早期肺腺癌組織中人天冬氨酸β-羥化酶、CD44V6的表達(dá)水平及臨床意義

卜小琨, 李京有, 程志華, 張鎖連

(煙臺(tái)業(yè)達(dá)醫(yī)院, 1. 心胸外科, 2. 病理科, 山東 煙臺(tái), 264004)

肺腺癌是最常見(jiàn)的肺癌類型,占肺癌總數(shù)的40%～50%, 其多數(shù)起源于支氣管黏膜上皮,少數(shù)起源于大支氣管的黏液腺[1-2]。肺腺癌早期缺乏特異性表現(xiàn),部分患者可出現(xiàn)咳嗽、痰中帶血、喘鳴、咯血等癥狀,而部分患者可無(wú)明顯癥狀,從而延誤診治,嚴(yán)重影響預(yù)后[3]。因此,尋找與早期肺腺癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的指標(biāo),對(duì)早期肺腺癌病情及預(yù)后判斷具有重大意義,或可為臨床治療提供新靶點(diǎn)。人天冬氨酸β-羥化酶(ASPH)是一種廣泛表達(dá)的Ⅱ型膜蛋白,研究[4]顯示ASPH可在腫瘤組織中呈陽(yáng)性表達(dá)。CD44V6是CD44跨膜蛋白分子的變異體,屬于細(xì)胞黏附分子,可影響癌細(xì)胞的黏附能力,從而調(diào)控癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[5]。本研究觀察早期肺腺癌組織中ASPH、CD44V6的表達(dá)情況,分析其與患者臨床病理特征的關(guān)系,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取煙臺(tái)業(yè)達(dá)醫(yī)院2016年10月—2022年6月收治的肺癌患者為研究對(duì)象,本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn): ① 符合《中國(guó)原發(fā)性肺癌診療規(guī)范(2015年版)》[6]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)者; ② 經(jīng)病理學(xué)檢查確定病理類型為腺癌者; ③ 根據(jù)第8版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)癌癥分期手冊(cè)pTNM分期為ⅠA期、ⅠB期且具備手術(shù)指征的肺腺癌患者(ⅠA期: 腫瘤最大徑≤3 cm, 無(wú)區(qū)域淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移; ⅠB期: 腫瘤最大徑>3～5 cm,無(wú)區(qū)域淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移); ④ 初診初治者; ⑤ 患者及家屬均知情本研究?jī)?nèi)容; ⑥ 有完整臨床資料和隨訪資料者。排除標(biāo)準(zhǔn): ① 合并其他惡性腫瘤者; ② 合并血液系統(tǒng)疾病者; ③ 非原發(fā)性肺癌者; ④ 術(shù)前曾行新輔助化療、放療或靶向藥物治療者; ⑤ 合并肝腎功能不全者; ⑥ 合并嚴(yán)重感染者。本研究共納入120例早期肺腺癌患者,其中男50例,女70例; 年齡48～80歲,平均(62.11±8.32)歲; 臨床分期為ⅠA期59例, ⅠB期61例。根據(jù)組織分化程度另配對(duì)30例患者,男14例,女16例; 年齡49～75歲,平均(60.53±5.61)歲。

1.2 方法

1.2.1 基線資料收集方法: 設(shè)計(jì)基線資料調(diào)查表,對(duì)所有早期肺腺癌患者基線資料進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查并統(tǒng)計(jì),包括性別(男、女),年齡(<60歲、≥60歲),臨床分期(ⅠA期、ⅠB期),分化程度(中高分化、低分化),既往吸煙史(有、無(wú)),腫瘤家族病史(有、無(wú)),體質(zhì)量指數(shù)(<24 kg/m2、≥24 kg/m2), 腫瘤部位(左葉、右葉),疾病類型(浸潤(rùn)性、微浸潤(rùn)性、原位)。

