組蛋白去甲基化酶KDM5A通過LncRNA TRIM52-AS1調控急性髓系白血病的發(fā)生和發(fā)展

高 莉, 李曉明 , 楊 波, 秦 英, 程 冬, 鄭麗飛, 李 里

(1. 四川省雅安市人民醫(yī)院 血液內科, 四川 雅安, 625000;2. 西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 血液內科, 四川 瀘州, 646000;3. 四川省攀枝花市中心醫(yī)院 藥學部, 四川 攀枝花, 617067)

急性髓系白血病(AML)是最常見的急性白血病,其主要特征是髓系細胞的異常增殖和分化, AML患者的5年生存率較低。因此,尋找可用于AML診斷和預后的新型生物標志物以及治療靶點,仍是目前需要解決的問題。長鏈非編碼RNA(LncRNA)參與多種生理過程,如細胞的增殖、凋亡和分化、造血、血管生成和病毒感染等[1]。LncRNA可在多種惡性腫瘤的發(fā)生中扮演癌基因或抑癌因子角色,且許多LncRNA與腫瘤的耐藥性高度相關。LncRNA的異常表達也可中斷機體的正常造血,從而導致包括AML在內的血液惡性腫瘤發(fā)生[2]。因此,探討LncRNA在AML中的作用將有助于AML的早期診斷,改善患者的臨床預后,并且為該病的治療提供新思路和方案。

組蛋白的甲基化是一種強大的表觀遺傳標記,可修飾組蛋白N末端的賴氨酸和精氨酸殘基。組蛋白甲基化的建立和維持受位點特異性組蛋白甲基轉移酶(HMTs)和組蛋白去甲基化酶(HDMs)的動態(tài)調控。組蛋白賴氨酸的甲基化在包括異染色質形成、轉錄沉默和轉錄激活、DNA重組和DNA修復在內的多種生物學功能中具有重要作用[3]。H3K4me3是一個最常見的組蛋白甲基化信號,并主要被賴氨酸特異性去甲基化酶5(KDM5)家族蛋白去除,包括KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D。其中KDM5A和KDM5B被報道[4]在多種癌癥中上調。LncRNA TRIM52-AS1已被確定在腎癌細胞中有著調節(jié)細胞增殖、遷移和凋亡的作用。但TRIM52-AS1在AML中的確切作用和調控機制仍不明確[5-6]。本研究鑒定了組蛋白去甲基化酶KDM5A通過LncRNA TRIM52-AS1在AML細胞HL-60中,調控HL-60增殖和遷移。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集四川省雅安市人民醫(yī)院26例AML患者(AML組)及同期健康體檢者26例(正常組)作為研究對象。本研究經四川省雅安市人民醫(yī)院倫理委員會批準同意,所有納入個體均簽署書面知情同意書。

1.2 細胞培養(yǎng)和轉染

本研究中使用的ARH-77、HL-60、K-562和KG-1細胞系均購自中國科學院上海生科院細胞資源中心, ARH-77細胞使用RPMI-1640培養(yǎng)基(Gibco), HL-60、K-562和KG-1細胞均使用IMDM培養(yǎng)基(Sigma)。培養(yǎng)基中均需加入10%胎牛血清(Excell), 置于37 ℃含有5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育。采用下文“1.3”及“1.4”中實驗方法檢測上述4種細胞系的KDM5AmRNA與其蛋白表達以及TRIM52-AS1 mRNA表達,篩選KDM5AmRNA與其蛋白表達較高及TRIM52-AS1 mRNA表達表達較低的細胞系進行下一步研究。

細胞轉染試劑使用Lipofectamine 3000 (Invitrogen), 操作方法參照該產品說明。按照5×104個細胞/孔的密度將細胞接種到12孔板中,待細胞完全貼壁且達到約60%匯合度時進行細胞轉染。將細胞分為空白對照組(NC組)、敲低對照組(sh-NC組)、敲低KDM5A組(sh-KDM5A組)、過表達對照組(OE-NC組)、TRIM52-AS1過表達組(OE-TRIM52-AS1組)、敲低KDM5A+過表達TRIM52-AS1組(sh-KDM5A+ OE-TRIM52-AS1組)。

