基于內(nèi)皮細胞Ang/Tie2軸抗炎作用探討化療性靜脈炎發(fā)病機制

王淑敏 馮瑪莉 吉海杰

山西省中醫(yī)藥研究院，山西太原 030012

化療性靜脈炎發(fā)生機制主要是指強刺激性藥液進入靜脈后刺激血管壁，使血管內(nèi)皮細胞（endothelial cells，ECs）脫水、缺氧、充血、壞死，臨床表現(xiàn)為局部組織發(fā)生的片狀紅斑、疼痛、紅腫、硬化，甚至靜脈條索狀，嚴重者可見靜脈栓塞、組織壞死。美國靜脈輸液護理學(xué)會將靜脈炎分為五個等級，其中最嚴重的標準為輸液部位疼痛伴有發(fā)紅或水腫，可觸摸的條索狀物長度＞2.5 cm，并有膿液流出[1]，這些炎癥體征都是由ECs 通過局部血管屏障功能變化介導(dǎo)的。

ECs 排列在所有血管的內(nèi)部，形成一個靜態(tài)的單層細胞，一旦靜態(tài)消失就會導(dǎo)致內(nèi)膜層發(fā)生炎癥改變。有研究發(fā)現(xiàn)通過調(diào)節(jié)ECs 的控制途徑可以使ECs 在靜態(tài)和激活狀態(tài)之間自由切換，這個控制途徑就是血管生成素（angiopoietins，Ang）/酪氨酸蛋白激酶-2（tyrosine-protein kinase receptor-2，Tie2）軸，在生理狀態(tài)下，Tie2 維持ECs 處于相對靜止狀態(tài)，其特征是動態(tài)屏障功能和抗白細胞黏附功能。在炎癥狀態(tài)下，ECs 被激活并表達黏附分子，這些黏附分子可引導(dǎo)白細胞移動到炎癥部位，被激活的ECs 分泌Ang-2，通過與Ang-1 競爭Tie2 受體，誘導(dǎo)ECs 失穩(wěn)，導(dǎo)致血管通透性增加[2]。因此本文描述了Ang/Tie2 信號傳導(dǎo)的生物學(xué)功能，包括Ang-1、Ang-2 和Tie2 受體的結(jié)構(gòu)信息，生化和生物學(xué)作用，總結(jié)了Ang/Tie2 信號傳導(dǎo)對ECs 的調(diào)節(jié)作用，以此來探討Ang/Tie2 軸在化療性靜脈炎中的抗炎機制。

1 Ang-1、Ang-2/Tie2信號通路的生物學(xué)功能

1.1 Tie2受體的結(jié)構(gòu)及生理作用

Tie2 受體具有獨特的用于與配體結(jié)合的細胞外結(jié)構(gòu)域，由免疫球蛋白、表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域和三個纖維粘連蛋白（Fn1、Fn2、Fn3）組成。膜近端Fn3可與Ang-1 結(jié)合誘導(dǎo)Tie2 二聚化和激活，F(xiàn)n3 結(jié)構(gòu)域的突變會導(dǎo)致Ang-1 誘導(dǎo)的Tie2 磷酸化降低[3]。Ang-1 和Tie2 結(jié)合形成二聚體后，Tie2 受體可發(fā)生自磷酸化激活，將信號傳遞給通路下游分子，參與ECs 增殖過程。被激活的Tie2 可增加ECs 的存活率、細胞連接的黏附性和穩(wěn)定性，從而使血管系統(tǒng)穩(wěn)定。Tie2 主要在ECs、周細胞和被稱為TEMs 的單核細胞亞群中存在特異性表達，最近研究表明Tie2 在小腦和海馬分化的神經(jīng)元中也存在表達[4]。

