淡竹葉多糖的制備、熱穩(wěn)定性及其抗氧化活性

邢慧珍，張玉梅，劉會(huì)平，喬賽鳳

（天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457）

多糖是指由10 個(gè)或10 個(gè)以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的大分子物質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中[1]，可分為動(dòng)物多糖、植物多糖或真菌多糖[2]。大量研究發(fā)現(xiàn)，多糖具有抗腫瘤[3]、抗氧化[4]、抗凝血[5]、調(diào)節(jié)腸道菌群等生物活性功能。不同提取方法、樣品來源均會(huì)影響多糖的生物活性和結(jié)構(gòu)特征[6]。常用的多糖提取方法有水提法、酶解輔助提取法、超聲波輔助提取法、酸堿浸提法和微波輔助提取法等。

淡竹葉（Lophatherum gracileBrongn.）是多年生草本植物的莖葉，是一種藥食同源的食材，屬被子植物門、單子葉植物綱、禾本科、淡竹葉屬，通常生長(zhǎng)在山坡下陰濕處，廣泛分布在我國長(zhǎng)江以南地區(qū)[7]。淡竹葉別名有碎骨子、山雞米、迷身草和竹葉卷心等。對(duì)淡竹葉的記載首次出現(xiàn)在《滇南本草》，《本草綱目》首次記錄了淡竹葉的形態(tài)特征。淡竹葉性味甘淡，可作藥用，具有清熱止渴、利尿通淋的功效，通常應(yīng)用于熱病煩渴、小便短赤澀痛、痛頭風(fēng)、吐血等病癥的治療，民間大多使用淡竹葉莖葉制作涼茶來飲用。淡竹葉也可直接食用，可與粥一起煮食或者將淡竹葉煮水飲用。淡竹葉中含有大量的黃酮類、多糖類、氨基酸、葉綠素、微量元素等成分，使淡竹葉具有抗衰老、抗氧化、抗腫瘤等作用[8-10]。

研究者對(duì)淡竹葉的研究大部分集中在淡竹葉的化學(xué)成分分析和營養(yǎng)價(jià)值方面，而對(duì)淡竹葉多糖熱穩(wěn)定性和抗氧化活性的研究鮮有研究。由于水提法具有操作簡(jiǎn)單、成本較低和不會(huì)對(duì)多糖結(jié)構(gòu)造成破壞的優(yōu)點(diǎn)，本研究選用水提法來提取淡竹葉多糖，并通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，分離純化后得到一種新型的淡竹葉多糖（Lophatherum gracileBrongn.polysaccharide，LGP），分析其熱穩(wěn)定性和抗氧化活性，為淡竹葉多糖的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淡竹葉：市售；三氯甲烷、三氟乙酸、無水乙醇、正丁醇、甲醇：江天化工技術(shù)股份有限公司；T 系列葡聚糖：北京索萊寶科技有限公司；間羥基聯(lián)苯、考馬斯亮藍(lán)-G250、牛血清蛋白：北京索萊寶科技有限公司；葡聚糖凝膠Sephadex G-200：上海源葉生物科技有限公司；單糖標(biāo)品（鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖醛酸等）：美國Sigma 公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DZF-6020 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；SE-750 型高速粉碎機(jī)：浙江永康市圣象電器有限公司；TDZ5-WS 型低速離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀儀器有限公司；FD-1A-50 型冷凍干燥機(jī)：上海比朗儀器制造有限公司；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；1200 型高效液相色譜（high performance liquid chromatograph，HPLC）儀：安捷倫科技有限公司；UV-2550PC 型紫外可見光分光光度計(jì)、60Plus 型差示掃描量熱儀：日本島津公司；HGC-12A 型氮吹儀：天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；ICS-5000 型離子色譜儀：戴安中國有限公司；TGA-Q500 型熱重分析儀：美國TA 公司；Synergy HTX 型多功能酶標(biāo)儀：美國博騰公司。

1.3 淡竹葉多糖的提取工藝優(yōu)化

1.3.1 淡竹葉的預(yù)處理

將淡竹葉放入烘箱進(jìn)行干燥，粉碎成粉末狀后用80 目篩網(wǎng)過濾，淡竹葉粉末在索氏抽提裝置中使用石油醚進(jìn)行脫脂處理，之后在60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中進(jìn)行干燥，時(shí)間為72 h[11]。

