌常用化療藥物敏感性之間的關(guān)系。

1.4 在線生信分析工具驗(yàn)證BMDEGs的表達(dá)

基于基因表達(dá)水平交互式分析平臺(tái)(GEPIA)(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)驗(yàn)證胃癌和正常胃組織中BMDEGs的差異表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 8.0.1軟件(GraphPad Software,Inc.)和R 4.1.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。連續(xù)變量比較采用Student’st檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本W(wǎng)ilcoxon秩和檢驗(yàn)、Kruskal-Wallis檢驗(yàn)和方差分析,相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BM相關(guān)基因標(biāo)簽的構(gòu)建

差異分析篩選出19個(gè)BMDEGs(圖1A、B)。用單變量Cox回歸分析進(jìn)一步篩選出8個(gè)與胃癌預(yù)后相關(guān)的BMDEGs(圖1C),通過(guò)LASSO回歸分析最終建立了由6個(gè)BMDEGs(CAV1、COL4A1、MMP11、PXDN、COL4A5、USH2A)組成的胃癌基因標(biāo)簽(圖1D、E)。

2.2 BM相關(guān)基因標(biāo)簽預(yù)后價(jià)值的評(píng)估

病人的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分計(jì)算如下:風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分=0.072×CAV1的表達(dá)+0.015×COL4A1的表達(dá)+0.077×MMP11的表達(dá)+0.152×PXDN的表達(dá)+0.054×COL4A5表達(dá)+1.188×USH2A表達(dá)。訓(xùn)練集(圖2A)和驗(yàn)證集(圖2B)中的病人均根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組。訓(xùn)練集和驗(yàn)證集中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較高的胃癌病人往往死亡較早,Kaplan-Meier曲線分析表明,高風(fēng)險(xiǎn)組胃癌病人的OS較短(圖2C～F)。訓(xùn)練集單變量Cox回歸分析表明,年齡和T、N、M分期以及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(P<0.001,HR=3.472,95%CI=1.949～6.186)與OS之間顯著相關(guān)(圖2G);多變量Cox回歸分析同樣顯示,年齡和N、M分期以及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分(P<0.001,HR=4.008,95%CI=2.193～7.323)是OS的獨(dú)立預(yù)后因素(圖2H)。驗(yàn)證集的單變量和多變量Cox回歸分析進(jìn)一步證實(shí)了訓(xùn)練集的結(jié)果(圖2J、K)。以上結(jié)果證明我們構(gòu)建的BM相關(guān)基因標(biāo)簽可作為胃癌病人的獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物。ROC曲線分析結(jié)果顯示,訓(xùn)練集中預(yù)測(cè)胃癌病人1、3、5年生存率的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分曲線下面積(AUC)分別為0.627、0.638和0.717(圖2I),驗(yàn)證集中預(yù)測(cè)1、3、5年生存率的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分AUC也均高于0.6(圖2L)。

TCGA(A)和GEO(B)隊(duì)列中胃癌病人的風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)分布;TCGA(C)和GEO(D)隊(duì)列中胃癌病人風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)和生存狀態(tài)關(guān)系散點(diǎn)圖;TCGA(E)和GEO(F)隊(duì)列中高、低風(fēng)險(xiǎn)組胃癌病人OS的Kaplan-Meier曲線;TCGA(G、H)和GEO(J、K)隊(duì)列中臨床特征和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的單變量和多變量Cox回歸分析森林圖;TCGA(I)和GEO(L)隊(duì)列中風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分預(yù)測(cè)胃癌病人1、3、5年OS的ROC曲線。

2.3 預(yù)測(cè)胃癌OS的列線圖模型的構(gòu)建及評(píng)價(jià)

將多種臨床風(fēng)險(xiǎn)因素與基于基因標(biāo)簽計(jì)算所得風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分結(jié)合構(gòu)建胃癌OS預(yù)測(cè)的列線圖模型(圖3A)。訓(xùn)練集及驗(yàn)證集的校準(zhǔn)曲線顯示,列線圖模型預(yù)測(cè)胃癌病人OS的準(zhǔn)確度較高(圖3B、C)。兩隊(duì)列ROC曲線分析結(jié)果顯示,列線圖模型預(yù)測(cè)胃癌病人1、3、5年OS的AUC均較風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分高(圖3D、G),更顯著高于其他臨床風(fēng)險(xiǎn)因素(圖3E、H)。DCA結(jié)果顯示,列線圖模型預(yù)測(cè)胃癌OS的臨床適用度也較高(圖3F、I)。

