阿魏酸在煙曲霉菌誘導(dǎo)人角膜上皮細(xì)胞中的抗炎作用

張颯颯,魯葉慧,熊翌宏,楊珊珊,吳媛,彭旭東

(1 青島大學(xué)附屬醫(yī)院眼科,山東 青島 266003; 2 湖北醫(yī)藥學(xué)院藥護(hù)學(xué)院)

煙曲霉菌是一種常見(jiàn)的真菌性角膜炎的致病真菌[1],可黏附于角膜上皮從而免于宿主的免疫清除[1-2]。真菌感染時(shí),各種免疫細(xì)胞在真菌清除方面發(fā)揮重要防御作用[3-4];但是其引發(fā)的過(guò)度炎癥反應(yīng)會(huì)加重組織損傷[5-6]。目前臨床除了常用藥物外[7],還需要尋找安全高效的抗炎藥物實(shí)現(xiàn)抗真菌聯(lián)合免疫治療。阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基肉桂酸, FA)是一種酚類(lèi)化合物,可溶于二甲基亞砜(DMSO),它具有抗炎[8-9]、抗氧化[10]、肝臟保護(hù)[11]等功效。LAMPIASI等[12]研究發(fā)現(xiàn),FA在脂多糖(LPS)刺激的小鼠RAW264.7細(xì)胞中發(fā)揮抗炎作用。最近CAO等[8]研究發(fā)現(xiàn),FA可降低促炎因子表達(dá),改善肝損傷的預(yù)后,在乙醇性肝損傷中起保護(hù)作用[13]。本研究旨在探討FA在煙曲霉菌誘導(dǎo)的炎癥中的抗炎作用,為真菌性角膜炎的治療提供新思路?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人角膜上皮細(xì)胞(HCEC)由廈門(mén)眼科實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng),將其接種到10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,在含有體積分?jǐn)?shù)0.10 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)(37 ℃,含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱)。煙曲霉菌(CPCC 3.0772)購(gòu)自中國(guó)微生物菌種保藏中心(SGMCC);FA(100 mg,純度98%)由麥克林試劑公司提供,用體積分?jǐn)?shù)0.001的DMSO溶解后以100 mmol/L儲(chǔ)備液存放于-80 ℃;RNAex pro reagent裂解液由艾科瑞生物公司提供;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒由Biolegend公司提供;HiScript Ⅲ RT SuperMix(南京諾唯贊生物公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1煙曲霉菌絲制備 將煙曲霉菌接種到沙氏液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)48～72 h(37 ℃,含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱),待培養(yǎng)基中覆蓋白色絨毛團(tuán)塊狀菌落,將菌落轉(zhuǎn)移至玻璃研磨棒中研磨至勻漿狀態(tài),加入體積分?jǐn)?shù)0.75乙醇滅活(4 ℃,48 h)后得到滅活煙曲霉菌絲,使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)并調(diào)整菌絲濃度至1×1011CFU/L后用于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.2FA溶液制備 用無(wú)菌PBS將FA溶液稀釋至實(shí)驗(yàn)需要濃度(0～300 μmol/L)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),FA溶液中DMSO含量低于1‰。