1.3.2 淡竹葉粗多糖的提取工藝流程

處理后的淡竹葉脫脂粉末與蒸餾水按照一定的液料比在100 ℃條件下多次萃取，冷卻至室溫后進(jìn)行離心（4 000 r/min 離心15 min）、過濾，將上清液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其體積濃縮至原來的1/4 后與無水乙醇按照比例進(jìn)行混合，放入4 ℃冰箱過夜，第2 天對(duì)混合液進(jìn)行離心處理，小心倒掉上清液，獲得的醇沉沉淀物即為淡竹葉粗多糖[12]。粗多糖得率（D，%）按照下面的公式進(jìn)行計(jì)算。

式中：M1為淡竹葉粗多糖質(zhì)量，g；M2為淡竹葉粉末樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

提取溫度定為100 ℃，考察液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)和醇沉濃度4 個(gè)因素對(duì)淡竹葉粗多糖得率的影響。

1）液料比分別設(shè)定為10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1（mL/g），浸提2 h，提取次數(shù)為2，醇沉濃度為60%。

2）提取時(shí)間分別設(shè)定為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，液料比為30 ∶1（mL/g），提取次數(shù)為2，醇沉濃度為60%。

3）提取次數(shù)分別設(shè)定為1、2、3、4、5，浸提2 h，液料比為30 ∶1（mL/g），醇沉濃度為60%。

4）醇沉濃度分別設(shè)定為40%、50%、60%、70%、80%，液料比為30 ∶1（mL/g），浸提2 h，提取次數(shù)為2。

1.3.4 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken 原理，選取液料比、提取時(shí)間和醇沉濃度為自變量，淡竹葉粗多糖得率（Y）為響應(yīng)值，做三因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)，優(yōu)化淡竹葉粗多糖的提取工藝。響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface design

1.4 淡竹葉多糖的分離純化

1.4.1 淡竹葉粗多糖的分子量分布

準(zhǔn)確稱取淡竹葉粗多糖2 mg，溶于2 mL 超純水中，使用漩渦混勻儀將粗多糖充分溶解，過0.22 μm 濾膜，使用高效液相色譜儀對(duì)淡竹葉粗多糖的分子量分布進(jìn)行檢測(cè)分析。檢測(cè)條件：選用RID 檢測(cè)器，設(shè)置檢測(cè)器的溫度為35 ℃，柱溫設(shè)定為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL（1 mg/mL），流動(dòng)相使用超純水，流速設(shè)置為0.6mL/min。

1.4.2 淡竹葉多糖的純化

將淡竹葉粗多糖溶液去除酒精后，用蒸餾水復(fù)溶，通過離心（8 000 r/min，10 min）去除雜質(zhì)。然后用sevag法[正丁醇∶三氯甲烷=4 ∶1（體積比）]去除粗多糖中的蛋白質(zhì)[13]，除去蛋白質(zhì)后使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除sevag 試劑，之后用蒸餾水在4 ℃條件下透析3 d（截留相對(duì)分子量為10 000 Da）。用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行干燥收集多糖，收集后的多糖用蒸餾水配制成20 mg/mL 的多糖溶液，過膜后用Sephadex G-200 凝膠柱（1.6 cm×40 cm）進(jìn)一步純化多糖，收集洗脫曲線最高峰的那一管，冷卻干燥后得到淡竹葉多糖，命名為L(zhǎng)GP。

1.4.3 淡竹葉多糖（LGP）的純度鑒定

1.4.3.1 基本成分測(cè)定

以D-葡萄糖作為標(biāo)品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定淡竹葉粗多糖和LGP 的總糖含量[14]；還原糖含量測(cè)定采用3，5-二硝基水楊酸法[15]；以半乳糖醛酸為標(biāo)品，多糖中糖醛酸含量的測(cè)定采用間羥基連苯法[16]；以牛血清蛋白為標(biāo)品，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定多糖中的蛋白質(zhì)含量[17]。