當Tie2 均勻表達于胚胎時期血管內(nèi)皮細胞時，缺乏Tie2 的轉(zhuǎn)基因小鼠具有較早的致死表型，小鼠均死于子宮內(nèi)，其內(nèi)皮完整性存在缺陷。其中最突出的缺陷包括心臟的內(nèi)皮層無法正常發(fā)育，相反不缺乏Tie2 的轉(zhuǎn)基因小鼠血管結(jié)構(gòu)正確。最新研究表明在一種以成熟微血管內(nèi)皮為靶點的誘導(dǎo)性Tie2 敲除小鼠模型中，腎、肺、心臟、主動脈和肝臟隨著Tie2 敲除，所有研究器官的小動脈、腎小球和肺毛細血管中Tie2 mRNA 和蛋白表達的特異性、器官依賴性降低[5]。除此之外Tie2 突變可引起皮膚和內(nèi)部靜脈畸形，只是畸形病變的程度和并發(fā)癥方面有所不同。

1.2 Ang-1/Tie2的結(jié)構(gòu)及生理作用

Ang-1 由周細胞和血管平滑肌細胞分泌，含有3 個結(jié)構(gòu)域，其中N 末端結(jié)構(gòu)域有助于形成Tie2激活所必需的低聚物；卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域可以使血管生成素單體二聚化；C 末端的纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域可以與Tie2 結(jié)合[6]。Ang-1 作為一種間充質(zhì)細胞表達的旁分泌Tie2 激動劑，可在ECs-ECs 連接處和ECs 與細胞外基質(zhì)連接處誘導(dǎo)Tie 簇形成，共同作用促進ECs 完整性，有利于血管形成、成熟和穩(wěn)定[7]。

Ang-1 在生理性血管重塑過程中具有血管生成活性，參與胚胎血管的發(fā)育和生成階段，血管缺損是Ang-1 敲除小鼠胚胎致死的主要原因，但也有研究表明胚胎期13.5 d 敲除小鼠Ang-1 不會導(dǎo)致任何明顯的異常表型，然而當與損傷或微血管應(yīng)激相結(jié)合時，Ang-1 缺乏會導(dǎo)致嚴重的器官損傷，加速血管生成和纖維化。換言之，它在靜態(tài)血管中是可有可無的，但在血管損傷后具有強大的調(diào)節(jié)血管反應(yīng)能力，通過影響對細胞內(nèi)信號、細胞骨架和相關(guān)分子來限制ECs 連接處形成間隙的數(shù)量和大小，從而增強ECs 緊密連接，抑制炎性細胞因子和生長因子誘導(dǎo)的血管滲漏。

1.3 Ang-2/Tie2的結(jié)構(gòu)及生理作用

Ang-2 有一個分泌信號肽，一個NH2末端的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域，和一個COOH 末端的纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域。Ang-2 與Ang-1 有60% 的同源性，儲存于ECs 特有的Weibel Palade 小體中，炎癥等因素可促使其快速釋放。在ECs 中Ang-2 為無信號傳導(dǎo)功能的Tie2 配體，通常不引起Tie2受體的磷酸化，而是競爭性地阻斷Ang-1 的效應(yīng)，破壞Ang-1 信號建立的血管保護系統(tǒng)，并促進病理性血管生成。對于Ang-2 缺陷小鼠血管系統(tǒng)只有輕微異常，功能上未受影響。與之相反，Ang-2 過度表達的轉(zhuǎn)基因小鼠具有胚胎致死表型。在膿毒血癥模型中Ang-2 抗體封閉、基因敲除或RNA 沉默后，血管滲漏減少，器官功能有所改善，存活率也相應(yīng)提高[8]。Ang-2 誘導(dǎo)的人真皮淋巴管內(nèi)皮細胞遷移獨立于Tie 受體，但依賴于β1 整合素拉長基質(zhì)黏附和肌動蛋白應(yīng)力纖維，調(diào)節(jié)ECs-ECs 連接處的鈣粘蛋白來促進血管通透性和不穩(wěn)定性[9]。

