沉默調(diào)節(jié)蛋白1對脂多糖誘導(dǎo)大鼠Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞損傷的影響

陽 芳, 高 楓, 覃超群, 唐艷萍, 秦會平

(廣西壯族自治區(qū)桂林市人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科, 廣西 桂林, 541001)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是臨床上常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病,在中老年群體中發(fā)病率較高[1]。COPD的發(fā)病原因與顆粒物、化學(xué)物質(zhì)的吸入引發(fā)的慢性炎癥密切相關(guān),而細(xì)菌感染則是COPD急性加重的重要誘因[2]。Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(AEC2)是肺遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵組成細(xì)胞,參與肺泡上皮的修復(fù)和再生,在COPD疾病進(jìn)展過程中, AEC2細(xì)胞受損,并通過分泌多種細(xì)胞炎癥因子參與炎癥反應(yīng),但AEC2細(xì)胞炎性損傷的調(diào)控機(jī)制仍不清楚[3-5]。沉默調(diào)節(jié)蛋白1(SIRT1)是NAD+依賴的組蛋白去乙?；赋蓡T,參與細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的調(diào)控[6]。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)SIRT1在肺纖維化進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用,但SIRT1是否參與細(xì)菌感染等引發(fā)的AEC2細(xì)胞的炎性損傷的調(diào)控仍不清楚。本研究通過分離大鼠AEC2細(xì)胞,建立體外脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的AEC2損傷模型,觀察SIRT1在AEC2細(xì)胞炎性損傷中的表達(dá)水平的變化及敲低SIRT1對AEC2細(xì)胞損傷的影響,探討SIRT1在調(diào)控AEC2炎性損傷中的作用及機(jī)制,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

健康清潔級SD大鼠購自北京維通利華公司; IMDM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、Trizol試劑購自美國賽默飛世爾科技公司; SIRT1 shRNA慢病毒購自維真生物科技公司; CCK-8細(xì)胞活力試劑盒購自日本同仁化學(xué)公司; JC-1線粒體膜電位檢測探針、丙二醛(MDA)檢測試劑盒、總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技公司; 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時熒光定量PCR Mix購自南京諾唯贊生物科技公司; 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒購自美國eBioscience公司; LPS購自德國Merck公司; 兔抗SIRT1抗體、兔抗GAPDH抗體和HRP山羊抗兔IgG二抗購自美國CST公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠AEC2細(xì)胞分離及培養(yǎng): 大鼠原代AEC2細(xì)胞分離參考文獻(xiàn)[9]。健康雄性SD大鼠10只,經(jīng)腹腔注射3%戊巴比妥鈉(3 mg/kg)及肝素(400 U/kg), 而后經(jīng)肺動脈灌洗肺,取出肺組織,用剪刀剪碎后加入含胰蛋白酶的消化液中, 37 ℃震蕩20 min。細(xì)胞懸液加入含10% FBS的IMDM完全培養(yǎng)基終止消化,并加入預(yù)先包被IgG的培養(yǎng)皿中孵育1 h, 而后取出未貼壁的細(xì)胞,經(jīng)離心后加入IMDM完全培養(yǎng)基重懸,并放置在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng),獲得AEC2細(xì)胞。將ACE2細(xì)胞分為3組,對照組為正常培養(yǎng)的AEC2細(xì)胞,模型組和實(shí)驗(yàn)組分別用空白和SIRT1 shRNA慢病毒感染24 h后,再加入終濃度10 μg/mL LPS處理24 h, SIRT1 shRNA靶向序列為: 5′-GAAGTGCCTCAGATATTAA-3′。

