丹參提取物對(duì)去卵巢模型大鼠骨質(zhì)疏松的影響

王玥，陳薇，楊志國(guó)，張艷艷，王浩，徐詠全，劉垚杰，李麗維，*

（1.天士力研究院，天津 300410；2.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；3.天津天士力（遼寧）制藥有限責(zé)任公司，遼寧阜新 123000）

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨量降低及骨組織微結(jié)構(gòu)破壞為特征，導(dǎo)致骨脆性增加的代謝性骨病[1]，基本發(fā)病機(jī)制是成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的功能失衡，骨吸收遠(yuǎn)大于骨形成，導(dǎo)致骨量丟失。近年來(lái)隨著人均壽命的延長(zhǎng)以及老齡人口的增加，骨質(zhì)疏松的發(fā)病率也日益增高。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為骨質(zhì)疏松，以腎虛為主，血瘀為害，互為因果，血瘀是骨質(zhì)疏松癥的促進(jìn)因素，若氣血兩虛，則影響骨的營(yíng)養(yǎng)及骨代謝[2]，且現(xiàn)代研究也證實(shí)微血管改變是瘀血證的病理基礎(chǔ)，瘀血是引起骨質(zhì)疏松性骨痛的重要機(jī)制之一。

丹參為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhizaBge.）的干燥根和根莖，性味苦，微寒，歸心、肝經(jīng)，具有活血祛瘀，通經(jīng)止痛的功效[3]，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于丹參的輔助降血脂、提高耐缺氧、對(duì)化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)和抗氧化等功能研究較多，而對(duì)其增加骨密度方面的功效研究較少。丹參作為活血化瘀的中藥，能改善微循環(huán)，目前已有網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明丹參可通過(guò)多條通路直接或間接參與細(xì)胞分化和凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等影響骨代謝[4-5]，在傳統(tǒng)的中醫(yī)藥實(shí)踐方面，中藥材通常采用水提煎煮的方式進(jìn)行，丹參的水溶性成分具有強(qiáng)抗氧化性，可起到預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化[6]、保護(hù)心血管[7]等作用，成為丹參提取物研究的主要熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)丹參水溶性成分可通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和表達(dá)[8-9]、促進(jìn)骨膠原合成[10]、促進(jìn)骨鈣素生成[11]來(lái)促進(jìn)骨形成，亦可通過(guò)抑制抗酒石酸酸性磷酸酶活性[12]、抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號(hào)通路[13]、抑制腫瘤壞死因子-α 的表達(dá)[14]來(lái)抑制骨吸收[15]，還能通過(guò)調(diào)節(jié)骨髓微循環(huán)[16]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[17]等調(diào)節(jié)骨代謝。前期已有學(xué)者采用去卵巢模型研究丹參水提物對(duì)牙槽骨的影響[18-19]，取得了積極的結(jié)果。本研究以丹參水提物為研究對(duì)象，采用去卵巢大鼠為模型，通過(guò)觀察股骨質(zhì)量、股骨及脛骨骨小梁形態(tài)學(xué)變化，探討丹參提取物對(duì)骨代謝的影響，以期為丹參用于開(kāi)發(fā)增加骨密度的功能性食品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

基礎(chǔ)飼料、實(shí)驗(yàn)大鼠：斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0002]；水合氯醛（>99%）：上海麥克林生化科技有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）脫鈣液、β-雌二醇：北京索萊寶生物科技有限公司；青霉素：華北制藥廠；丹參：市售。

FA2004 型分析天平：METTLER TOLEDO 公司；TDL-8002 恒溫水浴鍋：天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；SX-2-8-12 馬弗爐：沈陽(yáng)長(zhǎng)白電爐廠；Olympus CKX41顯微鏡：日本奧林巴斯株式會(huì)。

1.2 提取物制備

丹參提取物制備方法：稱取丹參（符合2020 版《中華人民共和國(guó)藥典》一部標(biāo)準(zhǔn)），采用水提方式提取，工藝為料液比1 ∶8（kg/L），提取3 次，過(guò)濾，合并提取液，濃縮，干燥制得丹參提取物，每克丹參提取物相當(dāng)于丹參生藥2.86 g。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇

實(shí)驗(yàn)選用健康雌性3月齡SPF 級(jí)SD 大鼠，體質(zhì)量250～300 g，飼養(yǎng)于天津科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。飼養(yǎng)環(huán)境：（23±3）℃，相對(duì)濕度55%～75%，12 h 明暗循環(huán)。大鼠被放置在白色塑料籠中，每籠4 只，每組2 籠。實(shí)驗(yàn)期間為動(dòng)物提供充足的食物和水。本研究的所有實(shí)驗(yàn)程序均按照天津科技大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的方案進(jìn)行。