Ang-2 的作用依賴于血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），在缺乏VEGF 的情況下，Ang-2 具有血管失穩(wěn)作用，并誘導(dǎo)微血管退化。相反，在存在VEGF 的情況下，基質(zhì)金屬蛋白酶表達增加，Ang-2 通過ECs 增殖等方式促進新生血管形成。在主動脈環(huán)試驗與乳腺癌腦轉(zhuǎn)移模型均證實VEGF 和血管生成素-2 的聯(lián)合誘導(dǎo)血管生成，減少血管分支，縮短內(nèi)皮傷口閉合時間[10]。同樣在發(fā)育中的視網(wǎng)膜和缺血視網(wǎng)膜模型中Ang-2 和VEGF-A 共同表達，促進新生血管形成[11]。除此之外，Ang-2 的激動和拮抗活性之間的轉(zhuǎn)換由炎癥信號調(diào)節(jié)，而Tie1 在此起重要作用。在非炎癥條件下Tie1 被激活以觸發(fā)Ang-2作為激動劑促進Tie2 磷酸化；而在炎癥中，Tie1外結(jié)構(gòu)域被迅速切割導(dǎo)致Ang-2 激動劑活性和血管穩(wěn)定性喪失。

1.4 Ang/Tie2體系中信號間相互作用

在生理條件下，Ang-1 快速自動磷酸化ECs 中的Tie2 受體，但不直接促進ECs 的生長，而Ang-2主要抑制Ang-1 誘導(dǎo)的Tie2 磷酸化[12]。Ang-2 僅由叉頭盒蛋白O1（forkhead box protein O1，F(xiàn)oxO1）調(diào)節(jié)，F(xiàn)oxO1 是調(diào)節(jié)細胞生長、發(fā)育和代謝的轉(zhuǎn)錄因子，主要在ECs 中表達，是血管生成的負調(diào)節(jié)因子，抑制ECs 遷移和血管形成[13]。Ang-1 通過激活絲氨酸激酶（protein kinase B，Akt）抑制FoxO1，使其磷酸化，導(dǎo)致Ang-2 表達降低。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）抑制可阻斷Akt 激活，抑制FoxO1 磷酸化，導(dǎo)致Ang-2 mRNA水平顯著升高[14]。所以PI3K/Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是Ang-1 誘導(dǎo)ECs 存活的關(guān)鍵因素，Ang-1 以PI3K依賴的方式誘導(dǎo)Akt 的磷酸化，從而顯示Ang-1 誘導(dǎo)的抗凋亡作用，促進非滲漏性靜脈重塑[15]。與此相反，Tie2 和PI3K 突變可以使Tie2-Akt 激活，導(dǎo)致實驗小鼠模型和患者的靜脈畸形。除此之外，Tie1 的缺失也可降低Tie2 磷酸化和下游Akt 激活，增加了FoxO1 核定位和轉(zhuǎn)錄激活，并阻止Ang-1 誘導(dǎo)的血管重塑。

2 Ang/Tie2軸調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞抗炎作用

ECs 作為一個動態(tài)結(jié)構(gòu)，在體內(nèi)的生理作用是保護運輸物、控制血管通透性和調(diào)節(jié)血管張力。當強刺激性藥液進入靜脈后刺激血管壁，導(dǎo)致ECs 存在炎性細胞[如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）]浸潤，這些外源性刺激可通過激活ECs 誘導(dǎo)黏附分子的表達，使ECs 變得滲漏和發(fā)炎，天然免疫細胞和體液效應(yīng)分子因此進入感染部位。當ECs 暴露于TNF-α 等炎性細胞因子時，Ang-2 的作用是削弱細胞間的連接，使炎性黏附分子在細胞表面表達，白細胞流出血管進入組織；而Ang-1 作為抗炎劑發(fā)揮血管封閉作用，增強ECs 間連接，降低ECs 高通透性從而阻斷血漿滲漏，減輕細胞炎癥，抑制細胞凋亡（圖1）。