2.4 腫瘤免疫微環(huán)境與免疫治療反應(yīng)分析

免疫細(xì)胞浸潤(rùn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分間關(guān)系分析結(jié)果顯示,大多數(shù)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分呈正相關(guān),尤其是促進(jìn)胃癌進(jìn)展和導(dǎo)致免疫抑制的細(xì)胞(圖4A)。箱線圖結(jié)果亦是如此(圖4B)。免疫功能差異分析結(jié)果顯示,趨化因子CCR家族、抗原遞呈細(xì)胞(APC)共刺激、Ⅱ型干擾素反應(yīng)功能在高風(fēng)險(xiǎn)組中更強(qiáng),而主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ類功能在低風(fēng)險(xiǎn)組中更強(qiáng)(圖4C)。免疫檢查點(diǎn)相關(guān)基因(ICGs)表達(dá)差異情況分析顯示,高風(fēng)險(xiǎn)組中有22個(gè)基因表達(dá)水平顯著增加,而低風(fēng)險(xiǎn)組中僅有4個(gè)基因(圖4D)。計(jì)算兩組腫瘤純度(ESTIMATE)評(píng)分、免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分結(jié)果顯示,高風(fēng)險(xiǎn)組3種評(píng)分均顯著高于低風(fēng)險(xiǎn)組(圖4E、F、G)。上述結(jié)果表明,高風(fēng)險(xiǎn)組胃癌病人可能通過(guò)促進(jìn)免疫抑制細(xì)胞浸潤(rùn),ICGs表達(dá)增加,以及募集更多基質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)免疫逃逸,從而導(dǎo)致預(yù)后不良。

A:免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分之間的相關(guān)性分析;高、低風(fēng)險(xiǎn)組間免疫細(xì)胞浸潤(rùn)(B)、免疫功能(C)和ICGs表達(dá)(D)的博弈圖;高、低風(fēng)險(xiǎn)組ESTIMATE評(píng)分(E)、免疫評(píng)分(F)和基質(zhì)評(píng)分(G)的比較。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

MSI分析結(jié)果顯示,MSI-H的病人風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分更低(圖5A);TIDE分析結(jié)果顯示,高風(fēng)險(xiǎn)組病人的TIDE評(píng)分更高(圖5B)。利用GSE78220(圖5C)及PRJEB25780(帕博利珠單抗治療反應(yīng),圖5D)免疫治療反應(yīng)數(shù)據(jù)集分析風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與免疫治療反應(yīng)之間的關(guān)系,結(jié)果顯示,免疫治療有反應(yīng)組風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分更低。表明高風(fēng)險(xiǎn)組胃癌病人更容易發(fā)生免疫逃逸,且對(duì)免疫治療的反應(yīng)更有限。常用化療藥物敏感性差異分析結(jié)果顯示,高風(fēng)險(xiǎn)組對(duì)硼替佐米、環(huán)巴胺以及帕唑帕尼的敏感性更高(圖5E～G),而低風(fēng)險(xiǎn)組則對(duì)甲氨蝶呤和絲裂霉素C更敏感(圖5H、I)。以上結(jié)果表明,本研究構(gòu)建的BM相關(guān)基因標(biāo)簽有助于臨床管理和減少胃癌病人耐藥的發(fā)生。

2.5 6個(gè)BMDEGs表達(dá)水平的驗(yàn)證

GEPIA分析結(jié)果顯示,胃癌組織中COL4A1、PXDN和MMP11的表達(dá)水平顯著高于正常組織,而COL4A5的表達(dá)水平則顯著低于正常組織,但與先前研究不同的是,CAV1和USH2A在胃癌與正常組織中的表達(dá)差異無(wú)顯著性。

3 討 論

BM作為腫瘤進(jìn)展和腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)中至關(guān)重要的結(jié)構(gòu),目前還沒(méi)有研究探索其相關(guān)分子在胃癌預(yù)后、腫瘤免疫微環(huán)境以及胃癌免疫治療中的作用。本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù),從61個(gè)BM相關(guān)基因中篩選出19個(gè)在胃癌及癌旁組織中差異表達(dá)的基因,進(jìn)一步采用單變量Cox和LASSO回歸進(jìn)行預(yù)后分析,最后構(gòu)建了一個(gè)包含6個(gè)關(guān)鍵BMDEGs的基因標(biāo)簽,該標(biāo)簽可對(duì)胃癌病人生存風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評(píng)分,評(píng)估病人預(yù)后,分析腫瘤免疫微環(huán)境,可作為評(píng)估胃癌免疫治療效果的有效分子生物標(biāo)志物。該標(biāo)簽所包含的6個(gè)關(guān)鍵基因目前已被證明會(huì)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

