旱黃瓜莖基腐病菌鑒定及其生物學(xué)特性

金 鴿,閔 康,陳怡銘,曹 蜢,張宇萍,韓亞梅,高玉峰,賀字典,*

(河北科技師范學(xué)院 1 農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院 河北省作物逆境生物學(xué)重點實驗室,2 學(xué)報編輯部,河北 秦皇島,066004)

近幾年,黃瓜莖基腐病在全國各黃瓜產(chǎn)區(qū)危害呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢[1],田間發(fā)病率一般為15%～20%,重者高達50%以上,甚至絕收。上海地區(qū)黃瓜莖基腐病的病原菌為胡蘿卜軟腐果膠桿菌巴西亞種(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.brasiliense)[2]。山東聊城黃瓜莖基腐病病菌為瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)、腐皮鐮孢菌(Fusariumsolani)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)[3]。目前,旱黃瓜莖基腐病的病原菌并未見到報道。旱黃瓜俗名秋黃瓜、白黃瓜,與常見的密刺黃瓜(俗名黑黃瓜)外觀上有明顯區(qū)別。近年來,隨著國家蔬菜產(chǎn)業(yè)體系和河北省蔬菜產(chǎn)業(yè)體系的推廣,旱黃瓜種植面積逐漸擴大,已在山東、河北、東北三省等地大面積種植。但是,自2018年開始,旱黃瓜莖基部出現(xiàn)黃色水漬狀壞死,病斑逐漸擴大繞莖一周后莖部開始縱向開裂,檢查病株根系未出現(xiàn)腐爛,維管束也未變褐。為了明確旱黃瓜莖基腐病的病原菌種類及其生物學(xué)特性,筆者擬采用組織分離法和ITS序列對旱黃瓜莖基腐病的病原菌進行分離與鑒定,并對病原菌的生物學(xué)特性進行研究,以期為旱黃瓜莖基腐病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試病樣 2018～2022年從河北省昌黎縣馬坊營旱黃瓜基地發(fā)病的大棚內(nèi)采集病樣27份。

1.1.2供試品種 田嬌8號旱黃瓜和黃籽南瓜,購自河北省昌黎縣當?shù)胤N子門市部。

1.1.3Richard培養(yǎng)基 KNO310 g,KH2PO45 g,MgSO42.5 g,FeCl30.02 g,蔗糖50 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1病原菌的分離 采用組織分離法對病原菌進行分離。在病健交界處切取5 mm×5mm的病組織,置于體積分數(shù)75%酒精中消毒45 s,然后于質(zhì)量濃度為10 g/L的NaClO溶液中消毒1 min,用滅菌水漂洗3次后將病組織放在滅菌濾紙上,完全吸干水分后置于PDA平板上,每皿放置4塊,于25 ℃黑暗恒溫培養(yǎng),待病組織上長出菌絲后,利用菌絲尖端純化方法,多次純化直至菌落形態(tài)一致。4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2致病性測定 采用針刺法測定病原菌對黃瓜和南瓜的致病性。將直徑7 mm的病原菌菌餅置于PDA平板上,待長滿平板后,分次加入5 mL滅菌水,用滅菌載玻片刮取菌絲于離心管中制成孢子懸浮液。用血球計數(shù)板調(diào)整分生孢子數(shù)量達到107個·mL-1。待黃瓜與南瓜幼苗長到兩葉一心時,用昆蟲針在莖基部由下至上針刺5個孔,兩孔間距0.5 cm。用無菌毛筆蘸取孢子懸浮液涂抹在針刺部位,黃瓜和南瓜各接種10棵。以涂抹清水的為對照。4次重復(fù)。接種后用濕脫脂棉包裹在傷口部位保濕,并用白色地膜蓋住育苗盤[4]。將育苗盤置于25 ℃棚膜搭建的保濕室內(nèi)培養(yǎng),每天用無菌水浸濕脫脂棉。48 h后撤掉地膜,96 h后移除脫脂棉。7 d后觀察幼苗發(fā)病情況,記錄病變形態(tài),并對發(fā)病部位分離,鑒定病菌形態(tài)與原病菌是否一致。