圖1 Ang-1/Tie2 軸對內(nèi)皮細胞調(diào)節(jié)過程及方式

2.1 Ang-1/Tie2降低內(nèi)皮細胞高通透性

Ang-1 是一種生長因子，具有促進血管完整性和阻斷血漿滲漏的潛力。在Ang-1 刺激下，相鄰ECs 之間的縫隙減少，形成一個緊密的屏障，抵抗多種配體的泄漏并防止ECs 受損。在脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)毒素休克小鼠中檢測到過量的Ang-1 可預(yù)防血管滲漏和細胞炎癥，Ang-1 過度表達可以抵抗炎癥因子引起的滲漏，在糖尿病大鼠中也檢測到Ang-1可上調(diào)皮下基質(zhì)細胞間連接蛋白的表達，抑制TNF-α 刺激的白細胞遷移，增強血管內(nèi)皮屏障功能[16]。對屏障防御炎癥應(yīng)激源更為關(guān)鍵的是黏附連接蛋白——VE 鈣粘蛋白，通過肌動蛋白細胞骨架的動態(tài)重組增強血管屏障功能[17]。Ang-1 刺激有利于VE 鈣粘蛋白的結(jié)合積累，具體而言，Ang-1激活Tie2 誘導(dǎo)屏障防御是通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)肌動蛋白細胞骨架的重組和內(nèi)皮間連接處VE 鈣粘蛋白的積累來實現(xiàn)的。Ang-1/Tie2 信號通過ECs 形狀和細胞間連接的保守下游調(diào)節(jié)器PI3K 和Akt向內(nèi)皮肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)器發(fā)出信號，除了通過支架蛋白IQGAP1 使得Rac1 被激活外，還抑制RhoA 來降低血管通透性，誘導(dǎo)F-actin 骨架蛋白形成。被Ang-1 磷酸化的RhoGAP 是Rac1的激活和RhoA 的抑制所必需的調(diào)節(jié)蛋白，失去這種雙重作用的任何一部分都會消除Ang-1 誘導(dǎo)細胞骨架形成和抗?jié)B透作用。除此之外Ang-1/Tie2可通過核因子（nuclear factor，NF）-κB 調(diào)節(jié)細胞間黏附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM-1）和血管細胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表達發(fā)揮抗炎作用，最新研究證實Ang-1/Tie2 可抑制新冠肺炎患者血漿誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞血栓性炎癥變化，對新冠肺炎血栓前內(nèi)皮功能具有保護作用[18]。這表明Ang-1 對增強ECs 間連接、維持血管壁完整性，降低ECs 高通透性是必要的。

2.2 Ang-1/Tie2抗血管內(nèi)皮細胞凋亡

Ang-1 作為血管發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子，與其受體Tie2 結(jié)合保護ECs 免受凋亡。研究表明Ang-1/Tie2抑制體外臍靜脈ECs 的凋亡是通過上調(diào)PI3K/Akt 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來達到穩(wěn)定血管狀態(tài)，發(fā)揮抗血管炎癥的作用[19]。Akt 失活將會逆轉(zhuǎn)Ang-1 誘導(dǎo)的ECs 抗凋亡作用，因此Ang-1 誘導(dǎo)的PI3k激酶激活和Akt 磷酸化可能是Ang-1 抗ECs 凋亡作用的關(guān)鍵步驟。PI3K/Akt 信號通路是重要的細胞存活機制，通過激活其下游通路使Akt 磷酸化為p-Akt 以此調(diào)控其下游靶蛋白胱天蛋白酶-3（Caspase-3）、B 細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）與Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）等，從而調(diào)節(jié)ECs 的凋亡、增殖、遷移作用[20]。