1.2.2 ASPH、CD44V6檢測(cè)方法: 所有組織標(biāo)本均使用全自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色系統(tǒng)(Roche Benchmark GX)進(jìn)行檢測(cè),采用Multimer Detection法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。所有標(biāo)本均使用福爾馬林液進(jìn)行固定,石蠟包埋,將4 μm厚石蠟切片脫蠟; 使用EDTA進(jìn)行抗原修復(fù),高溫5 min, 低溫15 min; 使用阻斷劑(Dako公司)孵育10 min; ASPH兔抗人單克隆抗體(工作液濃度1∶500, Abcam公司), CD44V6即用型鼠抗人單克隆抗體(Abcam公司),滴加二抗孵育30 min; 現(xiàn)用現(xiàn)配免疫顯色試劑(Dako公司)進(jìn)行顯色; 復(fù)染判讀結(jié)果。

1.2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判定: 由2名經(jīng)驗(yàn)超過(guò)5年的病理科醫(yī)師采用雙盲法對(duì)全部病理切片進(jìn)行閱片,在顯微鏡下觀察組織染色情況。判定ASPH陽(yáng)性表達(dá)為定位于細(xì)胞質(zhì),顏色為棕黃色; 判定CD44V6陽(yáng)性表達(dá)為定位于細(xì)胞膜,部分在細(xì)胞質(zhì),顏色為棕黃色。見(jiàn)圖1。

A: ASPH陽(yáng)性表達(dá); B: CD44V6陽(yáng)性表達(dá)。圖1 肺腺癌組織中ASPH、CD44V6陽(yáng)性表達(dá)(放大400倍)

1.2.4 隨訪: 所有患者于出院后完成3年隨訪,隨訪方式為電話或門診復(fù)查,每3個(gè)月1次。監(jiān)測(cè)并統(tǒng)計(jì)隨訪期間120例早期肺腺癌患者復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及病死情況,出現(xiàn)上述情況為預(yù)后不良,未出現(xiàn)則為預(yù)后良好。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 癌組織與癌旁組織中ASPH、CD44V6表達(dá)情況

癌組織中ASPH、CD44V6陽(yáng)性率均高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 癌組織與癌旁組織中ASPH、CD44V6表達(dá)情況[n(%)]

2.2 癌組織中ASPH表達(dá)與臨床特征關(guān)系

臨床分期為ⅠB期、分化程度為低分化的患者的癌組織中ASPH陽(yáng)性表達(dá)率高于臨床分期為ⅠA期、分化程度為中高分化的患者的癌組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 不同性別、年齡、既往吸煙史、腫瘤家族史、體質(zhì)量指數(shù)、腫瘤部位、疾病類型的患者的癌組織中ASPH陽(yáng)性表達(dá)率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 早期肺腺癌患者癌組織中ASPH表達(dá)與臨床特征關(guān)系[n(%)]

2.3 癌組織中CD44V6表達(dá)與臨床特征關(guān)系

年齡≥60歲、臨床分期為ⅠB期、分化程度為低分化的早期肺腺癌患者的癌組織中CD44V6陽(yáng)性表達(dá)率高于年齡<60歲、臨床分期為ⅠA期、分化程度為中高分化的患者的癌組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); 不同性別、既往吸煙史、腫瘤家族史、體質(zhì)量指數(shù)、腫瘤部位、疾病類型的患者的組織中CD44V6陽(yáng)性表達(dá)率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 早期肺腺癌患者組織中CD44V6表達(dá)與臨床特征關(guān)系[n(%)]

2.4 臨床分期、分化程度與ASPH表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Somers′d檢驗(yàn)結(jié)果顯示,臨床分期、分化程度與ASPH表達(dá)呈正相關(guān)(d=0.281、0.194,P=0.002、0.037)。

2.5 年齡、臨床分期、分化程度與CD44V6表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Somers′d檢驗(yàn)結(jié)果顯示,年齡、臨床分期、分化程度與CD44V6表達(dá)呈正相關(guān)(d=0.207、0.211、0.263,P=0.036、0.022、0.004)。