1.2.2 實(shí)時熒光定量PCR檢測SIRT1、TNF-α、IL-1β表達(dá): 經(jīng)胰酶消化、離心收集AEC2細(xì)胞,經(jīng)Trizol裂解后,加入200 μL氯仿,經(jīng)12 000 g離心10 min, 取上清加入等體積異丙醇。充分混勻后, 12 000 g離心10 min, 采用70%乙醇漂洗RNA沉淀2次,用無核酸酶ddH2O溶解RNA。取1 μg總RNA, 用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA,方法參考產(chǎn)品說明書。以cDNA為模板,用實(shí)時熒光定量PCR試劑擴(kuò)增SIRT1、TNF-α和IL-1β, 以β-actin為內(nèi)參。所需引物序列為:SIRT1-F為5′-ATCTGACTTTGCTCCCCTTAACC-3′,SIRT1-R為5′-GGGCCCTGGTTGCAAGA-3′;TNF-α-F為5′-GTCGTAGCAAACCACCAAGC-3′,TNF-α-R為5′-TGTGGGTGAGGAGCACATAG-3′;IL-1β-F為5′-CCAGGATGAGGACCCAAGCA-3′,IL-1β-R為5′-TCCCGACCATTGCTGTTTCC-3′;β-actin-F為TCCTTCCTGGGCATGGAGT;β-actin-R為5′-ACTGTGTTGGCGTACAGGTC-3′。

1.2.3 Western blot檢測SIRT1表達(dá): 各組細(xì)胞經(jīng)RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解30 min, 12 000 g離心10 min, 取上清加入SDS上樣緩沖液, 100 ℃加熱煮沸10 min, 讓蛋白充分變性。用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白, 100 V恒壓電泳90 min。隨后用Bio-Rad半干轉(zhuǎn)膜槽將蛋白樣品轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,條件為25 V恒壓轉(zhuǎn)膜30 min。轉(zhuǎn)膜完成后,用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h, 后加入兔抗SIRT1抗體稀釋液(1∶1 000)或兔抗GAPDH抗體稀釋液(1∶3 000) 4 ℃孵育過夜,經(jīng)TBST緩沖液漂洗3次后,加入HRP山羊抗兔IgG稀釋液(1∶8 000)室溫孵育2 h, 最后用Bio-Rad凝膠成像儀獲取蛋白印跡圖像。

1.2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活力: 各組細(xì)胞培養(yǎng)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每組設(shè)置3個復(fù)孔。每孔加入10 μL CCK-8檢測液,繼續(xù)放置在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h, 后取出96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,用酶標(biāo)儀讀取450 nm處吸光值。

1.2.5 JC-1檢測線粒體膜電位: 細(xì)胞培養(yǎng)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,細(xì)胞分別加入500 μL JC-1溶液,在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育20 min后,棄掉培養(yǎng)基,再用1 mL緩沖液漂洗2次。染色完成后,胰酶消化、離心并重懸細(xì)胞,用BD Calibur流式細(xì)胞儀檢測FL-1及FL-2通道熒光信號,并計算FL-2/FL-1熒光強(qiáng)度比值。

1.2.6 ELISA實(shí)驗(yàn)檢測TNF-α、IL-1β的表達(dá): 細(xì)胞加入無血清IMDM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h, 收集培養(yǎng)基,在4 ℃、1 000 g條件下離心10 min。取上清,與標(biāo)準(zhǔn)品一起分別加入預(yù)先包被抗體的ELISA 96孔檢測板中,每孔100 μL, 4 ℃孵育2 h。隨后用漂洗緩沖液洗5次,依次加入檢測抗體、HRP二抗,4 ℃孵育2 h。最后加入顯色底物反應(yīng)15 min, 再加入終止液。采用酶標(biāo)儀讀取450 nm處吸光值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各組細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β濃度。

1.2.7 MDA檢測: 采用RIPA細(xì)胞裂解液裂解各組細(xì)胞,并配制50.0、25.0、10.0、5.0、2.5、1.0、0.5、0 nmol/mL濃度的MDA標(biāo)準(zhǔn)品,各取100 μL加入到1.5 mL離心管中,隨后每管加入200 μL MDA檢測工作液充分混勻,并用沸水浴加熱10 min。樣品經(jīng)1 000 g離心10 min后,將100 μL上清轉(zhuǎn)移到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,采用酶標(biāo)儀讀取532 nm吸光值,并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算各組MDA濃度。

