卵圓孔未閉合并偏頭痛患者NTRK3基因表達(dá)水平及其與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

李元明, 郝 娟, 伊斯拉木江·吐?tīng)栠d, 陳家驊

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院, 新疆 烏魯木齊, 830063;2. 新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院, 新疆 烏魯木齊, 830000)

卵圓孔未閉(PFO)是臨床較常見(jiàn)的一種先天性心臟發(fā)育異常,其發(fā)病機(jī)制與遺傳基因突變密切相關(guān)[1]。近年來(lái),心臟超聲技術(shù)不斷發(fā)展,使得人們對(duì)右向左分流(RLS)現(xiàn)象認(rèn)識(shí)深入, PFO導(dǎo)致的多種病理改變也逐漸受到臨床重視[2]。偏頭痛(MA)是青少年臨床常見(jiàn)疾病之一,嚴(yán)重影響患者日常生活質(zhì)量,也是致殘的主要原因之一,目前MA治療效果欠佳[3]。PFO患者罹患MA概率是普通人群的2～3倍。上述2種臨床癥狀均發(fā)病機(jī)制不清,臨床認(rèn)為均與患者某些基因表達(dá)水平的改變相關(guān)[4]。研究[5]認(rèn)為,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)受體酪氨酸激酶3(NTRK3)基因與圓錐動(dòng)脈干畸形密切相關(guān),其表達(dá)在先天性心臟病患兒心肌組織中顯著減低。而PFO合并MA患者的NTRK3基因表達(dá)情況以及與臨床重要指標(biāo)和患者預(yù)后是否存在相關(guān)性的臨床研究較少。因此,本研究探討PFO合并MA患者的NTRK3基因表達(dá)情況,有助于臨床對(duì)PFO合并MA患者進(jìn)行針對(duì)性治療,并改善療效及預(yù)后。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年1月—2022年12月收治的86例確診PFO患者為研究對(duì)象,其中男42例,女44例; 年齡14～41歲,中位數(shù)年齡為25歲?；颊弑救嘶虮O(jiān)護(hù)人均書(shū)面簽署知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖聲學(xué)造影及經(jīng)食管超聲心動(dòng)圖診斷為PFO者; ② 符合MA診斷標(biāo)準(zhǔn)者, MA診斷依據(jù)國(guó)際頭疼協(xié)會(huì)2018年制定的《國(guó)際頭痛分類(lèi)指南(第3版)》[6]; ③ 臨床資料無(wú)缺失者。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 罹患有Fallot四聯(lián)癥、室間隔缺損等先天性心臟病者; ② 其他病因引起的繼發(fā)性MA者; ③ 合并肝、腎等重要臟器功能衰竭者; ④ 妊娠期和哺乳期患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 分組

86例確診PFO患者根據(jù)臨床癥狀不同分為2組: 合并MA組(共46例,合并有MA)、未合并MA組(共40例,確診未合并有MA)。此外,同時(shí)期選取40例健康體檢者作為對(duì)照組。3組研究對(duì)象的年齡、性別比、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、飲酒史、先天性心臟病家族史等資料比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.3 NTRK3基因檢測(cè)

分離外周血單個(gè)核細(xì)胞: 自肘靜脈抽取3 mL外周血,置于抗凝試管中,在分離白細(xì)胞后,應(yīng)用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞,混勻靜置約15 min后,以250 g離心5 min, 棄上清液取沉淀,予以磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次。

RNA提取與cDNA合成: ① 將含有核細(xì)胞的Trizol提取液種,加入150 μL氯仿混勻,置于4 ℃環(huán)境, 5 min后離心,上清液保留。② 在上清液中加入異丙醇后混勻,冰浴10 min離心, PBS洗滌3遍,沉淀保留。③ 將沉淀加75%乙醇,振蕩離心,吸除上清液,離心,再次吸出上清液, 65 ℃下烘干。④ 加入RNase-free水溶解沉淀。⑤ 使用紫外分光光度計(jì)對(duì)吸光度值進(jìn)行檢測(cè),測(cè)定總RAN濃度。⑥按照cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA, -70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

mRNA表達(dá): 以GAPDH作為內(nèi)參,進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增。反應(yīng)體系總體積20 μL, 反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性10 min, 95 ℃變性10 s, 58 ℃退火60 s, 74 ℃延伸30 s, 共40個(gè)循環(huán)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)NTRK3基因表達(dá)量,采用2-△△Ct表示。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4 超聲檢測(cè)指標(biāo)