1.4.3.2 LGP 的分子量測(cè)定

LGP 的相對(duì)分子量使用高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法測(cè)定。將1 mg 的淡竹葉多糖樣品溶于1 mL 的超純水中，使用漩渦混勻儀渦旋后過0.22 μm 濾膜，使用高效液相色譜儀檢測(cè)。將T 系列（T-3、T-10、T-70、T-100、T-300、T-500、T-2000）葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成1 mg/mL的溶液，根據(jù)其分子量和保留時(shí)間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，將測(cè)得的LGP 的保留時(shí)間代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到LGP的相對(duì)分子量[18]。

1.4.3.3 LGP 的紫外全波段掃描

準(zhǔn)確稱取1 mg 的LGP，溶于10 mL 蒸餾水中，配制成濃度為0.1 mg/mL 的淡竹葉多糖溶液，空白對(duì)照組選用蒸餾水，使用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，選取的波長(zhǎng)范圍為200～400 nm。

1.5 淡竹葉多糖的單糖組成測(cè)定

1.5.1 多糖降解

稱取5 mg 的LGP，將其溶于1 mL 的三氟乙酸（2 mol/L）中，混勻后在油浴鍋（110 ℃）中油浴3 h，反應(yīng)結(jié)束后在室溫條件下自然冷卻，使用氮?dú)鈱⑷芤捍蹈?。為了除去多糖溶液中殘留的三氟乙酸，需要加?.5 mL 甲醇后再使用氮吹儀吹干，反復(fù)3 次直至完全除凈。

1.5.2 檢測(cè)單糖組成

單糖組成通過離子色譜法（ion chromatography，IC）來測(cè)定，參考文獻(xiàn)[19]的方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。使用超純水將完全溶解后的多糖溶液稀釋成濃度為0.1 mg/mL 的溶液。準(zhǔn)確稱取巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸10 種單糖標(biāo)品各1 mg，使用超純水將其配制成濃度為0.05 mg/mL 的單糖標(biāo)品混合溶液。制備得到的多糖溶液與單糖標(biāo)品分別使用0.22 μm 濾膜和RP-10 柱處理后，采用離子色譜儀檢測(cè)。

1.6 淡竹葉多糖熱穩(wěn)定性的測(cè)定

1.6.1 LGP 的差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）測(cè)定

精準(zhǔn)稱取4 mg 的LGP 樣品，用壓片機(jī)處理后放入樣品池中，使用差示掃描量熱分析儀在25～200 ℃范圍進(jìn)行檢測(cè)，升溫速率為10 ℃/min。

1.6.2 LGP 的熱重（thermogravimetric analyzer，TGA）測(cè)定

稱取LGP 樣品5 mg，將其放入托盤中，托盤邊緣不能有余留，使用熱重分析儀測(cè)定LGP 的熱穩(wěn)定性。測(cè)定條件如下：通入的氣體為氮?dú)?，設(shè)置儀器溫度范圍為25～600 ℃，升溫速率為20 ℃/min。

1.7 淡竹葉多糖的抗氧化活性測(cè)定

準(zhǔn)確稱取淡竹葉純多糖100 mg，使用10 mL 蒸餾水將其溶解，得到10 mg/mL 的淡竹葉多糖溶液，之后分別稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.6、3.2、6.4、8.0 mg/mL的淡竹葉多糖溶液。選用VC作為陽性對(duì)照。

1.7.1 LGP 對(duì)DPPH·的清除能力

參考文獻(xiàn)[20]的方法，向試管中分別加入1 mL 不同濃度的淡竹葉多糖溶液，再加入5 mL DPPH 溶液（0.2 mmol/L），充分混合后在避光條件下反應(yīng)30 min，設(shè)置酶標(biāo)儀參數(shù)，檢測(cè)其在517 nm 處的吸光度。按照式（2）計(jì)算DPPH 自由基的清除率（RDPPH，%）。