1.2.3CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HCEC存活率96孔板中加入HCEC,達(dá)到80%融合時(shí),向細(xì)胞中加入新的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液或含不同濃度FA(0～300 μmol/L)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液,繼續(xù)孵育24 h(37 ℃,含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱),棄去培養(yǎng)液并加入PBS洗去懸浮細(xì)胞及藥物殘留。向96孔板中分別加入100 μL的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液和10 μL CCK-8檢測(cè)試劑,37 ℃孵育2 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450、600 nm波長(zhǎng)處吸光度并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.4實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)HCEC中炎癥因子及核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)mRNA表達(dá) 將細(xì)胞加入12孔板或96孔板,隨機(jī)分為空白對(duì)照組(A組)、單純FA處理組(B組)、單純加菌處理組(C組)和加菌+FA處理組(D組),向HCEC加或不加FA(終濃度250 μmol/L)預(yù)處理2 h,并向每孔中加入滅活煙曲霉菌菌絲(1×1011CFU/L)60 μL培養(yǎng)24 h(37 ℃,含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱)。吸棄培養(yǎng)液并加入PBS洗滌3次,各孔中加入500 μL RNAex pro reagent裂解液,充分研磨并轉(zhuǎn)移入EP管中提取總RNA。采用RNA紫外線(xiàn)可見(jiàn)光度法(Nanodrop 2000,Thermo Fisher)測(cè)定總RNA濃度,應(yīng)用HiScript Ⅲ RT SuperMix處理RNA樣本并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)方法向cDNA樣本中加入DEPC水和SYBR預(yù)混液,進(jìn)行RT-PCR分析(QuantStudioTM5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 系統(tǒng),Thermo Fisher)。RT-PCR的引物及其序列見(jiàn)表1。

表1 RT-PCR基因引物及其序列

1.2.5ELISA法檢測(cè)HCEC炎癥因子IL-6及單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)蛋白表達(dá)水平 根據(jù)1.2.4方法將HCEC分組并處理,4 ℃、5 000 r/min離心后取上清液并轉(zhuǎn)入新的EP管中,應(yīng)用ELISA試劑盒采用雙抗體夾心法檢測(cè)各組IL-6和MCP-1蛋白表達(dá)水平,按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm及570 nm波長(zhǎng)處吸光度,以其表示IL-6和MCP-1蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度FA溶液對(duì)HCEC活力的影響

不同濃度的FA(0、50、100、150、200、250及300 μmol/L)與HCEC共孵育24 h后,300 μmol/L FA溶液處理組HCEC存活率低于其他各組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(n=6,F=5.390,P<0.05)。250 μmol/L及以下濃度FA溶液處理組的HCEC存活率與正常對(duì)照組(N組)相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇250 μmol/L作為研究濃度。

圖1 不同濃度FA處理組HCEC存活率比較

2.2 FA對(duì)煙曲霉菌誘導(dǎo)的HCEC炎癥因子以及Nrf2 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果顯示,FA處理(FFA=7.195～18.560,P<0.01)、滅活菌絲處理(FAF=23.130～141.468,P<0.001)、FA與滅活菌絲處理產(chǎn)生的交互效應(yīng)(FFA×AF=8.731～18.536,P<0.01)對(duì)HCEC炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-αmRNA表達(dá)的影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示,不用滅活菌絲處理時(shí),FA處理和不處理對(duì)mRNA的表達(dá)均無(wú)影響(P>0.05);用滅活菌絲處理時(shí),FA處理組的IL-1β、IL-6及TNF-αmRNA表達(dá)較不處理組明顯降低(F=15.889～47.471,P<0.001)。不用FA處理時(shí),滅活菌絲處理和不處理對(duì)IL-1β、IL-6及TNF-αmRNA表達(dá)的影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.141～94.603,P<0.001);用FA處理時(shí),滅活菌絲處理和不處理相比,各因子mRNA表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.720～23.860,P<0.05)。雙因素析因方差分析還顯示,FA處理(FFA=4.860,P<0.05)及滅活菌絲處理(FAF=37.652,P<0.05)對(duì)Nrf2mRNA表達(dá)影響有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;但FA與滅活菌絲處理無(wú)交互效應(yīng)(FFA×AF=2.757,P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 FA對(duì)IL-1β、IL-6、TNF-α和Nrf2 mRNA表達(dá)的影響