本研究應(yīng)用經(jīng)食道心臟超聲檢查對(duì)PFO患者進(jìn)行檢測(cè)?；颊呷∽髠?cè)臥位姿勢(shì),探頭放置在左心房后方位置,并保持與房間隔垂直,確保房間隔清晰顯示。分別于靜息和Valsalva動(dòng)作狀態(tài)時(shí)指導(dǎo)患者呼氣放松,重點(diǎn)觀察孔道與左、右心房是否貫通,并完成孔道右房側(cè)、左房側(cè)直徑與孔道直徑的測(cè)定; 同時(shí)觀察有無(wú)通過(guò)卵圓孔的束狀彩色分流,計(jì)算孔道直徑大小并進(jìn)行分級(jí),標(biāo)準(zhǔn): ① 大定義為直徑>4 mm; ② 中定義為直徑2～4 mm; ③ 小定義為直徑<2 mm。

分別于靜息和Valsalva動(dòng)作狀態(tài)時(shí),取出現(xiàn)微泡的左心腔內(nèi)靜止超聲單幀圖像,存在持續(xù)性分流或殘余分流即為存在RLS, 分別計(jì)算靜息下RLS、Valsalva狀態(tài)下RLS。根據(jù)微泡數(shù)量進(jìn)行分級(jí),具體標(biāo)準(zhǔn): ① 陰性為未發(fā)現(xiàn)微泡; ② 少量分流為每幀少于10個(gè)微泡; ③ 中量分流為每幀10～30個(gè)微泡; ④ 大量分流為每幀大于30個(gè)微泡。

1.5 頭痛相關(guān)評(píng)分

本研究選用頭痛影響測(cè)驗(yàn)-6(HIT-6)評(píng)分與偏頭痛殘疾程度評(píng)價(jià)量表(MIDAS)評(píng)分來(lái)評(píng)估PFO合并MA患者頭痛程度。其中HIT-6評(píng)估患者遭受MA對(duì)生活工作以及身心健康的影響程度[7], 分值為36～78分,具體分級(jí): ① 嚴(yán)重影響, >60分; ② 重大影響, >55～60分; ③ 中等影響, 50～55分; ④無(wú)影響或輕微影響, 36～<50分。

采用MIDAS評(píng)估患者遭受MA對(duì)正常生活、學(xué)習(xí)、工作能力的影響程度[8], 總分為5項(xiàng)分值總和,具體項(xiàng)目: ① 嚴(yán)重頭痛不適導(dǎo)致正常生活、學(xué)習(xí)、工作效率下降顯著,達(dá)50%以上; ② 嚴(yán)重頭痛不適導(dǎo)致做家務(wù)效率下降顯著,達(dá)50%以上; ③ 近90 d內(nèi)由于嚴(yán)重頭痛不能支持日常生活、家務(wù); ④ 近90 d內(nèi)由于嚴(yán)重頭痛不能支持學(xué)習(xí)、工作; ⑤ 由于嚴(yán)重頭痛無(wú)法支持生活社交活動(dòng)。

1.6 隨訪(fǎng)

所有PFO合并MA患者均接受封堵術(shù)治療,出院后予以隨訪(fǎng),隨訪(fǎng)方式為主治醫(yī)師門(mén)診或電話(huà)隨訪(fǎng),隨訪(fǎng)間隔為2個(gè)月,了解患者頭痛緩解情況以及是否存在RLS現(xiàn)象,隨訪(fǎng)時(shí)間8～36個(gè)月,中位數(shù)為19個(gè)月。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 3組一般臨床指標(biāo)比較