式中：Ai為樣品+DPPH 溶液的吸光度；Aj為樣品+蒸餾水的吸光度；A0為蒸餾水+DPPH 的吸光度。

1.7.2 LGP 對(duì)·OH 的清除能力

取8 支干凈的10 mL 試管，向其中添加不同濃度的LGP 溶液（1 mL），再依次加入等體積的FeSO4（6 mmol/L）、水楊酸-乙醇溶液（6 mmol/L）和H2O2溶液（6 mmol/L），混合均勻后在37 ℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min，使用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在510 nm 處的吸光度[21]。按照式（3）計(jì)算·OH 的清除率（ROH，%）。

式中：Ai為加入樣品溶液的吸光度；Aj為將H2O2替換成去離子水的吸光度；A0為將樣品替換成去離子水的吸光度。

1.7.3 LGP 的ABTS+自由基的清除能力

將7 mmol/L 的ABTS 溶液與2.45 mmol/L 過硫酸鉀溶液等體積混合，避光反應(yīng)24 h，向混合液中加入無水乙醇，將其吸光度調(diào)節(jié)至0.70±0.02，得到ABTS 工作液。分別加入不同濃度的LGP 溶液（0.4 mL），然后加入4 mL 的ABTS 工作液，反應(yīng)5 min，測(cè)量其在734 nm處的吸光度[22]。按照式（4）計(jì)算ABTS＋自由基清除率（RABTS+，%）。

式中：Ai為樣品+ABTS 工作液的吸光度；Aj為樣品+蒸餾水的吸光度；A0為蒸餾水+ABTS 工作液的吸光度。

1.7.4 LGP 的還原力測(cè)定

向試管中加入不同濃度的LGP 溶液（0.5 mL）和2.5 mL 的磷酸沖液緩（0.2 mol/L，pH6.6），最后加入2.5 mL 的鐵氰化鉀溶液（1%），50 ℃恒溫水浴20 min，室溫靜置反應(yīng)10 min，再加入三氯乙酸（2.5 mL，10%），將混合物離心（3 000 r/min，10 min）以獲得上層。取2.5 mL 的上層溶液，向其中加入蒸餾水（2.5 mL）和0.1%氯化鐵（0.5 mL），反應(yīng)10 min，選擇酶標(biāo)儀測(cè)定其在700 nm 處的吸光度[23]。按照式（5）計(jì)算LGP 的還原能力（ΔA）。

式中：A為樣品組的吸光度；A0為VC組的吸光度。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)重復(fù)3 次以上，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 26.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性選擇單因素方差分析（ANOVA）說明；使用Origin 2018 軟件處理圖表。P<0.05 表明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 不同液料比對(duì)淡竹葉粗多糖得率的影響

在多糖提取過程中，如果提取液所占比例太小可能會(huì)造成多糖不能被完全提取，而且對(duì)原料中的活性成分也會(huì)造成一定的損失；但若提取液所占比例過多，又會(huì)造成不必要的浪費(fèi)，增加生產(chǎn)成本。液料比對(duì)粗多糖得率的影響見圖1。

圖1 液料比對(duì)粗多糖得率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of crude polysaccharide

由圖1 可知，本研究選取的液料比范圍為10 ∶1～50 ∶1（mL/g）。當(dāng)液料比在10 ∶1～30 ∶1（mL/g）內(nèi)時(shí)，淡竹葉粗多糖的得率增加效果明顯，這可能是因?yàn)橐毫媳葦?shù)值小于30 ∶1（mL/g）時(shí)，淡竹葉內(nèi)外滲透壓隨液料比的增加而增加，使多糖向提取液的方向釋放[24]。而當(dāng)液料比大于30 ∶1（mL/g）時(shí)，淡竹葉粗多糖的得率增長(zhǎng)緩慢，但是一直處于增長(zhǎng)狀態(tài)，這可能是因?yàn)椴粩嘣黾尤軇w積，會(huì)使淡竹葉中的多糖不斷溶出，直至趨于平衡[25]。因此，出于節(jié)約能源和成本的考慮，選擇液料比為10 ∶1、30 ∶1、50 ∶1（mL/g）進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2.1.2 不同提取時(shí)間對(duì)淡竹葉粗多糖得率的影響

提取時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響見圖2。

圖2 提取時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of crude polysaccharide