1.2.3病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 用直徑7 mm的打孔器從病原菌菌落邊緣打菌餅,接種到PDA平板上。25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)4 d時測量菌落直徑,7 d時觀察病原菌在PDA培養(yǎng)基上的氣生菌絲形狀、色素產(chǎn)生情況等菌落特征,并測量大、小型分生孢子大小及厚垣孢子的形態(tài)和產(chǎn)生方式等特征,參照Booth的方法對病原菌的種進行初步鑒定[5,6]。

1.2.4病原菌的分子生物學(xué)鑒定 將病原菌菌株在PDA平板上活化后,每個菌株培養(yǎng)20皿,培養(yǎng)至長滿培養(yǎng)皿,刮取菌絲冷凍保存,采用CTAB法提取基因組DNA。分別采用ITS1(5′-TCCGTAGGTG AACCTGCGG3′)/ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和NL1(5′-GCATATCA ATAA GCGGAGGAAAAG-3′)/LR3(5′-GGTCCGTGTTTCAAGAC-3′)對該菌株的ITS區(qū)進行PCR擴增[7]。PCR反應(yīng)程序為:94 ℃預(yù)變性2 min,94 ℃變性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,35個循環(huán);72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物送北京生工生物工程公司測序。所得序列用NCBI中的BLAST程序搜索同源序列,下載相似性大于99%及近緣屬序列,用MEGA-X軟件進行多序列比對,以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5pH對病原菌生長的影響 用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl將PDA培養(yǎng)基的pH調(diào)為4,5,6,7,8,9,10,11和12共9個梯度,接種菌餅后置于培養(yǎng)箱中25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d,采用十字交叉法測量菌落直徑。取培養(yǎng)7 d的病原菌,用打孔器在菌落邊緣打取直徑為7 mm的菌餅。將菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng),第5天采用十字交叉法測量菌落直徑,第7天用血球計數(shù)板測產(chǎn)孢量,3次重復(fù)。

1.2.6溫度對病原菌生長的影響 取培養(yǎng)7 d的病原菌,用打孔器在菌落邊緣打取直徑為7 mm的菌餅。將菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上,分別置于溫度為15,20,25,30,35,40,45 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),第5天采用十字交叉法測量菌落直徑,第7天用血球計數(shù)板測產(chǎn)孢量,3次重復(fù)。

1.2.7碳源對病原菌生長的影響 用Richard培養(yǎng)基作基礎(chǔ)培養(yǎng)基,分別以等量的果糖、葡萄糖、麥芽糖、木糖、淀粉代替蔗糖作為碳源。將直徑為7 mm的菌餅接種到不同碳源的培養(yǎng)基上,25 ℃培養(yǎng)。第5天用十字交叉法測量菌落直徑,第7天用血球計數(shù)板測產(chǎn)孢量,3次重復(fù)。

1.2.8氮源對病原菌生長的影響 以Richard培養(yǎng)基為基礎(chǔ),分別以NH4NO3,(NH4)2SO4,NaNO3,尿素和蛋白胨代替KNO3作為氮源。將直徑7 mm的菌餅接種到含不同氮源的培養(yǎng)基上,25 ℃培養(yǎng)。第5天用十字交叉法測量菌落直徑,第7天用血球計數(shù)板測產(chǎn)孢量,3次重復(fù)。

1.2.9菌絲致死溫度測定 將直徑7 mm的病原菌菌餅置于裝有10 mL無菌水的試管中,將試管分別置于40,50,60,70,80 ℃的恒溫水浴鍋中處理10 min后迅速冷卻,將菌餅取出后接種于PDA平板上,于28 ℃培養(yǎng)箱中進行恒溫培養(yǎng),3次重復(fù),4 d后測量菌落直徑,統(tǒng)計出致死溫度范圍。再次將溫度設(shè)置間隔5 ℃梯度,重復(fù)上述操作,最后設(shè)置間隔1 ℃溫度梯度最終確定病原菌的致死溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜莖腐病原菌的分離培養(yǎng)

