單克隆抗體類生物制品關(guān)鍵質(zhì)量屬性

景榮先 曾 媛 張國(guó)林

1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院 蘇州市立醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇蘇州 215002；

2.輝瑞 （中國(guó)）研究開(kāi)發(fā)有限公司中國(guó)藥物研發(fā)部臨床藥理部，上海 201203；

3.蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，江蘇蘇州 215104

單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）已成為抗腫瘤治療領(lǐng)域發(fā)展最為迅猛的生物藥類型[1-2]。目前已批準(zhǔn)上市的治療性mAb 類藥物有70 余種，結(jié)構(gòu)多為兩條重鏈和兩條輕鏈經(jīng)二硫鍵和非共價(jià)鍵聯(lián)合形成的免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）大分子。mAb 類藥物抗原表位、理化性質(zhì)和生物活性均一性程度較高，能特異性與靶標(biāo)分子結(jié)合，免疫原性低，患者耐受性好。但由于其分子量大、立體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在生產(chǎn)、純化、貯存和運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中易產(chǎn)生變異體，影響藥物的安全性、有效性、穩(wěn)定性和生物學(xué)活性，甚至產(chǎn)生免疫原性導(dǎo)致嚴(yán)重后果[3-4]。

程序性死亡受體-1（programmed cell death protein 1，PD-1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等都是mAb 藥物的靶點(diǎn)[5-6]。腫瘤細(xì)胞高表達(dá)細(xì)胞程序性死亡-配體1/2（programmed cell death ligand 1/2，PD-L1/L2），抑制T 細(xì)胞功能，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞無(wú)法被殺滅，而PD-1 mAb 藥物可以阻斷這一通路，恢復(fù)T 細(xì)胞功能，使免疫細(xì)胞繼續(xù)殺傷腫瘤細(xì)胞。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）參與多種惡性腫瘤的發(fā)生和細(xì)胞遷移、凋亡過(guò)程，是腫瘤治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一。隨著臨床需求的增加和抗VEGF mAb 原研藥（安維?。＠狡?，國(guó)內(nèi)相關(guān)生物類似藥貝伐珠單抗的研發(fā)如火如荼，并已有9 個(gè)品種獲批。目標(biāo)產(chǎn)品質(zhì)量概況（quality target of product profile，QTPP）是產(chǎn)品質(zhì)量屬性的前瞻性總結(jié)和預(yù)期目標(biāo)，是與產(chǎn)品質(zhì)量、安全和有效性相關(guān)的質(zhì)量屬性。質(zhì)量屬性可分作關(guān)鍵的和非關(guān)鍵的：質(zhì)量屬性是否作為關(guān)鍵質(zhì)量屬性（critical quality attributes，CQAs）主要通過(guò)評(píng)價(jià)其超出可接受范圍時(shí)對(duì)產(chǎn)品安全性和有效性的影響程度[7-8]。

研究mAb 類生物制品CQAs、分析其雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的影響因素對(duì)產(chǎn)品治療控制和臨床用藥安全具有重要的價(jià)值。

1 單抗類藥物的CQAs

CQAs 是mAb 類藥物符合預(yù)期用途的關(guān)鍵屬性，通常根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)及QTPP 方面切入分析。mAb 的CQAs 主要包括等電點(diǎn)、單體、大小變異體、電荷變異體、N-糖基化修飾、唾液酸含量、生物學(xué)活性等，是影響藥品安全性和有效性的重要指標(biāo)。CQAs 與產(chǎn)品的高級(jí)結(jié)構(gòu)、生物活性及免疫原性等均密切相關(guān)。單體是PD-1 mAb 藥物的作用基礎(chǔ)，分子大小變異體是最常見(jiàn)的變異體類型，也是影響抗體穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。分子大小變異體影響抗體的活性和效價(jià)，使蛋白單體濃度降低，增加藥物的免疫原性。鑒定分子大小變異體的種類，分析其形成的機(jī)制和對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響并采取適當(dāng)控制措施是單抗類產(chǎn)品整個(gè)生命周期中都需要關(guān)注的問(wèn)題。分子大小變異體包括高分子量變異體（high molecular weight，HMW）和低分子量變異體（low molecular weight，LMW）。前者主要是mAb 藥物發(fā)生聚合形成二聚體或多聚體形成的，后者是由于mAb 藥物發(fā)生降解或分子發(fā)生斷裂形成低分子量蛋白造成的。分子大小變異體隨時(shí)間變化率可提供聚體的功能特征，且對(duì)應(yīng)著mAb 藥物產(chǎn)品的有效期。