如圖2所示，隨著提取時(shí)間從0.5 h 延長(zhǎng)到2.0 h，淡竹葉多糖的得率從（2.52±0.09）%增加至（4.72±0.14）%，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，多糖得率有所降低。這可能是因?yàn)榻^大部分多糖在2.0 h 內(nèi)被提取出來，而2.0 h后粗多糖的得率降低，原因可能是由于多糖的結(jié)構(gòu)在持續(xù)的高溫作用下遭到破壞導(dǎo)致的[26]。因此，選擇提取時(shí)間1.0、2.0 h 和3.0 h 進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面分析。

2.1.3 不同提取次數(shù)對(duì)淡竹葉粗多糖得率的影響

提取次數(shù)對(duì)粗多糖得率的影響見圖3。

圖3 提取次數(shù)對(duì)粗多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction times on the yield of crude polysaccharide

由圖3 可知，在選定的范圍內(nèi)（1～5 次）淡竹葉粗多糖的得率隨著提取次數(shù)的增加而顯著增加，而當(dāng)提取次數(shù)為3 時(shí)，淡竹葉粗多糖的得率為（4.73±0.11）%，繼續(xù)增加提取次數(shù)，多糖得率變化不明顯，趨于平緩。這可能是由于淡竹葉中的多糖已大部分溶解，再增加提取次數(shù)不僅對(duì)多糖的得率無明顯影響[27]，還可能會(huì)使多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，同時(shí)也會(huì)使其它雜質(zhì)溶出[28]。因此，從節(jié)約能源的角度來看，確定提取3 次為最佳提取次數(shù)。

2.1.4 不同醇沉濃度對(duì)淡竹葉粗多糖得率的影響

醇沉濃度對(duì)粗多糖得率的影響見圖4。

圖4 醇沉濃度對(duì)粗多糖得率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration for precipitation on the yield of crude polysaccharide

由圖4 可知，當(dāng)醇沉濃度小于60%時(shí)，淡竹葉粗多糖的得率隨醇沉濃度的增加而顯著增加。當(dāng)醇沉濃度為60%時(shí)，淡竹葉粗多糖的得率為（4.53±0.10）%，繼續(xù)增大醇沉濃度，多糖得率增長(zhǎng)較少。因此，從考慮成本和節(jié)約能源來看，選擇醇沉濃度為50%、60%和70%進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

利用Design Expert 10.0.7 軟件，參照Box-Behnken Design 原理，選擇液料比（A）、提取時(shí)間（B）、醇沉濃度（C）為自變量，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。方差分析結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

結(jié)果表明，各自變量之間存在的二次多項(xiàng)式關(guān)系為Y=4.626+0.375A+0.266B+0.259C-0.26AB-0.365AC+0.368BC-1.067A2-0.599B2-1.044C2。

如表3所示，失擬項(xiàng)的F值和P值分別為1.42 和0.360 4，這表明該模型擬合不顯著。模型的R2Adj為0.932，說明該模型可以解釋大部分（93.2%）的變化，表明所建立的多項(xiàng)式模型方程具有普遍有效性和準(zhǔn)確性。方差分析的結(jié)果表明，淡竹葉粗多糖得率的二次多項(xiàng)式模型是極顯著的，除液料比和提取時(shí)間的交互作用對(duì)淡竹葉多糖得率的影響不顯著外，其余各因素對(duì)粗多糖得率影響均顯著。通過F值的大小可知，液料比對(duì)淡竹葉粗多糖得率的影響最顯著，其次是提取時(shí)間，最后是醇沉濃度。

各因素相互作用及對(duì)粗多糖得率響應(yīng)面3D 圖和等高線圖見圖5。

圖5 液料比、提取時(shí)間、醇沉濃度相互作用及對(duì)淡竹葉粗多糖得率的響應(yīng)面3D 圖和等高線圖Fig.5 Three-dimensional response surface plots and contour plots of interactions between liquid-to-solid ratio，extraction time，and ethanol concentration for precipitation on the yield of crude polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