1.3 逆轉錄定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)

血清或細胞總RNA提取使用Tiangen公司試劑盒,抽提步驟參照試劑盒說明書。使用Thermo Fisher的Nanodrop 2000機器對抽提所得總RNA進行質檢并測量RNA的濃度。隨后將1 μg的RNA逆轉錄為cDNA, 使用Promega的MMLV試劑盒。逆轉錄反應體系和逆轉錄反應程序參考Promega的產品說明。使用無RNase水(GE Healthcare)將逆轉錄得到的cDNA稀釋10倍,并作為模板進行qRT-PCR檢測,qRT-PCR實驗使用Bio-rad的SYBR Green熒光定量試劑盒,擴增條件為: 50 ℃ 2 min, 95 ℃ 2 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 40個循環(huán)。KDM5A上游引物序列: 5′-TTACCAACAGGTCAGACGCAT; 下游引物: 5′-GGTTTGCTACATTCCTCGGCG。TRIM52-AS1上游引物序列: 5′-GGTCTTTGGTTATCTAGCTGTATGA; 下游引物序列: 5′-GGTCTGTGCTAGATCAAAAGGCA。內參基因為GAPDH。實驗重復3次。

1.4 蛋白質印跡法(Western blot)

使用RIPA裂解液(Beyotine)處理細胞, 4 ℃孵育30 min, 收集細胞裂解液至1.5 mL的EP管中, 12 000 g 4 ℃離心15 min, 收集上清。向細胞裂解液中加入蛋白loading buffer煮沸5 min, 通過10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE, 0.3 A、20 V)將20 mg的蛋白樣品電轉至PVDF膜(Millipore)上。5%脫脂奶粉(BD)封閉1 h, 分別加入TBST(Coolaber)稀釋的KDM5A兔抗(Abcam, ab70892, 稀釋比例1∶1 000)和GAPDH兔抗(CST, 5174, 稀釋比例1∶3 000), 4 ℃孵育過夜, TBST洗膜3次,加入HRP標記的羊抗兔二抗(Abcam, ab6721, 稀釋比例1∶5 000), 室溫孵育1 h, TBST洗膜6次。ECL顯色液顯影。實驗重復3次。

1.5 熒光素酶報告實驗

將HL-60細胞接種于24孔板內,培養(yǎng)24 h。人工構建TRIM52-AS1野生型啟動子雙熒光素酶報告基因載體pGL4.10-hRluc, 將TRIM52-AS1預測結合位點突變的突變體Mut-TRIM52-AS1和KDM5A雙熒光素酶報告基因載體共同轉染HL-60細胞。孵育48 h后,吸出培養(yǎng)基,加入1×PLB裂解液室溫搖床充分裂解以收集細胞,使用Promega海腎熒光素酶報告基因檢測試劑盒以及熒光素酶底物發(fā)光檢測儀進行檢測,根據產品和儀器使用說明操作。實驗重復3次。

1.6 CCK8實驗

將待檢測的HL-60細胞按照5 000個細胞/孔的密度接種到96孔板中,培養(yǎng)24 h。加入10 μL CCK8(MCE), 置于37 ℃含有5% CO2的培養(yǎng)箱孵育2 h, 2 h使用Thermo Fisher的K3酶標儀檢測490 nm處吸光值,并根據吸光值計算細胞增殖率。實驗重復3次。

1.7 Transwell實驗

將待檢測的HL-60細胞分別制備成濃度為2×108個細胞/mL的細胞懸液; 取細胞懸液200 μL加入Transwell小室(Corning), 下室為培養(yǎng)基600 μL。孵育18 h后,取出Transwell小室,擦除室內殘余細胞,甲醇固定膜外細胞,吉姆薩(Sigma)染色,在倒置顯微鏡下觀察并拍照,每孔取5個視野進行統(tǒng)計。實驗重復3次。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結 果