1.4 分組與模型的建立

將SD 大鼠隨機(jī)分為6 組，每組8 只，分別為假手術(shù)組（sham operation，SHA）、模型組（model，MOD）、丹參提取物低劑量組（Salvia miltiorrhizaextract low-dose，SL）、丹參提取物中劑量組（Salvia miltiorrhizaextract medium-dose，SM）、丹參提取物高劑量組（Salvia miltiorrhizaextract high-dose，SH）、雌激素組（estrogen，E2）。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周之后進(jìn)行建模，向大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液，腹部固定于鼠板上，于肋緣與脊柱交界處向下備皮，在離脊柱約1 cm 處切開(kāi)皮膚，剝開(kāi)肌肉組織，用止血鉗拉出游離的脂肪組織，找到粉紅色的卵巢，在其與子宮連接處用3 號(hào)線結(jié)扎，剪去卵巢組織，止血，并向腹腔內(nèi)滴入青霉素注射液，再做肌層、皮膚的縫合。假手術(shù)組僅摘除卵巢附近的脂肪組織。各組大鼠單籠飼養(yǎng)，術(shù)后3 d 腹腔注射青霉素注射液，術(shù)后1 周進(jìn)行陰道圖片檢查，確認(rèn)卵巢完全摘除，卵巢摘除不完全者棄用。實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒉⒒謴?fù)1 周后開(kāi)始給藥。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，假手術(shù)組和模型組每天灌胃等量的生理鹽水，SL、SM、SH 組每天分別灌胃63、83 mg/kg 和107 mg/kg 的丹參提取物，雌激素組每天灌胃1 mg/kg β-雌二醇。各實(shí)驗(yàn)組連續(xù)給藥12 周。

1.5 體質(zhì)量和攝食量記錄

體質(zhì)量及攝食量自給藥開(kāi)始后進(jìn)行記錄，其體質(zhì)量每周稱量1 次，共計(jì)12 周，攝食量每天測(cè)量1 次并記錄。觀察各組攝食量與給藥前后體質(zhì)量的變化。

1.6 子宮系數(shù)測(cè)定

大鼠處死前12 h 進(jìn)行斷水?dāng)嗉Z，處死后，將大鼠子宮上附著的脂肪剝離干凈，吸取多余液體后稱量子宮質(zhì)量，計(jì)算子宮系數(shù)，觀察各組子宮系數(shù)的變化，計(jì)算公式如下。

X=U/W×1 000

式中：X為子宮系數(shù)，g/kg；U為子宮質(zhì)量，g；W為大鼠體質(zhì)量，g。

1.7 股骨計(jì)量學(xué)指標(biāo)

股骨濕重：剝離大鼠右側(cè)股骨，將附著的肌肉和筋膜剔除干凈，吸取多余液體后用天平進(jìn)行稱量。

股骨干重：將剝離的大鼠右側(cè)股骨脫脂72 h，隨后在100 ℃環(huán)境中烘干8 h，并置于干燥器中放置30 min后進(jìn)行稱量。

股骨灰重：取烘干后的股骨，放入550 ℃馬弗爐中8 h，取出后置于干燥器中冷卻，精密稱定股骨的灰重。

1.8 形態(tài)學(xué)觀察

參照趙恒俠等[20]的研究方法，分別取大鼠左側(cè)脛骨、股骨,除凈周圍附著的肌肉和筋膜組織，然后將骨組織置于10%福爾馬林溶液中固定，EDTA 脫鈣預(yù)處理后進(jìn)行脫水、透明、包埋、切片、脫蠟、蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色、封片等步驟，分別獲得大鼠股骨和脛骨切片。最后，通過(guò)光學(xué)顯微鏡采集圖片，觀察脛骨和股骨的骨小梁損傷程度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）評(píng)估各組間差異，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 體質(zhì)量與攝食量

各組大鼠體質(zhì)量自開(kāi)始給藥時(shí)進(jìn)行記錄，各組結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠給藥前后體質(zhì)量及攝食量Table 1 Body weight and food intake of rats in each group g