2.6 ASPH與CD44V6表達(dá)在早期肺腺癌中的相關(guān)性

經(jīng)卡方檢驗(yàn)Phi系數(shù)顯示, ASPH與CD44V6表達(dá)在早期肺腺癌中呈正相關(guān)(Phi=0.906,P<0.05)。

2.7 癌組織中ASPH、CD44V6表達(dá)情況與早期肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系

120例早期肺腺癌患者3年內(nèi)預(yù)后不良25例,占比20.83%。將ASPH與CD44V6表達(dá)情況作為自變量(ASPH表達(dá): 1=陽(yáng)性, 0=陰性; CD44V6表達(dá): 1=陽(yáng)性, 0=陰性),將早期肺腺癌患者預(yù)后情況作為因變量(1=預(yù)后不良, 0=預(yù)后良好)。Logistic回歸分析結(jié)果顯示, ASPH與CD44V6陽(yáng)性表達(dá)是早期肺腺癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素(OR>1,P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 Logistic回歸分析結(jié)果

2.8 癌組織中ASPH、CD44V6表達(dá)情況對(duì)早期肺腺癌患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值

將早期肺腺癌患者預(yù)后情況作為狀態(tài)變量(1=預(yù)后不良, 0=預(yù)后良好),將ASPH、CD44V6表達(dá)情況作為檢驗(yàn)變量; 繪制ROC曲線,結(jié)果顯示, ASPH、CD44V6表達(dá)預(yù)測(cè)早期肺腺癌患者預(yù)后的敏感度分別為0.960、0.920, 特異度分別為0.284、0.242。見(jiàn)圖2。

圖2 ASPH、CD44V6表達(dá)預(yù)測(cè)早期肺腺癌患者預(yù)后的ROC曲線圖

3 討 論

近年來(lái),肺腺癌的發(fā)病年齡有年輕化的趨勢(shì),提高診療效果、延長(zhǎng)患者生命及提高生活質(zhì)量一直是臨床治療肺癌的目標(biāo)[7]。然而,多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期,給臨床治療增加難度,且影響患者預(yù)后情況[8-9]。因此,尋找與早期肺腺癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的指標(biāo)意義重大。張繼宗等[10]研究發(fā)現(xiàn), ASPH的表達(dá)與腫瘤組織密切相關(guān),且可影響患者預(yù)后情況。CD44V6是機(jī)體組織中的一種分化抗原誘導(dǎo)因子,是含變異性外顯子v6編碼序列的CD44分子。張中超等[11]研究指出,組織中CD44V6的表達(dá)與癌癥患者臨床病理特征有關(guān)。由此推測(cè)ASPH、CD44V6表達(dá)可能與早期肺腺癌有關(guān),或可作為臨床評(píng)估患者預(yù)后及指導(dǎo)治療方案的有效腫瘤標(biāo)志物。

本研究結(jié)果顯示,癌組織中ASPH陽(yáng)性率高于癌旁組織,且與早期肺腺癌患者臨床分期及組織分化程度有關(guān),表明ASPH與早期肺腺癌的發(fā)生和發(fā)展具有關(guān)系。分析原因?yàn)? ASPH是一種高度保守的脫氧酶,其依賴于三羧酸循環(huán)的產(chǎn)物α-酮戊二酸,可在二價(jià)鐵存在的條件下羥化多種蛋白質(zhì),也可使表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子上的天冬氨酸或天冬酰胺殘基發(fā)生羥基化。表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子與細(xì)胞表面的表皮生長(zhǎng)因子受體結(jié)合,可啟動(dòng)細(xì)胞核內(nèi)的有關(guān)基因,從而促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖,在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、分化及運(yùn)動(dòng)中發(fā)揮重要作用。朱良炎等[12]研究結(jié)果顯示, ASPH在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為68.90%, 癌旁組織陽(yáng)性表達(dá)率為20.00%, 本研究結(jié)果與其結(jié)果一致,進(jìn)一步證實(shí)了ASPH表達(dá)與早期肺腺癌的關(guān)系。有研究[13]表明, ASPH表達(dá)水平與Notch信號(hào)通路的激活密切相關(guān), ⅠB期及低分化肺腺癌患者惡性程度更高,體內(nèi)Notch受體和配體表達(dá)水平更高,高度表達(dá)的Notch受體和配體刺激Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路,從而促使ASPH大量表達(dá)。