3組年齡、性別比、體質(zhì)量指數(shù)、吸煙史、飲酒史、先天性心臟病家族史等資料比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見(jiàn)表2。

表2 3組一般臨床資料比較

2.2 3組NTRK3基因表達(dá)水平比較

合并MA組NTRK3基因的表達(dá)水平為(6.4±1.1), 未合并MA組為(8.2±0.8), 對(duì)照組為(10.8±1.9)。合并MA組與未合并MA組NTRK3基因表達(dá)水平低于對(duì)照組,且合并MA組低于未合并MA組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 見(jiàn)圖1。

與對(duì)照組比較, *P<0.05; 與未合并MA組比較, #P<0.05。圖1 3組NTRK3基因表達(dá)水平比較

2.3 未合并MA組和合并MA組PFO患者臨床指標(biāo)比較

合并MA組PFO患者靜息下RLS、HIT-6評(píng)分、MIDAS評(píng)分高于未合并MA組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 未合并MA組和合并MA組的PFO直徑、Valsalva下RLS比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見(jiàn)表3。

表3 未合并MA組和合并MA組臨床指標(biāo)比較

2.4 PFO合并MA患者的臨床指標(biāo)與NTRK3基因表達(dá)水平的相關(guān)分析

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示,NTRK3基因表達(dá)水平與PFO合并MA患者靜息下RLS、HIT-6評(píng)分、MIDAS評(píng)分存在負(fù)相關(guān)(P<0.05), 見(jiàn)表4。

表4 PFO合并MA患者臨床指標(biāo)與NTRK3基因表達(dá)水平的相關(guān)性分析

2.5 PFO合并MA患者預(yù)后結(jié)局影響因素的Logistic回歸分析

以PFO合并MA患者隨訪(fǎng)臨床癥狀消除為因變量,以年齡、先天性心臟病家族史、NTRK3基因表達(dá)水平、PFO直徑、靜息下RLS、Valsalva狀態(tài)下RLS、HIT-6評(píng)分、MIDAS評(píng)分為自變量,進(jìn)行多元Logistic回歸分析。結(jié)果表明,NTRK3基因表達(dá)水平是PFO合并MA患者隨訪(fǎng)臨床癥狀消除的保護(hù)性因素(OR=0.621,P=0.018), 見(jiàn)表5。

表5 PFO合并MA患者預(yù)后結(jié)局影響因素的Logistic回歸分析

3 討 論

PFO患者M(jìn)A患病率顯著高于普通人群,在行封堵術(shù)后患者M(jìn)A發(fā)生頻率以及程度一般均顯著改善, PFO與MA存在相關(guān)性已得到臨床公認(rèn)[2],但其具體病理生理機(jī)制仍尚不明確,目前較認(rèn)可的機(jī)制分析為PFO患者存在RLS現(xiàn)象,使靜脈微栓子進(jìn)入體循環(huán),導(dǎo)致反常栓塞,在腦皮質(zhì)中引起缺血微梗死,使得炎性因子擴(kuò)散到三叉神經(jīng)等部位引起頭痛[9]; 同時(shí)循環(huán)中炎性因子以及某些代謝產(chǎn)物也與微栓子一起,避過(guò)肺循環(huán)代謝,從而導(dǎo)致腦小動(dòng)脈閉塞,引起低灌注致使頭痛發(fā)作[10]。PFO是一種常見(jiàn)的先天性心臟病,因此其發(fā)病與基因突變和表達(dá)程度變化相關(guān)。既往研究[11]報(bào)道,單純PFO合并散發(fā)性偏癱性MA的患者遺傳基因分析顯示存在ATP1A2基因突變,這提示PFO合并MA患者可能確實(shí)存在某些基因表達(dá)的改變,但是具體基因改變尚不明確。