如表1所示，初始體質(zhì)量各組間沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），平均攝食量各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。12周后體質(zhì)量與SHA 組比較，MOD 組體質(zhì)量極顯著增加（P＜0.01），較SHA 組增加23.45%。與MOD 組比較，SL、SM、SH 與E2 組體質(zhì)量均顯著降低（P＜0.05），較模型組分別降低了7.98%、8.58%、9.57%、10.38%，說(shuō)明丹參提取物能抑制去卵巢大鼠體質(zhì)量的增加。

2.2 子宮系數(shù)

各給藥組對(duì)去卵巢大鼠子宮系數(shù)的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同受試物對(duì)去卵巢大鼠子宮系數(shù)的影響Fig.1 Effects of different drugs on uterine coefficients of ovariectomized rats

由圖1 可知，SHA、MOD、SL、SM、SH、E2 組的子宮系數(shù)分別為2.15、0.93、1.42、1.78、2.06、2.73 g/kg。與SHA 組比較，MOD、SL、SM 組的子宮系數(shù)顯著降低（P＜0.05），較假手術(shù)組分別降低了57.02%、33.94%、17.25%，E2 組較假手術(shù)組顯著升高了26.50%（P＜0.05），SH 組與SHA 組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與MOD 組比較，SL、SM、SH 組和E2 組子宮系數(shù)均顯著升高（P＜0.05），分別升高了18.24%、60.19%、63.73%和194.29%，且觀察到丹參提取物給藥劑量與子宮系數(shù)的增加呈正相關(guān)。與E2 組比較，丹參提取物各劑量組均顯著降低（P＜0.05）。綜上，丹參提取物各劑量組均可改善去卵巢大鼠的子宮系數(shù)，并且對(duì)子宮的刺激作用明顯小于雌激素，而雌激素對(duì)子宮有明顯的刺激作用。

2.3 股骨計(jì)量學(xué)指標(biāo)

各給藥組對(duì)股骨濕重、股骨干重和股骨灰重的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同受試物對(duì)去卵巢大鼠股骨濕重、干重和灰重的影響Fig.2 Effects of different drugs on the wet weight，dry weight，and ash weight of femur in ovariectomized rats

由圖2A 可知，SHA、MOD、SL、SM、SH、E2 組的股骨濕重分別為1.22、1.02、1.10、1.15、1.16、1.24 g。與SHA組比較，MOD、SL 組股骨濕重顯著降低（P＜0.05），分別降低了15.91%、9.65%，SM、SH 組和E2 組均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與MOD 組比較，SL、SM、SH 組和E2 組的股骨濕重均顯著升高（P＜0.05），分別升高了7.45%、12.45%、13.31%和20.76%，且隨著丹參提取物劑量增加，股骨濕重也逐漸增加。與E2 組比較，SM、SH 組無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明丹參提取物中、高劑量對(duì)股骨濕重的增加與雌激素相當(dāng)，且接近SHA 組。

由圖2B 可知，SHA、MOD、SL、SM、SH、E2 各組的股骨干重分別為0.72、0.52、0.62、0.66、0.64、0.69 g，與SHA組比較，MOD、SL、SH 組的股骨干重顯著降低（P＜0.05），較SHA 分別降低27.97%、13.29%、10.31%，SM 和E2組均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與MOD 組相比，各給藥組的股骨干重均顯著升高（P＜0.05），SL、SM、SH 和E2組的股骨干重較MOD 組分別升高20.38%、27.91%、24.51%和33.50%。與E2 組比較，SL、SM、SH 組均無(wú)顯著差異（P＞0.05），表明丹參提取物各劑量組對(duì)股骨干重的增加效果與雌激素相當(dāng)。

由圖2C 可知，SHA、MOD、SL、SM、SH、E2 各組的股骨灰重分別為0.43、0.31、0.36、0.37、0.39、0.42 g。與SHA 組比較，MOD、SL、SM 和SH 組的股骨灰重均顯著降低（P＜0.05），較SHA 組分別降低27.65%、15.59%、13.24%、8.24%，E2 組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與MOD 組相比，SL、SM、SH 和E2 組的股骨灰重均顯著升高（P＜0.05），各組灰重較MOD 組分別升高16.67%、19.92%、26.83%和35.37%，且丹參提取物給藥劑量與股骨灰重的增加呈正相關(guān)（P＜0.05）。與E2 組比較，SL、SM 組有顯著差異（P＜0.05），SH 組無(wú)顯著差異（P＞0.05）。

綜上，丹參各組均可增加去卵巢大鼠股骨濕重、股骨干重和股骨灰重，丹參提取物中劑量組和高劑量組對(duì)股骨濕重的增加效果與雌激素相當(dāng)，且已接近假手術(shù)組。