由圖5 可知，液料比和提取時(shí)間的3D 圖坡度最平緩，說明液料比和提取時(shí)間的交互作用對(duì)淡竹葉粗多糖得率的影響較弱，這一結(jié)果與表3 的結(jié)果相一致。淡竹葉多糖的最優(yōu)提取工藝條件為液料比32.44 ∶1（mL/g），提取時(shí)間2.24 h，醇沉濃度為61.44%，預(yù)測(cè)淡竹葉粗多糖的得率為4.67%。充分考慮到實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)的需要，將得到的最優(yōu)條件進(jìn)行修改，最終選取液料比30 ∶1（mL/g），提取時(shí)間2 h，醇沉濃度60%，在此條件下進(jìn)行重復(fù)3 次，淡竹葉粗多糖得率為（4.54±0.26）%，其與預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差為0.13%<5%，說明模型建立成功且修正后的提取條件具備較高的可行性。

2.3 淡竹葉粗多糖的分子量分布

淡竹葉粗多糖的高效液相色譜圖和洗脫曲線見圖6。

圖6 淡竹葉粗多糖的高效液相色譜圖和洗脫曲線Fig.6 High performance liquid chromatogram and elution curve of the crude polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

由圖6 可知，淡竹葉粗多糖有一個(gè)明顯的峰，出峰時(shí)間為9.210 min，其它兩個(gè)峰較小，出峰時(shí)間分別為11.348 min 和13.422 min。由于第一個(gè)組分組分占比較大，因此選擇分離第一個(gè)組分。從圖中可見，有2 個(gè)明顯的獨(dú)立洗脫峰，還有一個(gè)洗脫峰不是很明顯，分析比較通過高效液相色譜儀得到的分子量大小，可以確認(rèn)第一個(gè)洗脫峰應(yīng)該就是需要分離的組分，收集該組分，通過真空冷凍干燥機(jī)凍干得到淡竹葉純多糖，命名為L(zhǎng)GP。

2.4 LGP 的純度鑒定

2.4.1 淡竹葉多糖的成分及含量分析

LGP 基本化學(xué)成分見表4。

表4 LGP 基本化學(xué)成分Table 4 Basic chemical components of LGP %

由表4 可得，經(jīng)過分離純化后LGP 的總糖含量為（93.40±0.96）%，蛋白質(zhì)含量為（1.71±0.64）%，糖醛酸含量為（5.50±0.78）%，且不含有還原糖。綜上所述，LGP是一種純度較高，蛋白質(zhì)含量較少的中性多糖。

2.4.2 淡竹葉多糖的相對(duì)分子量分析

淡竹葉葉純化多糖的高效液相色譜圖見圖7。

圖7 淡竹葉葉純化多糖的高效液相色譜圖Fig.7 High performance liquid chromatogram of the purified polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

如圖7所示，色譜圖中出現(xiàn)了一個(gè)狹窄的對(duì)稱峰，這表明LGP 的相對(duì)分子量分布均勻。根據(jù)保留時(shí)間（7.562 min）計(jì)算得LGP 的相對(duì)分子量為2.32×106Da。

2.4.3 淡竹葉多糖的紫外全波長(zhǎng)掃描結(jié)果分析

淡竹葉多糖的紫外可見光掃描譜圖見圖8。

圖8 淡竹葉多糖的紫外可見光掃描譜圖Fig.8 UV-Vis scanning spectrum of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

如圖8所示，淡竹葉多糖在260 nm 和280 nm 處有較弱的紫外可見吸收峰，這意味著淡竹葉多糖可能含有少量核酸和蛋白質(zhì)，這與2.4.1 的化學(xué)分析結(jié)果一致。

2.5 LGP 的單糖組成分析

使用離子色譜儀對(duì)LGP 的單糖組成進(jìn)行檢測(cè)，與標(biāo)品對(duì)照分析。標(biāo)準(zhǔn)品和LGP 的完全水解產(chǎn)物的保留時(shí)間如圖9所示。

圖9 離子色譜圖Fig.9 Ion chromatograms

圖9 表明，淡竹葉多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸組成，其中阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖含量相對(duì)較高，其余的單糖和糖醛酸含量較少。計(jì)算得出LGP 中鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的摩爾比為0.115 ∶2.453 ∶3.176 ∶0.780 ∶1.000 ∶0.430 ∶0.239 ∶0.018。根據(jù)LGP 的離子色譜圖可知LGP 含有少量糖醛酸，這與間羥基聯(lián)苯法的結(jié)論一致。