NTRK3基因編碼一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體。既往研究[12-13]顯示, NTRK3蛋白不僅在正常的神經(jīng)反射中發(fā)揮重要作用,而且在肺癌、肝癌等多種癌癥發(fā)展轉(zhuǎn)移中也起到重要作用。目前,根據(jù)蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)驗(yàn)證,NTRK3與PLAG1、PI3等多種蛋白質(zhì)編碼基因存在相互作用,能夠通過(guò)直接調(diào)節(jié)多種生長(zhǎng)因子干預(yù)細(xì)胞增殖過(guò)程,因此在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中具有重要作用[14]。近年來(lái),國(guó)外實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究[15]顯示,NTRK3敲除小鼠會(huì)導(dǎo)致一系列與人的心臟發(fā)育畸形相似的圓錐動(dòng)脈干畸形,如Fallot四聯(lián)癥、肺動(dòng)脈狹窄以及心內(nèi)膜管形成異常等。國(guó)外研究[16]顯示,NTRK3基因在轉(zhuǎn)錄以及蛋白水平的表達(dá)程度降低是Fallot四聯(lián)癥的發(fā)生機(jī)制之一,這表明NTRK3基因在神經(jīng)系統(tǒng)和心臟的發(fā)育中也具有重要效應(yīng)。然而PFO患者體內(nèi)NTRK3基因的表達(dá)水平變化相關(guān)臨床報(bào)道較少,因此本研究將NTRK3基因作為目標(biāo)基因,分析PFO合并MA患者臨床指標(biāo)以及接受封堵術(shù)后癥狀消除與NTRK3基因表達(dá)水平的相關(guān)性,以為進(jìn)一步在分子生物層面探討PFO合并MA發(fā)病機(jī)制提供新的思路。

為排除非研究因素對(duì)研究結(jié)果的干擾,本研究通過(guò)篩選研究對(duì)象,確保年齡、吸煙史、飲酒史以及先天性心臟病家族史等因素之間沒(méi)有差異,保證結(jié)果可靠性。本研究以臨床是否合并有MA為標(biāo)準(zhǔn),將PFO患者分組,并以普通體檢者為對(duì)照,結(jié)果顯示合并MA的PFO患者NTRK3基因表達(dá)水平最低,且正常體檢者NTRK3基因表達(dá)水平均高于PFO患者,這提示NTRK3基因表達(dá)水平與PFO合并MA患者存在相關(guān)性。進(jìn)一步分析2組PFO患者的臨床指標(biāo), 2組PFO直徑無(wú)差異,提示是否合并MA與PFO直徑?jīng)]有顯著相關(guān)性。合并MA的PFO患者靜息下RLS顯著較高,而Valsalva狀態(tài)下RLS無(wú)顯著差異,這提示靜息時(shí)RLS對(duì)MA發(fā)生頻率與程度存在相關(guān)性。而本研究發(fā)現(xiàn), PFO合并MA患者NTRK3基因表達(dá)水平與靜息下RLS存在負(fù)相關(guān),這可能是患者靜息下RLS的基因?qū)用姘l(fā)病機(jī)制之一,值得今后進(jìn)一步予以關(guān)注研究。通過(guò)多元Logistic回歸分析被證實(shí),NTRK3基因表達(dá)水平是PFO合并MA患者隨訪(fǎng)臨床癥狀消除的保護(hù)性因素,這說(shuō)明臨床可以通過(guò)分析患者NTRK3基因表達(dá)水平來(lái)預(yù)測(cè)封堵術(shù)后的臨床癥狀改善情況。

綜上所述, PFO合并MA患者的NTRK3基因表達(dá)水平降低,與患者重要臨床指標(biāo)和封堵術(shù)后預(yù)后均有顯著相關(guān)性,這為PFO合并MA患者今后的臨床診治提供了新思路。但本研究也有不足之處,未對(duì)NTRK3基因下游信號(hào)傳導(dǎo)通道以及引起的生物學(xué)變化與PFO合并MA進(jìn)行詳細(xì)探討,封堵術(shù)后PFO合并MA患者長(zhǎng)期NTRK3基因表達(dá)情況尚不能確定,還有待進(jìn)一步分析PFO合并MA患者NTRK3基因與其他基因的相互作用。