1.2.8 SOD活力檢測: 采用SOD樣品制備液裂解各組細(xì)胞,并將制備100.0、50.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.0 U/mL SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。取20 μL細(xì)胞裂解液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,而后分別加入160 μL WST-8酶緩沖液和20 μL反應(yīng)啟動液, 37 ℃孵育30 min。最后用酶標(biāo)儀讀取450 nm處吸光度值,并計算各組SOD活力。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 LPS應(yīng)激對大鼠AEC2細(xì)胞SIRT1表達(dá)的影響

實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,模型組大鼠AEC2細(xì)胞SIRT1mRNA表達(dá)水平為(3.67±0.24), 高于對照組的(1.08±0.04), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.44,P<0.001)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,模型組大鼠AEC2細(xì)胞SIRT1蛋白表達(dá)水平也呈現(xiàn)升高趨勢。通過慢病毒轉(zhuǎn)染SIRT1 shRNA, 實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染SIRT1 shRNA慢病毒的實(shí)驗(yàn)組SIRT1mRNA表達(dá)水平下降[(3.67±0.24)與(2.13±0.29)], 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.09,P=0.002)。Western blot實(shí)驗(yàn)也表明,與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組SIRT1蛋白表達(dá)水平下降。見圖1。

圖1 Western blot檢測SIRT1表達(dá)水平

2.2 敲低SIRT1對細(xì)胞活性的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,模型組大鼠AEC2細(xì)胞在體外培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞活性為(0.44±0.03), 低于對照組的(0.98±0.06), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.94,P<0.001); 實(shí)驗(yàn)組大鼠AEC2細(xì)胞在體外培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞活性為(0.67±0.05), 高于模型組的(0.44±0.03), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.83,P=0.002)。

2.3 敲低SIRT1對TNF-α和IL-1β表達(dá)的影響

實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果表明,與對照組相比,模型組大鼠AEC2細(xì)胞TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表達(dá)水平均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.68,P=0.001;t=10.33,P<0.001); 與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組AEC2細(xì)胞TNF-αmRNA、IL-1βmRNA表達(dá)水平下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.29,P=0.030;t=3.021,P=0.04)。見圖2。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與對照組比較,模型組AEC2細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α、IL-1β水平均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.16,P<0.001;t=12.28,P<0.001); 與模型組比較,實(shí)驗(yàn)組AEC2細(xì)胞培養(yǎng)基中的TNF-α、IL-1β水平下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.22,P=0.006;t=3.46,P=0.03)。見表1。

表1 3組細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α及IL-1β水平比較 pg/mL

與對照組比較, *P<0.05; 與模型組比較, #P<0.05。圖2 3組TNF-α mRNA、IL-1β mRNA表達(dá)水平

2.4 敲低SIRT1對肺泡上皮細(xì)胞線粒體膜電勢的影響

流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,模型組AEC2細(xì)胞JC-1紅色熒光與綠色熒光信號比值(JC-1 FL2/JC-1 FL2)為(1.18±0.13), 低于對照組的(3.76±0.25),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.86,P<0.001), 表明線粒體膜電位下降; 實(shí)驗(yàn)組AEC2細(xì)胞JC-1 FL2/JC-1 FL2為(1.96±0.17), 高于模型組的(1.18±0.13), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=6.31,P=0.003), 表明線粒體膜電位升高。見圖3。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞線粒體膜電位

2.5 敲低SIRT1對細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

與對照組相比,模型組大鼠AEC2細(xì)胞MDA水平升高(t=5.04,P=0.007), SOD活性下降(t=4.44,P=0.012), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義; 與模型組相比,實(shí)驗(yàn)組大鼠AEC2細(xì)胞MDA水平下降(t=2.84,P=0.047), SOD活性升高(t=3.38,P=0.028), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3 3組細(xì)胞MDA、SOD水平比較