2.6 淡竹葉多糖熱穩(wěn)定性分析

2.6.1 LGP 的差示掃描量熱（DSC）分析

LGP 的DSC 分析見圖10。

圖10 LGP 的DSC 分析Fig.10 Differential scanning calorimetry of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

由圖10 可知，LGP 在76.4 ℃出現(xiàn)一個(gè)吸熱峰，這個(gè)過程主要是由于固態(tài)構(gòu)型的崩解與突變?cè)斐傻?。在之后的升溫過程中多糖沒有出現(xiàn)放熱峰，這表明淡竹葉多糖有較好的熱穩(wěn)定性[29]。

2.6.2 LGP 的熱重（TGA）測(cè)定

LGP 的TGA 分析見圖11。

圖11 LGP 的TGA 分析Fig.11 Thermogravimetry analysis of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

由圖11 可得，LGP 的TGA 分解過程大致可分為3 個(gè)階段。第一階段在50 ℃左右，失重率為13.66%，這一階段是淡竹葉多糖樣品失去由于物理作用吸附在多糖上的水分，這表明LGP 上會(huì)吸附著少量水分。第二階段，溫度變化范圍為200～400 ℃，此階段失重最為明顯，失重率達(dá)到了65.02%，淡竹葉多糖在該溫度范圍內(nèi)發(fā)生了劇烈的分解，從而使淡竹葉多糖樣品重量顯著降低。第三階段，溫度變化范圍是450～600 ℃，此階段樣品的重量變化趨于平緩，為緩慢碳化階段，大部分樣品在此階段內(nèi)分解為灰分和無機(jī)成分。綜上所述，LGP 在200 ℃內(nèi)具有良好的熱穩(wěn)定性，這與DSC結(jié)果相一致。

2.7 淡竹葉多糖的抗氧化活性測(cè)定

2.7.1 LGP 對(duì)DPPH·的清除能力

淡竹葉多糖對(duì)DPPH 自由基清除能力試驗(yàn)結(jié)果見圖12。

圖12 淡竹葉多糖對(duì)DPPH 自由基清除能力Fig.12 DPPH radical scavenging ability of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

由圖12 可知，淡竹葉多糖在0～8 mg/mL 濃度范圍內(nèi)具有一定的DPPH·的清除能力[30]。VC和淡竹葉多糖濃度為8 mg/mL 時(shí)清除作用最強(qiáng)，清除率分別為96.5%、50.0%。經(jīng)計(jì)算，LGP 和VC的IC50值分別為8.710 mg/mL和1.148 mg/mL，這說明LGP 具有一定的DPPH·清除能力，但效果遠(yuǎn)弱于VC。LGP 的DPPH·清除能力與其分子量和單糖組成有關(guān)[31-32]。Lo 等[33]發(fā)現(xiàn)，阿拉伯糖與葡萄糖的比例越高，香菇多糖的抗氧化能力越低。因此，半乳糖和阿拉伯糖是影響LGP 清除DPPH 自由基的關(guān)鍵因素。由于LGP 是一種大分子多糖，而且LGP的半乳糖含量與阿拉伯糖和葡萄糖的比例較高，所以其DPPH·清除能力較弱。

2.7.2 LGP 對(duì)·OH 的清除能力

生命體中最具氧化性能的自由基為·OH，若不快速及時(shí)清除，會(huì)破壞機(jī)體的腑臟器官[34]。淡竹葉多糖對(duì)·OH 的清除能力見圖13。

圖13 淡竹葉多糖對(duì)·OH 的清除能力Fig.13 OH radical scavenging ability of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

由圖13 可知，淡竹葉多糖的羥基自由基清除能力與濃度呈正相關(guān)。VC和淡竹葉多糖濃度為8 mg/mL時(shí)清除作用最強(qiáng)，清除率分別為99.6%、64.4%，計(jì)算得到LGP 和VC的IC50值分別為3.947 mg/mL 和0.305 mg/mL，這說明LGP 具有較好的·OH 的清除能力。LGP 對(duì)·OH 的清除能力較強(qiáng)與其單糖組成中木糖的含量較高有關(guān)[35]。