2.1 KDM5A和TRIM52-AS1在白血病細胞中異常表達

qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn),組蛋白去甲基化酶KDM5AmRNA在AML組患者血清中表達高于正常組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖1A。TRIM52-AS1 mRNA在AML組中表達低于正常組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖1B。在白血病細胞ARH-77、HL-60、K-562和KG-1中, HL-60的KDM5AmRNA及其蛋白表達較高, TRIM52-AS1 mRNA表達較低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖1C、1D。選擇HL-60細胞進行下一步研究。

A: qRT-PCR檢測AML患者的血清中KDM5A mRNA的表達,與正常組比較, *P<0.05; B: qRT-PCR檢測AML患者的血清中TRIM52-AS1 mRNA的表達,與正常組比較, *P<0.05; C: qRT-PCR檢測白血病細胞中KDM5A和TRIM52-AS1 mRNA的表達,與ARH-77比較, *P<0.05; D: Western blot檢測白血病細胞中KDM5A蛋白的表達。圖1 KDM5A和TRIM52-AS1在白血病細胞中異常表達

2.2 TRIM52-AS1抑制白血病細胞的增殖和遷移

本研究在HL-60細胞經轉染成功過表達TRIM52-AS1, TRIM52-AS1過表達組的TRIM52-AS1表達增高(P<0.05), 見圖2A。通過CCK8實驗發(fā)現(xiàn),與空白對照組、過表達對照組比較, TRIM52-AS1過表達組的增殖速率減緩,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖2B。通過Transwell實驗發(fā)現(xiàn),與空白對照組、過表達對照組比較, TRIM52-AS1過表達組細胞遷移被抑制,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖2C。

A: qRT-PCR檢測TRIM52-AS1的過表達; B: CCK8實驗檢測過表達TRIM52-AS1后, HL-60細胞的增殖情況; C: Transwell實驗檢測過表達TRIM52-AS1后, HL-60細胞的遷移情況。與過表達對照組比較, *P<0.05。所有實驗均重復3次。圖2 TRIM52-AS1抑制白血病細胞的增殖和遷移

2.3 KDM5A靶向抑制TRIM52-AS1

通過qRT-PCR和Western blot, 本研究在HL-60細胞系中敲低KDM5A, 與敲低對照組比較,敲低KDM5A組的KDM5A表達降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3A、3B)。敲低KDM5A后,發(fā)現(xiàn)TRIM52-AS1表達上調,與敲低對照組比較,敲低KDM5A組的TRIM52-AS1表達增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖3C。通過熒光素酶報告實驗,本研究鑒定了KDM5A可以靶向抑制TRIM52-AS1。由于TRIM52-AS1受到KDM5A的調控,以上結果提示KDM5A或可通過靶向TRIM52-AS1來調控AML的增殖和遷移。

A: qRT-PCR檢測KDM5A的敲低效率; B: Western blot檢測KDM5A的敲低效率; C: qRT-PCR檢測敲低KDM5A后TRIM52-AS1的表達情況; D: 熒光素酶報告實驗檢測KDM5A對TRIM52-AS1的靶向調控。與敲低對照組比較, *P<0.05。所有實驗均重復3次。圖3 KDM5A靶向抑制TRIM52-AS1