采集黃瓜病株樣品進行分離培養(yǎng),共獲得鐮孢菌29株,青霉菌10株,鏈格孢8株。其中,菌株CL0307在PDA上25 ℃培養(yǎng)5 d的菌落直徑為7.5～8.2 cm,菌落羊絨狀,菌絲無色,產(chǎn)生紫紅色色素。顯微觀察有大型分生孢子和小型分生孢子,初步確定為鐮孢菌(圖1)。

注:A,菌落正面特征;B,菌落背面特征 圖1 菌株CL0307的菌落特征

2.2 病原菌的致病性

2.2.1田間發(fā)病癥狀 用南瓜嫁接的旱黃瓜田間發(fā)病后莖基部表皮變成黃色,似開水浸過,表皮逐漸變得粗糙,縱向開裂,隨著裂口加大,植株失水,萎蔫死亡(圖2)。

注:A,表皮呈黃色;B,表皮粗糙;C,縱向開裂圖2 黃瓜莖基腐病田間發(fā)病癥狀

2.2.2人工接種發(fā)病癥狀 其他菌株接種黃瓜和南瓜后均未發(fā)病。用菌株CL0307接種黃瓜后,在莖基部出現(xiàn)黃色水浸狀病斑,繞頸一周后,黃瓜倒伏,干枯,死亡,發(fā)病率為75%,死亡率60%(圖3A)。將該菌株接種到南瓜莖基部,病情發(fā)展比黃瓜緩慢,初期南瓜葉片葉尖和葉緣呈現(xiàn)黃色,莖基部逐漸變色,干枯,死亡,發(fā)病率為80%,死亡率20%(圖3B)。清水對照均未發(fā)病,因此確定CL0307為黃瓜莖基腐病的致病菌。

注:A,南瓜發(fā)病癥狀;B,黃瓜發(fā)病癥狀;C,黃瓜和南瓜清水對照圖3 人工接種后南瓜和黃瓜的發(fā)病癥狀

2.3 病原菌的鑒定

在PDA培養(yǎng)基上25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)4 d,白色菌落,菌絲層致密,菌落直徑為38～45 mm,后期培養(yǎng)基呈淡紫色。大型分生孢子數(shù)量少,細長,鐮刀型,向兩端漸尖,稍彎曲,足細胞有或無,具2～5個真隔膜,多數(shù)為3個,大小為22.5～40.0 μm × 2.5～4.0 μm。PDA上產(chǎn)生大量的小型分生孢子,在產(chǎn)孢細胞頂端串生或假頭生,大小為5.0～17.5 μm × 2.0～3.0 μm。未見到有厚垣孢子(圖4)。ITS序列比對結(jié)果顯示,菌株CL0307與Fusariumverticillioide(登錄號KF031434.1和LN482457.1)序列相似性為100%(圖5)。結(jié)合菌株形態(tài)及分子鑒定結(jié)果,黃瓜莖基腐病的病原菌確定為輪狀鐮孢菌(Fusariumverticillioide)。

注:A,菌落形態(tài);B,分生孢子座上大型分生孢子;C,小型分生孢子;D,鏈生小孢子;E,假頭生小孢子;F-～H,復(fù)瓶梗圖4 菌株CL0307的特征

圖5 擬輪枝鐮孢菌(Fusarium verticillioides)的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 病原菌的生物學(xué)特性

2.4.1pH對擬輪枝鐮孢菌生長的影響 擬輪枝鐮孢菌菌落直徑在pH為4.0和12.0時分別為4.58 cm和4.18 cm,顯著低于pH為5.0和6.0時的菌落直徑(表1)。擬輪枝鐮孢菌只在pH為5.0和6.0時產(chǎn)生大型分生孢子,數(shù)量分別為0.83×107個·mL-1和0.33×107個·mL-1。小型分生孢子數(shù)量以pH為5.0時最多,顯著高于其他pH的數(shù)量。