2.7.3 LGP 的ABTS＋自由基的清除能力

淡竹葉多糖對(duì)ABTS＋自由基清除能力見圖14。

圖14 淡竹葉多糖對(duì)ABTS＋自由基清除能力Fig.14 ABTS＋radical scavenging ability of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

由圖14 可知，淡竹葉多糖具有良好的ABTS＋自由基清除能力。當(dāng)濃度增加到8.0 mg/mL 時(shí)，清除率達(dá)到74.8%，接近于VC。經(jīng)計(jì)算，LGP 和VC的IC50值分別為1.134 mg/mL 和0.068 mg/mL，由此可見，淡竹葉多糖對(duì)ABTS＋由由基具有較強(qiáng)的清除作用，這一般與LGP 中的半乳糖含量較高有關(guān)[36]。Sharma 等[37]將部分純化后的辣木葉多糖與其粗提取物進(jìn)行了比較，結(jié)果表明由于純化后的辣木多糖具有較高的半乳糖含量（38.08%），所以純化后的辣木多糖具有較好的ABTS+·清除能力。

2.7.4 LGP 的還原力測(cè)定

多糖分子中存在的苷羥基可在一定條件下可以異變?yōu)轸驶Y(jié)構(gòu)，因而具有還原性。吸光度反映物質(zhì)的還原能力，吸光度越大，待測(cè)物質(zhì)的還原能力越強(qiáng)[38]。淡竹葉多糖的還原能力見圖15。

圖15 淡竹葉多糖的還原能力Fig.15 Reducing ability of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

由圖15 可知，在選定的濃度范圍內(nèi)淡竹葉多糖具有一定的還原能力，但始終弱于同等質(zhì)量濃度下VC的還原能力。淡竹葉多糖的還原能力隨多糖濃度的增加而增強(qiáng)，當(dāng)濃度增加到8.0 mg/mL 時(shí)，還原力達(dá)到0.574。Wang 等[39]發(fā)現(xiàn)糖醛酸中的COOH 和Fe2+之間形成的跨橋是多糖具有Fe2+螯合能力的原因。Zhang 等[40]發(fā)現(xiàn)糖醛酸含量與還原能力呈正相關(guān)。由于LGP 的糖醛酸含量較低，所以其還原能力也較弱。

3 結(jié)論

本研究通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面相結(jié)合的方法得到了淡竹葉多糖的最優(yōu)提取工藝條件為液料比30 ∶1（mL/g），提取時(shí)間2 h，醇沉濃度60%，在上述提取工藝條件下，淡竹葉粗多糖的得率（4.54±0.26）%。分離純化后的淡竹葉多糖LGP 經(jīng)測(cè)定可得其總糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸含量分別為（93.40±0.96）%、（1.71±0.64）%、（5.50±0.78）%，平均相對(duì)分子量為2.32×106Da。LGP 主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸組成，其摩爾比為0.115 ∶2.453 ∶3.176 ∶0.780 ∶1.000 ∶0.430 ∶0.239 ∶0.018。利用DSC 和TGA 對(duì)淡竹葉多糖的熱穩(wěn)定性進(jìn)行探究，結(jié)果證實(shí)LGP 在200 ℃以內(nèi)具有良好的熱穩(wěn)定性。

對(duì)淡竹葉多糖LGP 進(jìn)行了抗氧化活性試驗(yàn)，結(jié)果表明淡竹葉多糖對(duì)DPPH 自由基、羥基自由基、ABTS+自由基均具有一定的清除能力，且清除能力大小順序?yàn)锳BTS+自由基>羥基自由基>DPPH 自由基，由此可得淡竹葉多糖是一種潛在的天然抗氧化劑，可應(yīng)用于食品、藥品等領(lǐng)域。通過總還原力測(cè)定結(jié)果可得其還具有一定的還原能力。本研究所得的淡竹葉多糖是一種得率較高、相對(duì)分子量較大且具有良好熱穩(wěn)定性的多糖，可作為一種新型的天然抗氧化劑，本研究也為淡竹葉多糖的生產(chǎn)應(yīng)用提供了理論支持。