1.1 電荷異質(zhì)性

電荷異質(zhì)性是mAb 藥物變異體的另一類型[9]。細(xì)胞培養(yǎng)條件變化、純化工藝及產(chǎn)品儲(chǔ)存條件變化等均會(huì)引起mAb 藥物電荷異質(zhì)性。mAb 藥物電荷異質(zhì)性會(huì)影響單抗的穩(wěn)定性，對(duì)其功能和組織分布及藥代動(dòng)力學(xué)均有明顯的影響。電荷變異體分析是mAb 藥物質(zhì)量控制的重要參數(shù)。酸性變異體與堿性變異體是mAb 藥物電荷變異體的主要類型，其中門冬酰胺脫酰胺和糖化修飾是酸性變異體的常見(jiàn)來(lái)源。

1.2 等電點(diǎn)（isoelectric point，pI）

等電點(diǎn)是反映mAb 電荷異質(zhì)性的關(guān)鍵指標(biāo)，可體現(xiàn)藥物電荷與空間構(gòu)象的均一性[10]。采用等點(diǎn)聚焦電泳（iso-electric focusing，IEF）分析時(shí)，酸性變異體的表觀pI 小于抗體主峰，而采用陽(yáng)離子交換色譜（cation exchange chromatography，CEX）分析時(shí)，酸性變異體的保留時(shí)間小于抗體主峰。mAb的C 端發(fā)生Lys 修飾及N 端谷氨酰胺的不完全環(huán)化是堿性變異體的主要來(lái)源。門冬氨酸異構(gòu)化及甲硫氨酸氧化也是堿性變異體的重要原因。采用IEF 分析時(shí)，堿性變異體的表觀pI 大于抗體主峰，而采用CEX 分析時(shí)，堿性變異體的保留時(shí)間大于抗體主峰。mAb 藥物電荷異質(zhì)性分析可以作為批間一致性評(píng)價(jià)的參考指標(biāo)，也可通過(guò)分析電荷的分布情況監(jiān)測(cè)整個(gè)生產(chǎn)工藝流程，推動(dòng)產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的優(yōu)化。mAb 藥物電荷變異體的檢測(cè)技術(shù)主要包括離子交換色譜（ion exchange high performance liquid chromatography，IEX-HPLC）、毛細(xì)管等電聚焦電泳（capillary iso-electric focusing， cIEF）和全柱成像毛細(xì)管等電聚焦電泳（imaging capillary electrofocusing electrophoresis，iCIEF）等[11-15]。

mAb 藥物變異體的產(chǎn)生是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，分析引起變異體的因素并采取應(yīng)對(duì)措施可以有效降低變異體的發(fā)生率。分析變異體隨時(shí)間變化的趨勢(shì)并采取措施對(duì)產(chǎn)品實(shí)施質(zhì)量控制比檢測(cè)終產(chǎn)品變異體更為重要，而揭示單抗類產(chǎn)品容易發(fā)生聚集的機(jī)制，并從產(chǎn)品設(shè)計(jì)和工藝改進(jìn)以降低變異體的發(fā)生比分析變異體的時(shí)間變化趨勢(shì)更重要。