2.4 骨形態(tài)學(xué)觀察

股骨形態(tài)學(xué)結(jié)果如圖3所示，脛骨形態(tài)學(xué)結(jié)果如圖4所示。

圖3 不同受試物對(duì)去卵巢大鼠股骨形態(tài)學(xué)影響Fig.3 Effects of different drugs on the morphology of femur in ovariectomized rats

圖4 不同受試物對(duì)去卵巢大鼠脛骨形態(tài)學(xué)影響Fig.4 Effects of different drugs on the morphology of tibia in ovariectomized rats

由圖3 可知，SHA 組顯示骨組織形態(tài)正常，股骨骨小梁密集，結(jié)構(gòu)連接成網(wǎng)狀，排列致密有序，粗細(xì)均勻，基本結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常；MOD 組骨組織形態(tài)出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變，表現(xiàn)為骨小梁稀疏，斷裂，排列紊亂，結(jié)構(gòu)模糊，并可見(jiàn)游離末端；不同給藥組股骨骨組織形態(tài)學(xué)變化較模型組均有明顯改善，各給藥組骨小梁無(wú)明顯斷裂，排列尚規(guī)則，且寬度接近正常，表明丹參各給藥組和雌激素組均可以改善去卵巢大鼠股骨骨小梁結(jié)構(gòu)。

由圖4 可知，SHA 組顯示骨組織形態(tài)正常，脛骨骨小梁密集，結(jié)構(gòu)連接成網(wǎng)狀，排列致密有序，粗細(xì)均勻，基本結(jié)構(gòu)未見(jiàn)異常；MOD 組骨組織形態(tài)出現(xiàn)明顯病理學(xué)改變，表現(xiàn)為骨小梁稀疏，斷裂，排列紊亂，結(jié)構(gòu)模糊，并可見(jiàn)游離末端；不同給藥組脛骨骨組織形態(tài)學(xué)變化較模型組均有明顯改善，可看出各給藥組骨小梁無(wú)明顯斷裂，排列尚規(guī)則，且寬度接近正常，表明丹參各給藥組和雌激素組均可以改善去卵巢大鼠脛骨骨小梁結(jié)構(gòu)。

3 討論與結(jié)論

去卵巢模型大鼠由于體內(nèi)雌激素水平降低，骨代謝呈負(fù)平衡狀態(tài)，骨吸收相對(duì)增強(qiáng)，骨量逐漸丟失，形成骨質(zhì)疏松，去卵巢動(dòng)物的體質(zhì)量快速增長(zhǎng)是為抵抗去卵巢后對(duì)骨骼影響的一種自身保護(hù)性反應(yīng)，可以部分抑制模型大鼠的骨量丟失。股骨干重、濕重、灰重的降低，骨小梁的斷裂，也直接反映了去卵巢模型骨量的丟失[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，與去卵巢模型組大鼠比較，不同劑量的丹參提取物均能顯著降低大鼠體質(zhì)量、改善大鼠的子宮系數(shù)、增加股骨濕重、干重和灰重（P＜0.05），并且能夠改善股骨及脛骨骨小梁結(jié)構(gòu)，此外，與假手術(shù)組比較，雌激素組的子宮系數(shù)顯著增加（P＜0.05），而前期也有研究表明長(zhǎng)期使用雌激素對(duì)生殖系統(tǒng)造成損害[22]，本研究結(jié)果也進(jìn)一步印證了長(zhǎng)期使用雌激素可對(duì)子宮會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)刺激，從而導(dǎo)致誘發(fā)嚴(yán)重疾病的可能性，而丹參各組對(duì)子宮的影響要明顯弱于雌激素組（P＜0.05），這也就表明雖然丹參存在雌激素樣作用，但對(duì)子宮的刺激明顯減小。除了去卵巢動(dòng)物模型外，丹參也對(duì)糖皮質(zhì)激素模型引起的骨質(zhì)疏松同樣有效[23-24]，說(shuō)明丹參可對(duì)不同類型的骨質(zhì)疏松起到增加骨密度的作用。綜上所述，丹參提取物可提高去卵巢大鼠骨質(zhì)量，改善骨微結(jié)構(gòu)，且對(duì)子宮刺激作用小，對(duì)緩解骨質(zhì)疏松具有積極作用，對(duì)股骨濕重的增加與雌激素相當(dāng)且接近于假手術(shù)組，表明丹參提取物具有增加骨密度的功效。