基于新孢鐮刀菌的花生果腐病抗性評(píng)價(jià)方法研究

李步陽(yáng) 焦 鎮(zhèn) 崔順立 孫偉明

（1.河北科技師范學(xué)院農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院/河北省作物逆境生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河北 秦皇島 066000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 河北 保定 071001；3.河北科技師范學(xué)院海洋資源與環(huán)境學(xué)院 河北 秦皇島 066000）

花生（Arachis hypoaea L.）是世界上廣泛種植的油料作物和經(jīng)濟(jì)作物。 截至2021 年末，我國(guó)花生種植面積達(dá)到473 萬(wàn)hm2，位居世界第2 位[1]，花生油產(chǎn)量為324.8 萬(wàn)t，約占世界總產(chǎn)量的1/2[2]?；ㄉa(chǎn)業(yè)在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展中具有重要地位[3-4]。 花生果腐病是一種世界性的嚴(yán)重病害[5-6]，最早發(fā)現(xiàn)在美國(guó)，之后在各國(guó)花生種植區(qū)普遍發(fā)生，北美[7]、澳洲[8]、亞洲[9]、非洲[10]等地均有花生果腐病的發(fā)生?；ㄉ≡谖覈?guó)山東[11]、河北[12-13]、吉林[14]、河南[15]等地發(fā)生嚴(yán)重，尤其是重茬地塊有逐年加重的趨勢(shì)[16]。

據(jù)國(guó)外研究報(bào)道，不同地域花生莢果腐爛的病原菌存在差異[17]?？梢鸹ㄉv果腐爛的病原菌主要包括腐霉菌（Pythium sp.）[18]、立枯絲核菌（Rhizoctonia sp.）[19]、花生黑腐病菌（Cylindrocladium paraasiticum）[20]、鐮刀菌（Fusarium sp.）[19]、白 絹 病 菌（Sclerotium rolfsii）[22]、小菌核菌 （Sclerotium minor、Chalara elegans）[21-22]和侵脈新赤殼菌 （N.vasinfecta）（現(xiàn)用名F.neocosmosporiellum）[23]。 國(guó)內(nèi)已報(bào)道的花生果腐病病原菌有新孢鐮刀菌 （F.neocosmosporiellum）[23-29]、 尖孢鐮刀菌（F.oxysporum）[30]、群結(jié)腐霉菌（P.myriotylum Drechsl）[31]和立枯絲核菌（R.solani）[32]。這些研究結(jié)果顯示，花生果腐病病原菌的種類(lèi)存在地域差異， 即使同一省份不同年份鑒定出的病原菌種類(lèi)也不盡相同。

利用病原菌接種離體植物組織進(jìn)行初步抗病性評(píng)價(jià)或鑒定是科研工作者經(jīng)常采用的方法。 目前，研究人員利用群結(jié)腐霉菌、 麗赤殼菌和尖孢鐮刀菌等花生果腐病病原菌進(jìn)行室內(nèi)離體或活體盆栽接種，從而建立了室內(nèi)（盆栽）花生種質(zhì)資源果腐病抗性鑒定的方法。 然而，以新孢鐮刀菌為花生果腐病病原菌進(jìn)行室內(nèi)（盆栽）抗性評(píng)價(jià)的方法還未見(jiàn)報(bào)道。 本研究利用離體花生果接種新孢鐮刀菌， 以果殼發(fā)病面積為分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)獲得莢果病情指數(shù)， 通過(guò)聚類(lèi)分析獲得了基于離體花生莢果室內(nèi)接種病原菌的抗性評(píng)價(jià)方法， 為離體花生莢果接種病原菌抗性評(píng)價(jià)方法的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

花生種質(zhì)資源由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所、 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)及河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所提供。 新孢鐮刀菌JNH1-2、HH-1-2 和XL-3 為本實(shí)驗(yàn)室保藏的花生果腐病病原菌菌株， 分別分離自邯鄲市大名縣、 秦皇島市昌黎縣及石家莊新樂(lè)市的花生果腐病發(fā)病莢果。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2022 年在河北科技師范學(xué)院昌黎校區(qū)微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。 將病原菌JNH1-2、HH-1-2 和XL-3分別接種于PDA 平板，在28℃條件下培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)皿加入5 mL 含0.1%吐溫的無(wú)菌水， 制成105個(gè)/mL分生孢子懸浮液，備用。