2.3 FA對(duì)煙曲霉菌誘導(dǎo)的HCEC中IL-6以及MCP-1蛋白表達(dá)的影響

ELISA方法檢測(cè)結(jié)果顯示,FA處理(FFA=299.155、388.573,P<0.01)、滅活菌絲處理(FAF=421.591、809.406,P<0.01)、FA與滅活菌絲處理產(chǎn)生的交互效應(yīng)(FFA×AF=258.206、298.778,P<0.01)對(duì)IL-6及MCP-1蛋白表達(dá)的影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。單獨(dú)效應(yīng)結(jié)果顯示,不用滅活菌絲處理時(shí),FA處理和不處理對(duì)IL-6及MCP-1蛋白的表達(dá)均無(wú)影響(P>0.05);用滅活菌絲處理時(shí),FA處理較不處理IL-6及MCP-1蛋白表達(dá)均明顯降低(F=556.608、684.406,P<0.01)。不用FA處理時(shí),滅活菌絲處理和不處理對(duì)IL-6及MCP-1蛋白表達(dá)的影響差異均有顯著性(F=715.097、990.964,P<0.01);用FA處理時(shí),滅活菌絲處理和不處理相比,IL-6及MCP-1蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.273、76.648,P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 FA對(duì)IL-6及MCP-1蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

真菌性角膜炎是導(dǎo)致病人眼部潰瘍、穿孔甚至失明的一種嚴(yán)重的眼部感染性疾病[14]。在亞洲發(fā)展中國(guó)家的真菌感染中,絲狀真菌感染占據(jù)主導(dǎo)地位[15]。植物性角膜損傷、角膜接觸鏡的使用及局部類(lèi)固醇的使用已被公認(rèn)為真菌性角膜炎的主要危險(xiǎn)因素[15]。真菌侵入宿主角膜組織后,真菌細(xì)胞壁上的病原體相關(guān)分子模式受體通過(guò)釋放毒素攻擊受損的角膜組織,并被宿主先天免疫細(xì)胞表達(dá)的模式識(shí)別受體識(shí)別[16]。這一相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生及釋放[17],并招募中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞向感染灶聚集[18],真菌釋放的細(xì)胞毒性物質(zhì)及免疫細(xì)胞聚集引發(fā)的過(guò)度炎癥反應(yīng)使得真菌性角膜炎潰瘍愈合緩慢、預(yù)后不良。真菌性角膜炎的發(fā)病率逐年增高,亟待找到新的治療藥物。

FA為從當(dāng)歸、川芎、赤芍等中草藥中提取的一種酚酸類(lèi)化合物,相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)它具有抗氧化[19]、抗炎[20]、抗凋亡[9]、抗菌[21]、心肌保護(hù)[22]及神經(jīng)保護(hù)[23]等藥理作用。ERMIS等[24]研究發(fā)現(xiàn),在吲哚美辛誘導(dǎo)的大鼠胃潰瘍模型中,FA通過(guò)抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及降低炎癥因子IL-6及TNFα的表達(dá),減輕胃黏膜充血、出血及潰瘍的嚴(yán)重程度,從而改善大鼠胃潰瘍的預(yù)后。而FA在真菌性角膜炎中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本文研究結(jié)果顯示,250 μmol/L FA對(duì)HCEC的活性沒(méi)有影響,因此250 μmol/L FA可作為安全濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