1.3 糖基化

大部分mAb 是由中華倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（Chinese hamster ovary cells，CHO）表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的。mAb生產(chǎn)過(guò)程中易受到各種內(nèi)外部因素影響而發(fā)生翻譯后修飾（post-translational modification，PTM）而產(chǎn)生變異體影響mAb 的穩(wěn)定型和與目標(biāo)抗原的結(jié)合活性，并可能產(chǎn)生免疫原性。糖基化（glycosylation）和糖化（glacation）修飾是最常見(jiàn)的PTM 類型[16-17]。糖化為非酶促化學(xué)修飾反應(yīng)，主要是還原糖（葡萄糖、半乳糖等）的醛基與生物大分子（核酸、蛋白質(zhì)等）的伯氨基發(fā)生縮合反應(yīng)形成Schiff 堿，進(jìn)一步發(fā)生Amadori 重排并形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵的狀態(tài)。在抗體藥物中，糖化主要發(fā)生在重鏈互補(bǔ)決定區(qū)3 的Lys 上。糖化是重組抗體藥物異質(zhì)性的重要原因，對(duì)該類藥物的結(jié)構(gòu)、理化特性和穩(wěn)定型及安全性造成不利影響。糖基化為酶促化學(xué)修飾反應(yīng)，即在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，非糖生物大分子與糖共價(jià)結(jié)合的反應(yīng)[18]。N-糖基化和O-糖基化是最常見(jiàn)的糖基化連接方式。mAb 的翻譯后糖基化修飾會(huì)影響藥物的穩(wěn)定型、溶解性和空間結(jié)構(gòu)及生物活性等，也會(huì)對(duì)該類藥物在體內(nèi)的代謝和分布造成一定的影響。目前，F(xiàn)DA 和EMEA 及中國(guó)藥典等均要求對(duì)mAb 藥物的糖化水平進(jìn)行分析。mAb 的糖基化是其CQAs 之一。N-糖基化和O-糖基化是PD-1 mAb 藥物的主要糖基化修飾。N-糖基化即寡糖連接到門冬酰胺上，其經(jīng)典的保守序列為Asn-AASer/Thr-AA。PD-1mAb 藥物上N-糖基化的發(fā)生與宿主細(xì)胞、培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件有關(guān)。mAb 藥物糖化的重鏈和輕鏈在還原的十二烷基硫酸鈉-毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis-sodiumdodecyl sulfate，CE-SDS）表現(xiàn)為峰圖展寬，且輕鏈在紫外光或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)可出現(xiàn)肩峰，可用于PD-1 mAb藥物的糖型分析。采用常規(guī)紫外檢測(cè)器或熒光檢測(cè)器的親水作用色譜和毛細(xì)管電泳等是基于標(biāo)記的糖型分析手段[19-20]。O-糖基化是在糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下，在Ser 或Thr 上連接糖鏈的過(guò)程。O-糖基化糖鏈結(jié)構(gòu)復(fù)雜，無(wú)典型的核心結(jié)構(gòu)和通用的內(nèi)切酶，分析難度較大。O-糖基化的分析策略通常是采用β 消除釋放O-糖鏈，對(duì)釋放的糖鏈進(jìn)行熒光標(biāo)記后進(jìn)行色譜分離和熒光檢測(cè)器檢測(cè)。

1.4 生物學(xué)活性

生物學(xué)活性是單抗類藥物篩選、表征和放行的重要屬性，也是穩(wěn)定性研究的重要指標(biāo)。雖然儀器分析技術(shù)的進(jìn)步為單抗分子結(jié)構(gòu)的確定提供了新的思路和手段，但其高級(jí)結(jié)構(gòu)及其翻譯后修飾的研究仍存在諸多局限性。生物學(xué)活性分析是分析單抗類生物制品高級(jí)結(jié)構(gòu)研究的重要措施。目前，單抗類藥物生物學(xué)活性分析的方法主要有細(xì)胞毒性法、細(xì)胞增殖抑制法、補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性法、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性法和報(bào)告基因法等[21-26]。生物學(xué)活性是反映生物學(xué)性質(zhì)的重要方法，是體現(xiàn)單抗類藥物特定生物學(xué)效應(yīng)的量值，是藥物高級(jí)結(jié)構(gòu)確證的補(bǔ)充，是單抗類藥物的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一。

2 小結(jié)

mAb 已成為抗腫瘤治療領(lǐng)域發(fā)展最為迅猛的生物藥物類型。但由于其分子量大、立體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，在生產(chǎn)、純化、貯存和運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中易產(chǎn)生變異體，影響藥物的安全性、有效性、穩(wěn)定性和生物學(xué)活性，甚至產(chǎn)生免疫原性造成嚴(yán)重后果。研究mAb 類生物制品CQAs、分析其雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的影響因素對(duì)產(chǎn)品治療控制和臨床用藥安全具有重要的價(jià)值。

mAb 的CQAs 主要包括等電點(diǎn)、單體、大小變異體、電荷變異體、N-糖基化修飾、唾液酸含量、生物學(xué)活性等，是影響藥品安全性和有效性的重要指標(biāo)，與產(chǎn)品安全性和有效性均密切相關(guān)。