將新鮮健康的R5 時(shí)期離體花生莢果進(jìn)行表面消毒：用自來(lái)水沖洗干凈，75%乙醇消毒30 s，無(wú)菌水沖洗1 次，滅菌吸水紙吸干表面水分；5%次氯酸鈉消毒3 min，無(wú)菌水沖洗4 次，吸干表面水分。 表面消毒的2 個(gè)花生品種 （高感品種PI162857 和抗病品種PI196622）[33]離體莢果分別浸沾接種病原菌JNH1-2、HH-1-2 和XL-3 分生孢子懸浮液， 每個(gè)處理30 個(gè)莢果， 以無(wú)菌水為空白對(duì)照。 接種后的莢果置于直徑為180 mm 培養(yǎng)皿中在28℃黑暗保濕培養(yǎng)， 10 d后調(diào)查發(fā)病情況， 依據(jù)致病力情況確定病原菌代表性菌株。

利用篩選出來(lái)的病原菌代表性菌株按照上述方法對(duì)32 份花生種質(zhì)資源進(jìn)行離體花生莢果病原菌接種試驗(yàn)。

1.3 病害分級(jí)方法

病原菌離體接種試驗(yàn)采用的病害分級(jí)方法：0 級(jí)，無(wú)腐爛癥狀；1 級(jí)，0～10%腐爛癥狀；2 級(jí)，10%～20%腐爛癥狀；3 級(jí)，20%～30%腐爛癥狀；4 級(jí)，30%～40%腐爛癥狀；5 級(jí)，40%～50%腐爛癥狀；6 級(jí)，50%～100%腐爛癥狀。 按照莢果果皮腐爛面積占比調(diào)查莢果發(fā)病情況，計(jì)算莢果病情指數(shù)。

病情指數(shù)＝∑（各級(jí)發(fā)病莢果數(shù)×各級(jí)代表值）/（總果數(shù)×最高級(jí)值）×100

發(fā)病率＝發(fā)病株/總株數(shù)×100%

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft ExceL 2017 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理， 用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的處理與分析。利用歐式距離法（euclidean distance）計(jì)算品種間距離，采用最遠(yuǎn)鄰元素法進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 新孢鐮刀菌的致病力測(cè)定

3 株病原菌對(duì)2 個(gè)花生品種表現(xiàn)出不同的致病力， 結(jié)果表明， 高感品種PI162857 發(fā)病率均大于80%， 病情指數(shù)為67.22～69.44； 抗病品種PI196622發(fā)病率為40.00%～53.33%，病情指數(shù)為30.56～36.67。其中，病原菌XL-3 接種離體花生莢果的發(fā)病率和病情指數(shù)均為最高，致病力最強(qiáng)，因此選擇新孢鐮刀菌XL-3 為病原菌代表性菌株開(kāi)展基于室內(nèi)離體花生莢果的抗性評(píng)價(jià)試驗(yàn)（表1）。

表1 不同地區(qū)接種病原菌后花生莢果發(fā)病情況

2.2 基于室內(nèi)離體花生莢果的抗性評(píng)價(jià)方法建立

32 份種質(zhì)資源的離體花生莢果接種新孢鐮刀菌10 d 后進(jìn)行病害分級(jí)，計(jì)算莢果病情指數(shù)（FDI），結(jié)果顯示，供試材料的FDI 變化范圍為10.56～69.44，其中湛紅2 號(hào)的FDI 最低，為10.56，中花24 的FDI 最高，為69.44。 以FDI 為聚類(lèi)分析的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，當(dāng)閾值為5.5 時(shí)，可將供試花生種質(zhì)資源聚為6 類(lèi)（圖1）。第Ⅰ類(lèi)有4 份資源， 病情指數(shù)為65.00～69.44， 屬于HS 類(lèi)型； 第II 類(lèi)有5 份資源， 病情指數(shù)為40.67～44.44，屬于MS 類(lèi)型；第Ⅲ類(lèi)有4 份資源，病情指數(shù)為51.33～55.56，屬于S 類(lèi)型，第IV 類(lèi)有8 份資源，病情指數(shù)為28.00～36.67，屬于MR 果腐病的資源類(lèi)型；第Ⅴ類(lèi)有5 份資源， 病情指數(shù)為10.56～16.67， 屬于HR 類(lèi)型； 第Ⅵ類(lèi)有6 份資源， 病情指數(shù)為18.67～25.33，屬于R 類(lèi)型。 為了便于分析統(tǒng)計(jì)，基于室內(nèi)離體花生莢果的花生果腐病抗性評(píng)價(jià)方法為：HR，0＜FDI≤15；R，15＜FDI≤25；MR，25＜FDI≤40；MS，40＜FDI≤50；S，50＜FDI≤65；HS，F(xiàn)DI＞65（表2）。