3 討 論

炎癥誘導(dǎo)的AEC2細(xì)胞損傷是COPD疾病進(jìn)展和急性加重的重要過程[10], 揭示AEC2細(xì)胞損傷的調(diào)控機(jī)制,可以為緩解相關(guān)疾病的進(jìn)展及治療提供新的干預(yù)手段。本研究發(fā)現(xiàn),在LPS誘導(dǎo)的大鼠AEC2炎性損傷過程中,SIRT1mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高,這提示SIRT1可能參與了AEC2細(xì)胞的炎性損傷,該結(jié)論進(jìn)一步通過對體外培養(yǎng)的AEC2細(xì)胞活性檢測實(shí)驗(yàn)證實(shí),即LPS模型大鼠AEC2細(xì)胞活性顯著低于對照組,通過轉(zhuǎn)染SIRT1 shRNA慢病毒可顯著下調(diào)AEC2細(xì)胞SIRT1的表達(dá),且在敲低SIRT1的AEC2細(xì)胞中,細(xì)胞活力得到恢復(fù)。該結(jié)果表明SIRT1是AEC2細(xì)胞炎性損傷的重要調(diào)節(jié)因子。

LPS主要由細(xì)胞的Toll樣受體4(TLR4)識別,并通過NF-κB和JNK/SAPK信號通路調(diào)控一系列細(xì)胞生理活動,如細(xì)胞因子分泌[11]、細(xì)胞凋亡[12]等,以響應(yīng)感染應(yīng)激。本研究發(fā)現(xiàn)模型組AEC2分泌的促炎因子TNF-α和IL-1β均升高,而敲低SIRT1則抑制了促炎因子的表達(dá)和分泌。線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量代謝中樞和細(xì)胞凋亡的調(diào)控中樞,正常情況下,線粒體內(nèi)膜兩側(cè)由不對稱分布的離子形成膜電位,以維持電子傳遞及氧化磷酸化[13]。本研究發(fā)現(xiàn), LPS誘導(dǎo)的AEC2炎癥損傷中,線粒體膜電位下降,且敲低SIRT1可以在一定程度上恢復(fù)線粒體膜電位。線粒體膜電位的下降導(dǎo)致氧化磷酸化解偶聯(lián),影響細(xì)胞能量代謝,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。該結(jié)果提示SIRT1可能調(diào)控了AEC2細(xì)胞線粒體起始的細(xì)胞凋亡。線粒體氧化磷酸化功能的異?？赡軙?dǎo)致細(xì)胞活性氧(ROS)積累,進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化,產(chǎn)生MDA[15]。本研究發(fā)現(xiàn),在LPS誘導(dǎo)的AEC2細(xì)胞損傷中, MDA水平顯著升高,而且負(fù)責(zé)清除ROS的SOD活性則呈現(xiàn)下降趨勢。敲低SIRT1的表達(dá)顯著抑制了MDA的升高,且部分恢復(fù)了SOD的活性,這表明SIRT1也參與了細(xì)胞氧化應(yīng)激的調(diào)控。研究[16]發(fā)現(xiàn)SIRT1可以通過對NF-κB p65亞基第310位賴氨酸殘基的去乙?；?抑制NF-κB信號通路,發(fā)揮抗炎的作用。本研究卻發(fā)現(xiàn)SIRT1在炎性誘導(dǎo)的AEC2細(xì)胞損傷中表達(dá)水平呈現(xiàn)上調(diào)趨勢,這提示SIRT1很可能參與了多種不同信號通路的調(diào)控。

綜上所述,本研究僅在細(xì)胞層面探討了SIRT1在LPS誘導(dǎo)AEC2細(xì)胞損傷的功能,發(fā)現(xiàn)了SIRT1對促炎因子分泌、線粒體膜電位和細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)的調(diào)控作用,表明SIRT1促進(jìn)了LPS誘導(dǎo)的AEC2細(xì)胞損傷,為細(xì)菌感染導(dǎo)致的COPD急性加重的治療提供了新的基礎(chǔ)。