真菌性角膜炎早期通過(guò)招募固有免疫細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng),發(fā)揮對(duì)真菌的清除作用,但持續(xù)的炎癥反應(yīng)會(huì)加重組織的損傷[25]。中性粒細(xì)胞等免疫細(xì)胞的持續(xù)激活和招募會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致更多的炎癥因子及趨化因子的產(chǎn)生和釋放[26],這不利于真菌性角膜炎的預(yù)后。本文RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,加菌刺激組炎癥因子IL-1β、IL-6及TNF-αmRNA表達(dá)顯著,即在真菌感染早期炎癥因子如IL-1β、IL-6及TNF-α等表達(dá)增加,從而誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)及釋放多種炎癥遞質(zhì)進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)來(lái)抵御真菌;而加菌處理后給予FA治療可以顯著抑制HCEC中IL-1β、IL-6及TNF-αmRNA的表達(dá),從而減輕相關(guān)炎癥反應(yīng)。LI等[27]研究發(fā)現(xiàn),在LPS誘導(dǎo)的人HMC3小膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)炎癥模型中,FA通過(guò)抑制IL-1β、TNF-α及一氧化氮的產(chǎn)生及表達(dá)發(fā)揮抗神經(jīng)炎癥作用。本文研究結(jié)果與其相一致。為了進(jìn)一步確認(rèn)FA在煙曲霉菌刺激的HCEC中的抗炎作用,本研究應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)IL-6及MCP-1蛋白表達(dá),結(jié)果顯示,250 μmol/L的FA能夠顯著抑制煙曲霉菌刺激的HCEC炎癥反應(yīng)中IL-6及MCP-1蛋白表達(dá)上調(diào)。有研究顯示,在乙醇誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠肝損傷模型中,FA可以顯著降低丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的血清酶活性,減少乙醇刺激后小鼠肝臟細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的空泡性壞死及炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn),抑制MCP-1和IL-6的表達(dá),減輕乙醇對(duì)小鼠肝臟的損害[13]。本文研究結(jié)果與其相一致。提示FA可以通過(guò)下調(diào)真菌性角膜炎炎癥因子及趨化因子的過(guò)度表達(dá)來(lái)改善真菌性角膜炎的炎癥反應(yīng)。

在真菌性角膜炎病程中,在控制真菌感染后期炎癥反應(yīng)的同時(shí)可以著力促進(jìn)角膜上皮的修復(fù),從而改善真菌性角膜炎的預(yù)后。已有研究顯示,Nrf2不僅可以抑制促炎因子及炎癥標(biāo)志物的過(guò)表達(dá),還可以通過(guò)與血紅素氧合酶(HO-1)啟動(dòng)子抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合上調(diào)HO-1的表達(dá),從而進(jìn)一步抑制促炎因子的過(guò)表達(dá),提示Nrf2/HO-1信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用[28-29]。我們實(shí)驗(yàn)室早先的研究發(fā)現(xiàn),萜類(lèi)化合物紫蘇醛、衣康酸二甲酯及沒(méi)食子酸可通過(guò)增加Nrf2和HO-1的表達(dá),抑制IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α等炎癥因子的表達(dá),在真菌性角膜炎中發(fā)揮強(qiáng)大的抑炎作用[26,30]。而FAN等[26]的研究結(jié)果顯示,紫蘇醛通過(guò)Nrf2/HO-1信號(hào)通路下調(diào)IL-1β、IL-6及TNF-α的表達(dá)水平從而發(fā)揮強(qiáng)大的抗炎作用。其研究還發(fā)現(xiàn),在煙曲霉菌感染的早期Nrf2表達(dá)水平上調(diào),參與煙曲霉菌感染的免疫應(yīng)答,且Nrf2/HO-1信號(hào)通路可通過(guò)抑制下游炎癥因子的表達(dá)水平發(fā)揮抗炎作用。本文研究結(jié)果顯示,單純加菌處理組Nrf2mRNA的表達(dá)增加,而加菌加FA處理組Nrf2mRNA表達(dá)相較于單純加菌處理組顯著上調(diào)。由此我們認(rèn)為,在煙曲霉菌刺激的HCEC中,FA通過(guò)增加Nrf2的表達(dá)水平發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述,FA能夠通過(guò)增強(qiáng)Nrf2的表達(dá)和調(diào)控炎癥因子及趨化因子的表達(dá),減輕煙曲霉菌感染后HCEC的炎癥反應(yīng)。以后的研究可能傾向于探討FA在體內(nèi)外煙曲霉菌感染模型中發(fā)揮抗炎作用的多種機(jī)制,以期推進(jìn)FA用于真菌性角膜炎治療的臨床研究。