圖1 基于FDI 不同花生種質(zhì)資源對(duì)果腐病抗性聚類(lèi)分析譜系

表2 室內(nèi)32 份花生種質(zhì)資源抗性鑒定結(jié)果

3 討論與結(jié)論

花生果腐病是一種嚴(yán)重的土傳病害， 并且有逐年加重趨勢(shì)。 近年來(lái)引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，但目前僅主要停留在對(duì)花生果腐病病原菌及其致病性的研究上， 關(guān)于花生抗果腐病室內(nèi)抗性評(píng)價(jià)方法的建立研究較少。

本研究首先對(duì)新孢鐮刀菌的3 種病原菌菌株進(jìn)行致病性鑒定， 以篩選出致病性最強(qiáng)的生理小種，并用其制備的孢子懸浮液侵染離體花生莢果， 然后進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)分析， 最終建立了基于室內(nèi)離體花生莢果的抗性評(píng)價(jià)方法。于靜等[34]采用盆栽花生活體接種群結(jié)腐霉菌（P.myriotylum）的試驗(yàn)方法，在幼苗期、 開(kāi)花下針期、 結(jié)莢期和飽果成熟期進(jìn)行。 此方法操作較為煩瑣， 試驗(yàn)周期較長(zhǎng)， 但可明顯提高花生果腐病接種后的發(fā)病率。陳明娜等[35]利用麗赤殼菌（Calonectria sp.）在花生苗期、盛花期、漿果期采用掩埋噴灌的接種方法對(duì)17 個(gè)花生品種的爛果率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并分析， 建立了一種花生種質(zhì)資源果腐病抗性鑒定的方法。 該方法能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)花生種質(zhì)資源進(jìn)行果腐病抗性的鑒定，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性好，對(duì)抗果腐病花生品種的培育及抗病機(jī)制的研究具有重要意義。 王冕等[36]利用一種尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum） 接種花生幼苗離體子葉， 并進(jìn)行劃傷處理，后期調(diào)查記錄各品種的發(fā)病癥狀、病斑大小及發(fā)病率， 并由此建立了快速篩選花生抗果腐病種質(zhì)資源的方法，篩選花生抗果腐病種質(zhì)資源的方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果直觀性強(qiáng)，易于分級(jí)鑒定，能夠快速、高效率地鑒定大量種質(zhì)資源， 大大縮短了種質(zhì)鑒定的篩選周期，快速為花生抗病育種提供優(yōu)質(zhì)資源。 于靜等[37]采用自然病圃鑒定法， 篩選出豫航花7 號(hào)為高抗花生果腐病的品種， 中花24 為高感花生果腐病的品種，這與本研究結(jié)果一致， 驗(yàn)證了本試驗(yàn)中基于室內(nèi)離體花生莢果抗性評(píng)價(jià)方法的科學(xué)性與可行性。

本試驗(yàn)采用基于花生果殼腐爛面積的病害分級(jí)方法， 將供試花生種質(zhì)資源的果殼腐爛面積分為0 級(jí)，無(wú)腐爛癥狀；1 級(jí)，0～10%腐爛癥狀；2 級(jí)，10%～20%腐爛癥狀；3 級(jí)，20%～30%腐爛癥狀；4 級(jí)，30%～40%腐爛癥狀；5 級(jí)，40%～50%腐爛癥狀；6 級(jí)，50%～100%腐爛癥狀。 因在進(jìn)行室內(nèi)離體侵染時(shí)極少存在爛果仁的情況，一般病害表現(xiàn)都出現(xiàn)在莢果果殼上，故將病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)劃分為7 個(gè)等級(jí)， 可使試驗(yàn)結(jié)果更為客觀、準(zhǔn)確。