表1 pH對擬輪枝鐮孢菌生長的影響

2.4.2溫度對擬輪枝鐮孢菌生長的影響 擬輪枝鐮孢菌在15～30 ℃范圍內(nèi)隨著溫度升高,菌絲生長速度加快,菌落直徑逐漸增大;30 ℃菌落直徑為8.08 cm(表2);35 ℃以上菌絲生長開始受到抑制,35 ℃時菌落直徑僅2.08 cm;40 ℃菌絲停止生長。擬輪枝鐮孢菌的大型分生孢子生長最適溫度為25 ℃,數(shù)量達到1.25×106個·mL-1,其次是30 ℃,數(shù)量為1.08×106個·mL-1,二者差異顯著。小型分生孢子生長的適宜溫度為30 ℃,數(shù)量達到17.33×107個·mL-1,顯著高于其他溫度的小型分生孢子數(shù)量。

表2 溫度對擬輪枝鐮孢菌生長的影響

2.4.3碳源對擬輪枝鐮孢菌生長的影響 碳源為淀粉時菌落直徑為5.65 cm,顯著低于其他碳源培養(yǎng)基生長速度,所有碳源上擬輪枝鐮孢菌的菌落直徑差異均不顯著(表3)。擬輪枝鐮孢菌大型分生孢子和小型分生孢子的數(shù)量均以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基上最多,分別為10.00×106個·mL-1和70.83×107個·mL-1,均顯著高于其他碳源的分生孢子數(shù)量。

表3 碳源對擬輪枝鐮孢菌生長的影響

2.4.4氮源對擬輪枝鐮孢菌生長的影響 NH4NO4和(NH4)2SO4有利于擬輪枝鐮孢菌菌絲生長,菌落直徑分別為7.08 cm和6.62 cm,顯著高于其他氮源菌絲生長速度(表4)。NH4NO4均適合于擬輪枝鐮孢菌大型分生孢子和小型分生孢子生長,產(chǎn)孢量分別為16.67×106個·mL-1和11.67×107個·mL-1,顯著高于其他氮源的分生孢子數(shù)量。

表4 氮源對擬輪枝鐮孢菌生長的影響

2.4.5擬輪枝鐮孢菌的致死溫度 擬輪枝鐮孢菌菌絲在69 ℃水浴鍋中處理10 min后不再生長,因此確定擬輪枝鐮孢菌的致死溫度為69 ℃(表5)。

表5 擬輪枝鐮孢菌菌絲致死溫度

3 結(jié)論與討論

鐮孢菌是引起枯萎病、根腐病、莖腐病、頂腐病等根、莖、葉部病害的重要病原菌[8～16],造成作物、蔬菜、果樹、中藥材的產(chǎn)量下降和品質(zhì)降低,其中擬輪枝鐮孢菌(F.verticillioides)不僅是黃瓜莖基腐病的病原菌,也是甜瓜枯萎病[17]和番木瓜根腐莖腐病[18]的一種新的致病菌。擬輪枝鐮孢菌是由串珠鐮孢菌(Fusariummoniliforme)更名過來的,與藤倉鐮孢菌也有密切關(guān)系[19],串珠鐮孢菌侵染玉米莖稈后,隨著體外氣流傳播到玉米穗后引起穗腐病[20]。劉樹森等[21]報道,引起黃淮海夏玉米主產(chǎn)區(qū)玉米穗腐病的主要致病菌包括擬輪枝鐮孢菌(F.verticillioides)、禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)、層出鐮孢菌(Fusariumproliferatum)、木賊鐮孢菌(Fusariumequiseti)及藤倉鐮孢菌(Fusariumfujikuroi),其中擬輪枝鐮孢是主要致病菌。昌黎旱黃瓜莖腐病的病原菌與玉米莖腐病和穗腐病的病原菌相同,可能與該地區(qū)普遍采用玉米地土壤育苗有關(guān)。

生物學(xué)特性表明擬輪枝鐮孢菌絲最適生長溫度為30 ℃,最適pH為6.0,最適碳源為葡萄糖,最適氮源為NH4NO3,致死溫度為69 ℃,這與郭成等[22]報道基本一致。因鐮孢菌形態(tài)變化較大,且土壤環(huán)境因素復(fù)雜,連作也會造成病原菌菌源積累[23]。因此,關(guān)注擬輪枝鐮孢與其他種類鐮孢菌的種群動態(tài)變化是防治該病害的關(guān)鍵因素之一,還需要進一步研究。