目前已有研究[14-15]報(bào)道, CD44與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移關(guān)系,陽(yáng)性表達(dá)者較易發(fā)生脈管浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,且生存率低,預(yù)后較差。本研究結(jié)果顯示,癌組織中CD44V6陽(yáng)性率均高于癌旁組織,且與早期肺腺癌患者年齡、臨床分期及組織分化程度有關(guān),這表明CD44V6的表達(dá)與早期肺腺癌的發(fā)生有關(guān),且在臨床進(jìn)展及癌細(xì)胞增殖分化中起到重要作用。分析原因?yàn)? CD44V6是CD44的一種變異體,在多種細(xì)胞和組織表面廣泛表達(dá),可參與腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞和宿主基質(zhì)的黏附,可通過(guò)與細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸、膠原蛋白、血管內(nèi)皮細(xì)胞等的黏附作用,賦予腫瘤細(xì)胞很強(qiáng)的生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移能力,從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[16]。因此, CD44V6可參與早期肺腺癌的發(fā)生。此外, CD44V6的上調(diào)可增強(qiáng)透明質(zhì)酸合成酶基因的表達(dá),從而促進(jìn)透明質(zhì)酸的合成,與透明質(zhì)酸結(jié)合的CD44V6可促進(jìn)PI3K/Akt信號(hào)通路,增加細(xì)胞凋亡,進(jìn)而調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[17]。由此可見(jiàn), CD44V6對(duì)疾病進(jìn)展及癌細(xì)胞的分化能力具有調(diào)控作用,且CD44V6的表達(dá)情況可能與患者病情有關(guān)。老年人群因?yàn)轶w內(nèi)T淋巴細(xì)胞減少,機(jī)體免疫力下降,對(duì)于癌細(xì)胞的清除能力大大降低,更應(yīng)該密切關(guān)注CD44V6表達(dá)情況。

本研究通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn), ASPH與CD44V6表達(dá)具有相關(guān)性,表明ASPH與CD44V6在早期肺腺癌中起到了協(xié)同作用。分析原因?yàn)? ASPH可對(duì)細(xì)胞外黏附分子進(jìn)行羥基化修飾,促使CD44V6的黏附作用增強(qiáng),從而共同促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)ASPH與CD44V6陽(yáng)性表達(dá)是早期肺腺癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素,具有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值,提示早期肺腺癌組織中ASPH與CD44V6陽(yáng)性表達(dá)可能對(duì)預(yù)后評(píng)估具有一定的意義。本研究不足之處為: 研究檢測(cè)的是癌組織中ASPH和CD44V6的表達(dá)情況,并未驗(yàn)證其是否與患者血液中ASPH和CD44V6的表達(dá)有關(guān),后續(xù)會(huì)擴(kuò)大樣本量,增加血液中ASPH和CD44V6的檢測(cè)以進(jìn)行深入研究,以驗(yàn)證聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于疾病評(píng)估和預(yù)后判斷的價(jià)值。

綜上所述,早期肺腺癌組織中ASPH和CD44V6陽(yáng)性表達(dá)率較高,且年齡、臨床分期、分化程度與CD44V6陽(yáng)性表達(dá)有關(guān),臨床分期、分化程度與ASPH陽(yáng)性表達(dá)有關(guān)。ASPH和CD44V6或可作為判斷早期肺腺癌病情發(fā)展的潛在標(biāo)志物。