CAV1是洞穴的主要支架蛋白,研究發(fā)現(xiàn)它在胃癌組織中低表達(dá),增加其表達(dá)可抑制胃癌發(fā)展[7]。COL4A1是Ⅳ型膠原蛋白α鏈(COL4A)家族的成員,可通過(guò)調(diào)節(jié)Hedgehog信號(hào)通路影響胃癌侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,有助于胃癌轉(zhuǎn)移[8]。COL4A5同屬于COL4A家族,生存分析表明,COL4A1/5表達(dá)百分比越低,胃癌病人的OS越長(zhǎng),且COL4A5是胃癌的獨(dú)立預(yù)后分子標(biāo)志物[9]。MMP11作為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)家族的一員,在胃癌病人腫瘤組織和血漿純化的外泌體中過(guò)表達(dá),參與胃癌轉(zhuǎn)移,影響胃癌OS[10]。PXDN催化膠原蛋白Ⅳ中的磺酰胺鍵,起鞏固BM的作用,研究發(fā)現(xiàn)PXDN可抑制宮頸癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11],但可促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞侵襲[12]。USH2A編碼Usherin蛋白,研究發(fā)現(xiàn)該蛋白在胃癌的早期階段表達(dá)水平升高,可能與促進(jìn)胃癌的進(jìn)展有關(guān)[13]。以上文獻(xiàn)結(jié)果增加了本研究構(gòu)建的基因標(biāo)簽預(yù)測(cè)胃癌病人預(yù)后的可靠性。

此外,本研究還結(jié)合多種臨床風(fēng)險(xiǎn)因素與基于基因標(biāo)簽所得的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分構(gòu)建了一個(gè)能夠更為準(zhǔn)確預(yù)測(cè)胃癌OS的列線圖模型,并從3個(gè)維度評(píng)估了列線圖模型預(yù)測(cè)胃癌OS的臨床價(jià)值。結(jié)果顯示,列線圖模型預(yù)測(cè)胃癌OS的準(zhǔn)確度、區(qū)分度以及臨床適用度均較高。

通過(guò)對(duì)BM相關(guān)分子與腫瘤免疫微環(huán)境的相關(guān)性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),高風(fēng)險(xiǎn)組中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)度較高,且浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞多與腫瘤發(fā)展和抗腫瘤免疫抑制相關(guān),如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。此外,高風(fēng)險(xiǎn)組基質(zhì)細(xì)胞評(píng)分以及ICGs的表達(dá)均較高,這進(jìn)一步促進(jìn)了高風(fēng)險(xiǎn)組免疫逃逸的發(fā)生。

過(guò)去10年中,免疫檢查點(diǎn)阻斷療法已使一系列惡性腫瘤獲得令人振奮的生存獲益。目前我國(guó)已批準(zhǔn)納武利尤單抗聯(lián)合化療(CapeOX/FOLFOX)用于晚期胃癌一線治療,無(wú)論P(yáng)D-L1的表達(dá)如何。信迪利單抗聯(lián)合CapeOX也已在我國(guó)被批準(zhǔn)用于晚期胃癌一線治療。此外尚有一些在其他腫瘤中獲批的PD-1單抗對(duì)晚期胃癌的療效目前也在研究中。同時(shí),國(guó)內(nèi)也有一大批PD-1抑制劑用于胃癌術(shù)前新輔助治療的二期臨床研究正在進(jìn)行,目前安全性基本沒(méi)有問(wèn)題。免疫治療的日益成熟應(yīng)用將對(duì)早晚期胃癌病人的生存及生活質(zhì)量起到明顯改善作用。

TCGA根據(jù)胃癌分子及遺傳特征將胃癌分為4種亞型:EB病毒陽(yáng)性型、微衛(wèi)星不穩(wěn)定型、染色體不穩(wěn)定型和基因組穩(wěn)定型[14]。其中EB病毒陽(yáng)性型胃癌表現(xiàn)出高CD8陽(yáng)性T細(xì)胞浸潤(rùn)和PD-L1/L2表達(dá)增加,提示其對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑具有更高的敏感性[15]。MSI-H狀態(tài)是手術(shù)完全可切除胃癌病人的良好預(yù)后因素,是圍手術(shù)期細(xì)胞毒性化療(如氟尿嘧啶類)反應(yīng)的陰性預(yù)測(cè)指標(biāo),也是免疫檢查點(diǎn)抑制劑反應(yīng)的陽(yáng)性預(yù)測(cè)因子。美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)指南推薦對(duì)所有新確診為胃癌的病人使用聚合酶鏈反應(yīng)、二代測(cè)序或免疫組化方法進(jìn)行MSI狀態(tài)檢測(cè)(https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/gastric.pdf)。此外,腫瘤突變負(fù)荷以及PD-L1表達(dá)均是免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療晚期胃癌療效的有用預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。本研究采用生物信息學(xué)方法構(gòu)建了一個(gè)新的可預(yù)測(cè)胃癌免疫微環(huán)境及免疫治療反應(yīng)的BM相關(guān)基因標(biāo)簽,通過(guò)TIDE及其他免疫治療反應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)分析,結(jié)果表明該基因標(biāo)簽?zāi)軌蚝芎玫仡A(yù)測(cè)胃癌抗PD-1治療反應(yīng)。

總之,本研究首次將BM與胃癌預(yù)后、腫瘤免疫微環(huán)境和免疫治療反應(yīng)評(píng)估聯(lián)系起來(lái),隨著二代測(cè)序技術(shù)的成熟應(yīng)用,本研究結(jié)果有望使胃癌的免疫治療、分子靶向治療及化療更加個(gè)體化和精準(zhǔn)化。