2.4 KDM5A通過抑制TRIM52-AS1抑制HL-60細胞增殖和遷移

與空白對照組比較,敲低KDM5A組的KDM5A表達降低,敲低KDM5A組+ TRIM52-AS1過表達組的TRIM52-AS1表達增高; 與TRIM52-AS1過表達組比較,敲低KDM5A組+TRIM52-AS1過表達組的KDM5A表達降低, TRIM52-AS1表達增高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 見圖4A。通過CCK8實驗,敲低KDM5A后, HL-60細胞增殖能力增強,與敲低對照組比較,敲低KDM5A組細胞增殖能力增強,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 過表達TRIM52-AS1后, HL-60細胞的增殖能力減弱,與過表達對照組比較, TRIM52-AS1過表達組的細胞增殖能力減弱,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 敲低KDM5A組+TRIM52-AS1過表達組細胞的增殖能力恢復到正常細胞的增殖水平,見圖4B。通過Transwell實驗發(fā)現(xiàn),敲低KDM5A后,HL-60細胞遷移能力增強,與敲低對照組比較,敲低KDM5A組細胞遷移增強,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05), 敲低KDM5A組+TRIM52-AS1過表達組細胞遷移能力恢復到正常細胞的增殖水平,見圖4C。因此KDM5A抑制TRIM52-AS1可能導致AML增殖和遷移水平受到顯著抑制。

A: qRT-PCR檢測各組細胞的KDM5A和TRIM52-AS1表達; B: CCK8實驗檢測各組細胞增殖; C: Transwell實驗檢測各組細胞遷移。兩兩比較, *P<0.05。所有實驗均重復3次。圖4 KDM5A通過抑制TRIM52-AS1抑制HL-60細胞增殖和遷移

3 討 論

AML具有易復發(fā)、易產生化療耐藥共2大特點,因此迫切需要尋找可用于早期診斷AML的新生物標志物[7-8]。研究[9-10]表明, LncRNA參與調控多種AML相關基因的表達,從而促進或抑制AML的發(fā)生發(fā)展。LncRNA也被確定為白血病的潛在生物標志物,其動態(tài)變化可能與AML的分期高度相關[11-13]。LncRNA靶向治療為AML患者提供了新的治療策略和個體化的治療方案。但LncRNA作為生物標志物尚未作為常規(guī)檢測項目,因此也并未廣泛應用于臨床檢測中。此外,基于LncRNA的靶向治療也僅限于臨床前研究[14]。

KDM5A是一種三甲基化H3K4特異性的組蛋白去甲基化酶。KDM5A的異位表達會降低H3K4me3/me2的整體水平。研究[15]證實,KDM5A是通過與其靶基因的啟動子結合發(fā)揮轉錄抑制因子的功能,并在細胞分化中發(fā)揮重要作用。在免疫細胞的活化過程中,KDM5A與細胞因子信號轉導抑制因子1(SOCS1)啟動子區(qū)結合,導致其H3K4me3修飾和基因轉錄水平顯著下降。研究[16]表明,在骨髓間充質干細胞中過表達KDM5A可以通過降低RUNX2啟動子上H3K4me3水平抑制BMP2誘導的成骨。敲除KDM5A導致人脂肪間充質干細胞hASCs中堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(OCN)和成骨細胞特異性轉錄因子osterix(OSX)表達顯著增加[17]。TRIM52-AS1發(fā)揮其正常生物學功能的同時還可以通過LncRNA "molecular sponge"的這一特性參與調控其靶基因表達。既往研究[18]發(fā)現(xiàn),TRIM52-AS1可以招募miR-514a-5p,并通過上調MRPS18A從而促進原發(fā)性肝癌(HCC)發(fā)生發(fā)展,其潛在機制是TRIM52-AS1通過競爭性結合miR-514a5p上調MRPS18A表達。本研究雖沒有找出TRIM52-AS1參與調控的其他靶基因,但發(fā)現(xiàn)TRIM52-AS1可以抑制白血病細胞HL-60的增殖和遷移,且發(fā)現(xiàn)KDM5A可作為TRIM52-AS1的上游,靶向抑制TRIM52-AS1的表達。因此KDM5A可以通過抑制TRIM52-AS1進而促進白血病細胞的增殖和遷移,在白血病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。本研究初步發(fā)現(xiàn)了一個新的可以用于AML患者早期篩查和臨床治療的靶點,但KDM5A和TRIM52-AS1是否可廣泛應用于臨床,還要深入研究和探討。