2.3 Ang-2/Tie2增強內(nèi)皮細胞促炎基因的表達

Ang-2 具有較強的血管生成作用，對內(nèi)皮細胞具有高度特異性，是血管生成的關(guān)鍵角色，通過控制ECs 對炎性細胞因子的反應(yīng)，調(diào)節(jié)炎性細胞因子從滾動到牢固黏附的轉(zhuǎn)變。Ang-2 缺乏并不影響白細胞黏附，而是與白細胞遷移有關(guān)[21]。Ang-2 缺陷小鼠不能誘導(dǎo)快速炎癥反應(yīng)，也不能誘導(dǎo)黏附分子表達，而是增強了TNF-α 對炎癥基因轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)作用。當ECs 暴露于炎性細胞因子時，Weibel Palade 小體釋放預(yù)先形成的Ang-2 蛋白競爭性地阻斷 Ang-1/Tie2 的效應(yīng)[22]，Tie2 信號的下降使FoxO1 重新定位到細胞核并轉(zhuǎn)錄Ang-2，發(fā)炎的ECs 合成更多的Ang-2 蛋白，進一步促進Tie2 抑制，同時FoxO1 轉(zhuǎn)錄激活導(dǎo)致緊密連接蛋白claudin-5表達降低，連接穩(wěn)定性降低。除Tie2 外，VE 鈣粘蛋白也可調(diào)節(jié)PI3K/Akt 活性和FoxO1 的下游效應(yīng)調(diào)節(jié)Ang-2 表達。

研究表明在小鼠心肌梗死急性期模型中，內(nèi)皮源性Ang-2 拮抗Ang-1/Tie2 信號，這與血管滲漏、周細胞分離、黏附分子表達增加，梗死邊緣區(qū)域中性粒細胞浸潤密切相關(guān)；在心肌梗死后的慢性重塑階段，ECs 和巨噬細胞衍生的Ang-2 通過整合素α5β1 信號持續(xù)促進異常血管重塑和促炎性巨噬細胞極化，加重心臟炎癥和缺氧[23]。

3 總結(jié)與展望

化療性靜脈炎主要是由于刺激性藥物對ECs的刺激而引起血管壁炎癥，產(chǎn)生ECs 破壞，血管擴張瘀血、間質(zhì)水腫、炎細胞浸潤、表皮角化等一系列癥狀。當ECs 暴露于炎性細胞因子時，Ang-2 的反應(yīng)是削弱細胞間的連接，導(dǎo)致ECs 激活，促進血管活化、血管炎癥、微血管滲漏。有研究表明在膿毒癥小鼠模型中使用抗Ang-2 抗體時，可以增強內(nèi)皮糖萼、減少細胞因子、防止血管滲漏、減輕器官損傷使得存活率提高[24]。相反Ang-1 作為抗炎劑發(fā)揮血管封閉作用，促進內(nèi)皮細胞存活、血管生長和穩(wěn)定，抑制炎癥發(fā)生發(fā)展。有研究表明用Ang-1預(yù)處理新生小鼠可以減弱膿毒癥誘導(dǎo)的肺部炎癥，減少炎癥因子和黏附分子表達、降低毛細血管通透性，通過保護內(nèi)皮屏障功能改善器官功能障礙、延長生存時間[25]。由此可知Ang-1/2 與Tie2 協(xié)同維持ECs 穩(wěn)態(tài)，所以提出假說Ang-1/Ang-2 的失調(diào)是化療性靜脈炎的基礎(chǔ)，靜脈內(nèi)膜受藥物刺激快速釋放Ang-2，其拮抗Ang-1 與Tie2 結(jié)合阻斷生理性Ang-1/Tie2 軸介導(dǎo)的下游級聯(lián)反應(yīng)影響ECs 黏附分子、細胞間緊密連接蛋白的表達及血管活性因子的合成與分泌，誘導(dǎo)ECs 功能障礙發(fā)生紅腫熱痛。由此推斷化療性靜脈炎與Ang/Tie2 信號傳導(dǎo)的關(guān)系具有潛在的研究價值，可以為臨床用藥提供理論基礎(chǔ)。